一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法
技术领域
本发明属于藻类培养和应用技术领域，尤其涉及一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法。
背景技术
硅藻是海洋生态系统中最重要的初级生产者，是单细胞光合自养真核生物，隶属于硅藻门，其独特之处在于具有硅质的细胞壁，能有效的防御各种敌害生物的摄食和入侵。硅藻有250个属，10万个种，是藻类中种类最多的。在自然环境条件下，春季和秋季时，营养充足、光照强度和日照适宜硅藻的生长，硅藻繁殖旺盛。硅藻含有很多生物活性物质，如EPA、AA、氨基酸、软骨藻酸等。硅藻的应用十分广泛，在水产养殖业上，主要作为水产动物的饵料。
硅藻营养丰富，含有大量的矿物质元素，在渔业和饲料工业中有广泛的应用。同时，硅藻能够产生大量的油脂成分，许多硅藻种类含有大量的多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸有重要的生理功能，有助于降低心脑血管疾病。
因此，硅藻可作为多不饱和脂肪酸新的来源，是鱼油的潜在的替代品之一，在保健食品和药品中有着重要的用途。
目前，硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法提取获得的多不饱和脂肪酸纯度低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法，所述方法提取获得的多不饱和脂肪酸纯度高、稳定性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法，包括以下步骤：
1)将硅藻藻粉与氯仿/甲醇溶液混合进行抽提，将所述抽提液过滤、脱色、去除溶剂得到粗脂肪；
2)将所述粗脂肪与NaOH乙醇溶液混合皂化获得皂化液，用正己烷萃取所述皂化液获得游离脂肪酸；
3)将所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应后，用生理盐水和正己烷进行萃取，收集上层液，向所述上层液中加入无水硫酸钠后，离心，收集上清液即为多不饱和脂肪酸。
优选的，步骤1)中所述氯仿/甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比为(1.9～2.1):1。
优选的，步骤1)中脱色采用活性炭进行。
优选的，步骤1)中所述抽提的温度为37～39℃，所述抽提的转速为80～120rpm，所述抽提的时间为3～5h。
优选的，步骤2)中所述NaOH乙醇溶液以乙醇为溶剂，NaOH的浓度为0.45～0.55mol/L。
优选的，步骤2)中所述皂化的温度为55～65℃，所述皂化的时间为35～45min。
优选的，步骤2)中所述皂化结束后，萃取前，还包括将所述皂化液的pH值调为2～3。
优选的，步骤3)中所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应的温度为70～80℃，时间为50～70min。
优选的，步骤3)中所述硫酸甲醇溶液以甲醇为溶剂，硫酸的体积浓度为3.5～4.5％。
优选的，步骤3)中所述离心的转速为5500～6500rpm；所述离心的时间为8～12min。
本发明的有益效果：本发明提供的硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法，通过将培养的硅藻藻粉进行抽提、皂化、甲酯化后获得，通过严格控制提取过程中的步骤先后顺序、温度、时间等参数特征获得的多不饱和脂肪酸纯度高，稳定性好。
具体实施方式
本发明提供了一种硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法，包括以下步骤：1)将硅藻藻粉与氯仿/甲醇溶液混合进行抽提，将所述抽提液过滤、脱色、去除溶剂得到粗脂肪；2)将所述粗脂肪与NaOH乙醇溶液混合皂化获得皂化液，用正己烷萃取所述皂化液获得游离脂肪酸；3)将所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应后，用生理盐水和正己烷进行萃取，收集上层液，向所述上层液中加入无水硫酸钠后，离心，收集上清液即为多不饱和脂肪酸。
本发明将硅藻藻粉与氯仿/甲醇溶液混合进行抽提，将所述抽提液过滤、脱色、去除溶剂得到粗脂肪。
在本发明中，所述硅藻藻粉由硅藻细胞冷冻干燥后获得。本发明对所述硅藻藻粉的来源没有特殊限定，采用市售或自制获得均可。在本发明具体实施中，所述硅藻细胞通过自行培养硅藻获得。在本发明中，将所述硅藻种子活化后接种至硅藻培养液中进行培养获得。在本发明中，所述硅藻种子的活化包括两级活化；在本发明中，所述活化的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；在本发明中，每一级活化的时间优选为7～10d，更优选为8～9d，每一级活化的接种量优选的独立选自8％～12％(V/V)，更优选为10％(V/V)。本发明在所述活化后，将处于对数生长期的活化后的藻种接种于发酵培养基中进行培养获得藻种发酵液，收集所述藻种发酵液中的硅藻细胞冷冻干燥后获得硅藻藻粉。在本发明中，所述活化和发酵的培养基优选为CSI培养基；所述CSI培养基优选的包括表1和表2所示组分，所述CSI培养基的pH值优选为7.0；其中所述土壤提取液配制方法优选的如下：取未施过肥的花园土200g置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000mL，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3h，冷却，沉淀24h，此过程连续进行3次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用。
表1%20CSI培养基的组成
表2 PIV的组成
在本发明中，获得藻种发酵液后，离心所述藻种发酵液，收集硅藻细胞。在本发明中，所述离心的转速优选为4500～5500rpm，更优选为5000rpm，所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在获得所述硅藻细胞后，优选的用蒸馏水对所述硅藻细胞进行洗涤，所述洗涤的次数优选为1～3次。本发明在所述洗涤后，对所述硅藻细胞进行冷冻干燥获得硅藻藻粉；本发明对所述冷冻干燥的参数没有特殊限定，采用本领域常规的冷冻干燥参数即可。
本发明在获得所述硅藻藻粉后，将硅藻藻粉与氯仿/甲醇溶液混合进行抽提。在本发明中，所述氯仿/甲醇溶液中氯仿和甲醇的体积比优选为(1.9～2.1):1，更优选为2:1；所述硅藻藻粉与与氯仿/甲醇溶液的质量体积比优选为1g：(45～55)mL，更优选为1g：50mL。在本发明中，所述抽提的温度优选为37～39℃，更优选为38℃，所述抽提的转速优选为80～120rpm，更优选为100rpm，所述抽提的时间优选为3～5h。
本发明在所述抽提结束后，对抽提液进行过滤，所述过滤优选为漏斗过滤。本发明在获得过滤液后对过滤液进行脱色，所述脱色优选的采用活性炭进行；在本发明具体实施过程中，优选的将所述活性炭加入过滤液中进行脱色；所述脱色的温度优选为37～39℃，更优选为38℃；所述脱色的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明在所述脱色结束后过滤去除活性炭，然后去除溶剂获得粗脂肪；在本发明中，所述去除溶剂的方法优选为旋转蒸发法。
本发明在获得粗脂肪后，将所述粗脂肪与NaOH乙醇溶液混合皂化获得皂化液，用正己烷萃取所述皂化液获得游离脂肪酸。在本发明中，所述NaOH乙醇溶液以乙醇为溶剂，NaOH的浓度优选为0.45～0.55mol/L，更优选为0.50mol/L。在本发明中，所述粗脂肪与NaOH乙醇溶液的质量体积比优选为1.8～2.1ml:1g，更优选为2ml:1g。本发明中，所述皂化的温度优选为55～65℃，更优选为60℃，所述皂化的时间优选为35～45min，更优选为40min。本发明中，所述皂化优选的在具塞比色管中进行。本发明在所述皂化完成后，优选的还包括用石油醚洗涤皂化液除去不皂化物后，调节皂化液的PH值为2～3，加入1ml生理盐水，所述pH值的调节优选的采用10％的盐酸溶液。完成上述步骤后，本发明用正己烷萃取所述皂化液获得游离脂肪酸。在本发明中，所述正己烷与皂化液的体积比优选为0.8～1.1:1，更优选为1:1；本发明在所述萃取结束后，优选的将萃取液进行氮吹除去正己烷得到游离脂肪酸。
本发明在获得游离脂肪酸后，将所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应后，用生理盐水和正己烷进行萃取，收集上层液，向所述上层液中加入无水硫酸钠后，离心，收集上清液即为多不饱和脂肪酸。在本发明中，所述硫酸甲醇溶液以甲醇为溶剂，硫酸的体积浓度优选为3.5～4.5％，更优选为4.0％。在本发明中，所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液的体积比优选为1.8～2.1:1，更优选为2:1；所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应的温度优选为70～80℃，更优选为75℃；所述游离脂肪酸与硫酸甲醇溶液反应的时间优选为50～70min，更优选为60min。在本发明中，所述生理盐水和正己烷的与上述反应液的体积比优选为0.8～1.1:1，更优选为1:1。在本发明中，所述萃取伴随振荡，本发明在所述萃取结束后，对萃取液进行静置，分层后取上层液。本发明向所述上层液中加入无水硫酸钠后离心，收集上清液即为多不饱和脂肪酸。本发明中，所述离心的转速优选为5500～6500rpm，更优选为6000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述多不饱和脂肪酸优选的置于棕色瓶中-20℃保存。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
培养基分别装于试管中，各待灭菌后，在超净台、内从斜面种子挑接一环，接入试管中，于25℃的摇床中培养8d。然后以10％(V/V)的接种量转接至新的培养基中，于25℃的摇床中培养9d，作为发酵种子。
硅藻种子活化和发酵培养所使用的培养基为CSI培养，配方如表1和表2。
表1 CSI培养基的组成
表2 PIV的组成
土壤提取液配制方法:取花园土未施过肥200g置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000mL，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3h，冷却，沉淀24h，此过程连续进行3次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用。
500mL三角瓶中装入200mL培养基，灭菌后以10％(V/V)的接种量将生长至对数期的藻种接入，于25℃，125rpm的摇床中培养6d。
将培养到期的硅藻培养液于5000rpm离心10min，弃上清液，藻泥用蒸馏水洗涤两次，冷冻干燥得到藻粉。
取1.0g藻粉，加入50mL氯仿甲醇混合液(体积比CHCl3:CH3OH＝2：1)置于200mL的烧瓶中，于38℃，100rpm的水浴摇床中抽提4h，有漏斗过滤，滤液加入5g活性炭，置于38℃水浴中保持30min。脱色结束后过滤除去活性炭，滤液旋转蒸发除去溶剂。
将抽提得到的粗脂肪转移到10mL具塞比色管中，加入2mL 0.5mol/L NaOH乙醇溶液，于60℃水浴中皂化40min。反应结束后用石油醚洗涤两次除去不皂化物，再用10％的盐酸调节PH值为2～3，加入1mL生理盐水，用2mL正己烷萃取，将萃取液进行氮吹除去正己烷得到游离脂肪酸。
将皂化得到的脂肪酸转移到10mL具塞比色管中，加入4％的硫酸甲醇溶液2mL，于75℃的水浴中反应1h。反应结束后分别加入2mL生理盐水和2mL正己烷，振荡，静置分层后取上层液，加入无水硫酸钠离心(6000rpm，10min)，将上清液置于棕色瓶中-20℃保存。
将脂肪酸酯化后，使用气相色谱检测，结果显示多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的30.47％。
对比例1
藻粉加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂(体积比为1:1)粗提取粗脂，适当振荡混匀。并且加入质量分数10％的KOH沉淀藻细胞，然后在4000rpm条件下离心15min取上层清液。在60℃水浴迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重。
气相检测，此方法获得的多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的20.1％。
对比例2
藻粉加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂(体积比为1:2)粗提取粗脂，适当振荡混匀。并且加入质量分数10％的KOH沉淀藻细胞，然后在4000rpm条件下离心15min取上层清液。在60℃水浴迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重。
多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的23.7％。
由上述实施例可知，本发明所述的硅藻中多不饱和脂肪酸的提取方法获得的多不饱和脂肪酸提取率高、纯度高，稳定性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
