包封的固体酶产品
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技术领域
本发明涉及含有酶或微生物的小袋、生产所述小袋的方法、以及使用所述小袋制备洗涤剂组合物的方法。
背景技术
洗涤剂组合物经常包含酶连同其他组分如表面活性剂。在此类洗涤剂组合物中可以使用各种不同的酶，以帮助清洁基质，如衣物。酶可包括蛋白酶以分解蛋白质材料、脂肪酶以分解脂肪材料和淀粉酶以分解基于碳水化合物的材料。类似地，WO 2012/112718描述了使用微生物来控制清洁机器和清洁过程中的恶臭。这些生物活性洗涤剂成分经常在制备洗涤剂组合物期间以液体形式作为溶液或悬浮液添加，所述洗涤剂组合物也可含有水和表面活性剂等其他组分。
发明内容
本发明寻求提供用于制备含有酶或微生物的洗涤剂组合物的改善的方法。
根据本发明，提供了一种小袋，所述小袋包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物，并且所述室含有包含酶或微生物的颗粒固体以及包含表面活性剂和/或多元醇的液体。
在一个实施例中，所述小袋的重量大于50g(如50g至25kg)，优选大于100g、大于250g、或大于500g。有利地，所述小袋包含大于0.5％w/w的活性酶蛋白，优选大于1％w/w的活性酶蛋白，或大于5％w/w的活性酶蛋白。
优选地，所述酶选自蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、DNA酶、过水解酶、氧化还原酶(例如漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)；优选蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和/或甘露聚糖酶。
便利地，所述颗粒固体包含经喷雾干燥的酶。
优选地，所述小袋包含多于一种酶。便利地，所述小袋包含多于一个室。
优选地，所述微生物是细菌、真菌或酵母，如脱水细菌或酵母。在一个实施例中，所述微生物是微生物孢子，如细菌(内生)孢子。在一个优选的实施例中，所述微生物是芽孢杆菌内生孢子，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的内生孢子。
有利地，所述表面活性剂包括非离子型表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚表面活性剂。优选地，所述聚氧乙烯烷基醚表面活性剂是SoftanolTM表面活性剂，优选SoftanolTM90。
便利地，所述多元醇包括甘油、(单、二或三)丙二醇、糖醇(如山梨醇)、聚丙二醇(优选具有分子量在200至800范围内的聚丙二醇(PPG200-800))，和/或聚乙二醇(优选具有分子量在200-800范围内的聚乙二醇(PEG200-800))。
便利地，所述PVA的水解度为从约75％至约99％。有利地，所述壁的厚度为从约20至约5000μm，优选从约50至约3000μm，更优选从约50至约2000μm，更优选从约50至约1000μm，更优选从约100至约2000μm，且最优选从约100至约1000μm。
优选地，所述室还含有一种或多种添加剂。便利地，所述一种或多种添加剂包括表面活性剂、多元醇和/或酶抑制剂。
根据本发明的一个方面，提供了一种制备小袋的方法，所述方法包括形成壁，所述壁形成室，所述壁包含水溶性聚合物；在所述室中提供包含酶的颗粒固体，和包含表面活性剂和/或多元醇的液体；并密封所述室以形成所述小袋。优选地，所述小袋为如上文所定义的。
根据本发明的一个方面，提供了制备含酶的洗涤剂组合物的方法，所述方法包括将小袋添加到水性组合物中，其中所述小袋包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物，并且所述室含有包含酶的颗粒固体以及包含表面活性剂和/或多元醇的液体。优选地，将所述小袋添加到由一种或多种洗涤剂成分(如一种或多种表面活性剂和/或一种或多种助洗剂)组成的水性组合物中。便利地，所述小袋为如上文所定义的。有利地，搅动所述水性组合物以帮助所述小袋的溶解。
根据本发明的一个方面，提供了一种可通过上文所描述的方法获得的洗涤剂组合物。
本发明的其他方面和实施例在说明书和实例下是显而易见的。
现将通过示例参考附图来描述本发明，其中：
图1是显示小袋的制备的示意图，所述小袋包含含酶的材料；并且
图2显示在储存测试之前和之后包含含酶材料的小袋的外观。
具体实施方式
本发明旨在提供用于在制备此类组合物中使用的产品，这产生改善的方法。本发明涉及包含酶或微生物的小袋，所述小袋由允许其添加到洗涤剂组合物中以释放其内容物的材料制成。所述小袋可包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物。所述室含有包含酶的颗粒固体，和包含表面活性剂和/或多元醇的液体。在水性环境如洗涤剂组合物中，所述壁以至少足以释放其内容物的程度溶解，然后这可导致形成含酶或含微生物的洗涤剂组合物。所述酶或微生物以颗粒固体形式提供，并且所述小袋可另外包含添加剂以帮助整个过程。
所述小袋含有在颗粒固体中的酶或微生物。这意指固体以粉末或颗粒存在，而不是以片剂或单一固体形式存在。所述小袋还包含含有表面活性剂和/或多元醇的液体。所述酶中的一些可以被液体溶解，从而使液体成为相对于酶的饱和溶液。优选地，所述液体含有表面活性剂和多元醇。所述颗粒固体和液体在室中混合在一起。所述小袋可含有多于一种酶。这可以通过含有颗粒固体材料的室来实现，所述颗粒固体材料包含多于一种酶(在分开的固体颗粒中或在相同的固体颗粒中)。此外，小袋可以含有多于一个室。在一个实施例中，第一室可含有第一酶，且第二室可含有第二酶。
添加剂可以为酶和其他组分提供稳定性，并且还可以帮助酶溶解到洗涤剂组合物中。
本发明具有许多益处。与等同量的液体形式的酶的制备和使用相比，酶小袋的配制相对简单并具有商业优势。
此外，本发明允许使用处于喷雾干燥材料形式的酶。喷雾干燥的材料优选用一种或多种添加剂润湿，以改善材料的特性。例如，所述一种或多种添加剂可以改善小袋和/或材料的稳定性和/或溶解特性。与其他含酶的材料(如液体配制品)相比，润湿的喷雾干燥的包含酶的固体产品可具有优异的稳定性。就热稳定性而言尤其如此，因此在具有相对高温度的区域或国家中可能特别有用。此外，以小袋形式提供酶允许将不同的酶混合或共混在一起。这允许精确测量和共混，并且还允许形成稳定的产品。此外，在以便利的方式形成多于一种酶的共混物方面存在益处，其最小化酶的相互作用，并因此使可能的降解(例如在储存期间)最小化。
对于洗涤剂生产商而言，酶小袋易于使用和给药，无需给药或测量设备。因此，可以将含有特定量材料的小袋添加到洗涤剂组合物中以制备含酶的洗涤剂组合物。
所述小袋还可以含有非常高的酶活性，并且可以按低于液体形式提供的等同量酶的总生产和分配成本来进行。
所述小袋可以由任何为内容物提供稳定性并且还允许小袋在洗涤剂组合物的形成中释放其内容物(例如通过溶解)的材料制成。
与使用可能产生含酶粉尘的材料相比，使用本发明的小袋具有安全优势。这种粉尘如果吸入可能是潜在刺激性或有害的。使用本发明的小袋促进酶的容易和简单处理，而不会使人暴露于这种危险中。
形成室的壁
根据本发明的小袋包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物。因此，所述水溶性聚合物是水溶性膜的组分，其被用于制备形成室的壁。
水溶性膜、用于其中的任选成分以及制备它们的方法在本领域是熟知的。在一类实施例中，所述水溶性膜包含PVA(聚乙烯乙酸酯)。如本文使用的，“PVA”是指聚乙酸乙烯酯本身，和通常通过聚乙酸乙烯酯的醇解(通常称为水解或皂化)制备的合成树脂。完全水解的PVA(其中几乎所有的乙酸基团已被转化成醇基团(即聚乙烯醇))仅在热水(大于约60℃)中溶解的强氢键键合的、高度结晶的聚合物。如果在聚乙酸乙烯酯水解后允许剩余足够数目的乙酸基团，则PVA聚合物被称为部分水解的，它的氢键键合更弱且结晶度更低并且在冷水(低于约10℃)中是可溶的。中间冷/热水溶性膜可包括例如中间部分水解的PVA(例如，具有约94％至约98％的水解度)，并且仅在温水(例如，在约40℃及以上的温度下快速溶解)中易溶。完全和部分水解的PVA类型通常都被称为PVA均聚物，尽管部分水解的类型从技术上而言是乙烯醇-乙酸乙烯酯共聚物。
包含于本披露的水溶性膜中的PVA的水解度可以是约75％至约99％。当水解度降低时，由树脂制成的膜将具有降低的机械强度但是在低于约20℃的温度更快的溶解。当水解度增加时，由树脂制成的膜将倾向于机械强度更高并且热成型性将倾向于降低。可以选择PVA的水解度使得树脂的水溶性是温度依赖性的，且由此由树脂、相容性试剂和另外的成分制成的膜的溶解度也受到影响。在一类实施例中，所述膜是冷水溶性的。冷水溶性膜(在低于10℃的温度下可溶解于水中)可以包括水解度在约75％至约90％的范围内，或在约80％至约90％的范围内，或在约85％至约90％的范围内的PVA。在另一类实施例中，所述膜是热水溶性的。热水溶性膜(在至少约60℃的温度下可溶解于水中)可以包括水解度为至少约98％的PVA。
除PVA之外或作为PVA的替代方案中，其他使用的成膜树脂可包括但不限于改性聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、水溶性丙烯酸酯共聚物、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、普鲁兰、水溶性天然聚合物(包括但不限于瓜尔胶、黄原胶、角叉菜胶和淀粉)、水溶性聚合物衍生物(包括但不限于乙氧基化淀粉和羟丙基化淀粉)、聚(丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠)、聚单甲基马来酸酯、其共聚物以及前述项的任何组合。在一类实施例中，所述成膜树脂是由乙烯醇、乙酸乙烯酯和丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠组成的三元共聚物。
水溶性树脂可以按任何合适的量(例如在约35％w/w至约90％w/w范围内的量)包含于水溶性膜中。
用于本文所描述的膜中使用的水溶性树脂(包括但不限于PVA树脂)可以由针对所希望的膜特性而言任何合适的粘度来表征，任选地在约5.0cP至约30.0cP、或约10.0cP至约25cP范围内的粘度。PVA树脂的粘度通过使用具有UL适配器的布氏(Brookfield)LV型粘度计来测量新制备的溶液而确定，如在英国标准EN ISO 15023-2:2006附录E布氏测试法中所描述的。在20℃阐述4％聚乙烯醇水溶液的粘度是国际惯例。除非另有说明，否则本文中以cP指定的所有PVA粘度均应理解为指在20℃下4％聚乙烯醇水溶液的粘度。
本领域熟知的是，PVA树脂的粘度与相同PVA树脂的重均分子量相关，并且经常将粘度用作重均分子量的代理。因此，水溶性树脂的重均分子量任选地可以在约35,000至约190,000、或约80,000至约160,000的范围内。树脂的分子量只需要足以使得它被合适的技术模制形成塑料薄膜即可。
根据本披露的水溶性膜可以例如以适合于其预期目的的量包括其他任选添加剂成分，包括但不限于，增塑剂、表面活性剂、消泡剂、成膜剂、防粘连剂、内脱模剂、抗黄变剂以及其他功能性成分。
水被认为是对于PVA和其他聚合物而言非常有效的增塑剂；然而，水的挥发性使其效用受到限制，因为聚合物膜需要对包括低和高相对湿度在内的多种环境条件具有至少一些耐受性(稳健性)。甘油的挥发性远低于水，并已被确立为对PVA和其他聚合物而言有效的增塑剂。
用于在本披露的水溶性膜中使用的增塑剂包括但不限于山梨醇、甘油、双甘油、丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、聚乙二醇(高达MW400)、2甲基1,3丙二醇、乳酸、甘油一乙酸酯、三醋精、柠檬酸三乙酯、1,3-丁二醇、三羟甲基丙烷(TMP)、聚醚三醇及其组合。如上文所描述的，多元醇通常可用作增塑剂。增塑剂使用越少，膜可能变得越脆，而增塑剂使用越多，膜可能失去拉伸强度。增塑剂可以按例如在约25phr至约50phr、或从约30phr至约45phr、或从约32phr至约42phr范围内的量包含于水溶性膜中。
用于在水溶性膜中使用的表面活性剂在本领域是熟知的。任选地，包括表面活性剂以在浇铸时帮助树脂溶液的分散。用于本披露的水溶性膜的合适的表面活性剂包括但不限于二烷基磺基琥珀酸酯、甘油和丙二醇的乳酸化脂肪酸酯、脂肪酸乳酰酯、烷基硫酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、烷基聚氧乙烯醚、卵磷脂、甘油和丙二醇的乙酰化脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、脂肪酸乙酰化酯、肉豆蔻基二甲基氧化胺、三甲基牛脂烷基氯化铵、季铵化合物、其盐以及上述任何项的组合。因此，表面活性剂可以按例如小于约2phr，例如小于约1phr、或小于约0.5phr的量包含于水溶性膜中。
考虑使用的一种类型的次级组分是消泡剂。消泡剂可以有助于聚结泡沫气泡。在根据本披露的水溶性膜中使用的合适的消泡剂包括但不限于疏水性二氧化硅，例如细粒度的二氧化硅或煅制二氧化硅，包括Foam
用于制备水溶性物品(包括膜)的方法包括浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出，如本领域中已知的。一类考虑的实施例由本文所描述的水溶性膜通过浇铸形成表征，例如通过将本文所描述的成分与水混合以产生水性混合物(例如具有任选地分散的固体的溶液)，向表面施加所述混合物，并且干燥去除水以产生膜。类似地，可通过干燥所述混合物，同时将其局限为所希望的形状以形成其他组合物。
在一类考虑的实施例中，通过浇铸水溶性混合物形成水溶性膜，其中所述水溶性混合物根据以下步骤制备：
(a)提供水溶性树脂、水以及排除增塑剂的任何任选的添加剂的混合物；
(b)将混合物煮沸30分钟；
(c)将混合物在烘箱中在至少40℃的温度脱气；任选地在40℃至90℃的范围内，例如约65℃；
(d)在65℃或更低的温度向混合物中添加一种或多种增塑剂，和另外的水；和
(e)在无涡旋的情况下搅拌混合物，直到混合物的颜色和稠度看起来大体上一致；任选地持续在30分钟至90分钟的范围内的一段时间，任选地至少1小时；和
(f)在搅拌的时间段之后迅速浇铸混合物(例如，在4小时、或2小时、或1小时内)。
所述膜可用于产生包以容纳含酶组合物，由此形成小袋。本文所描述的膜还可用于制备具有两个或更多个隔室的包，所述包由相同的膜或者结合其他聚合材料的膜制成。另外的膜可以是例如通过浇铸、吹塑、挤出或吹制挤出相同或者不同的聚合材料而获得的，如本领域中已知的。在一个类型的实施例中，适合用作另外的膜的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(如黄原胶和角叉菜胶)。例如，聚合物可以选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯及其组合，或选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(HPMC)及其组合。
本披露的小袋和/或包包括至少一个密封的隔室。因此，所述小袋可以包括单个隔室或多个隔室。所述小袋可以具有含酶和不含酶的区域。在包括多个隔室的实施例中，每个隔室可以含有相同的和/或不同的组合物。进而，除了含有包含酶的固体的本发明组合物以外，任何此类另外的组合物可以采取任何合适的形式，包括但不限于液体、固体及其组合(例如，悬浮在液体中的固体)。在一些实施例中，所述小袋包括第一、第二和第三隔室，其中每一个隔室分别容纳不同的第一、第二和第三组合物。在一些实施例中，如在EP 2258820中所描述的，组合物可以是视觉上不同的。
多隔室小袋和/或包的隔室可以具有一个或多个相同的或不同的尺寸和/或体积。本发明的多隔室小袋的隔室可以是分开的或以任何合适方式结合的。在一些实施例中，所述第二和/或第三和/或随后的隔室叠加在所述第一隔室上。在一个实施例中，所述第三隔室可以叠加在所述第二隔室上，所述第二隔室进而以一种夹层构型叠加在所述第一隔室上。替代性地，所述第二和第三隔室可以叠加在所述第一隔室上。然而，还可以同样地设想的是，所述第一、第二和任选地第三和随后的隔室可以按并排的关系相互附接。隔室可以被包装成一串，每个隔室通过穿孔线是各自地可分开的。因此，每个隔室可以被最终用户从所述串的剩余部分单独地撕去。
本披露的小袋和/或包可以包含一种或多种不同的膜。例如，在单个隔室的实施例中，所述包可以由一个折叠到其自身上并且在边缘处密封的壁制成，或者替代性地，由两个在边缘处密封在一起的壁制成。在多个隔室的实施例中，所述包可以由一种或多种膜制成，这样使得任何给定的包隔室可以包含由单种膜或具有不同组成的多种膜制成的壁。在一个实施例中，多隔室的小袋包含至少三个壁：外上壁；外下壁；以及分隔壁。所述外上壁和所述外下壁通常是相对的并且形成所述小袋的外部。所述分隔壁在所述小袋的内部并且沿着密封线被固定至所述通常相对的外壁。所述分隔壁将所述多隔室小袋的内部分隔成至少一个第一隔室和一个第二隔室。
小袋和包可用任何合适的设备和方法制成。例如，单个隔室小袋可用本领域公知的立式填充、卧式填充或转鼓填充技术制成。此类方法可以是连续的或间断的。可以将所述膜润湿和/或加热以提高其延展性。所述方法还可以涉及使用真空以将膜牵引到一个合适的模具中。一旦膜处在所述表面的水平部分上，将所述膜牵引到所述模具中的真空可以实施约0.2至约5秒、或约0.3至约3、或约0.5至约1.5秒。所述真空可以这样使得它提供例如在10毫巴至1000毫巴的范围内、或在100毫巴至600毫巴的范围内的一个下压。
所述模具(包可以在其中制成)可具有任何形状、长度、宽度和深度，取决于所述小袋所需要的维度。如果希望的话，所述模具还可以彼此在大小和形状上不同。例如，最终小袋的体积可以是约50ml至约25l、或约50ml至10l、或约100ml至约5000ml、或约100ml至约1000ml，并相应地调整模具大小。
在一个实施例中，所述包包括一个第一和一个第二密封隔室。通常，所述第二隔室与所述第一密封隔室呈叠加关系，这样使得所述第二密封隔室和所述第一密封隔室共用所述小袋内部的一个分隔壁。
在一个实施例中，包括一个第一和一个第二隔室的包进一步包括一个第三密封隔室。通常，所述第三密封隔室与所述第一密封隔室呈叠加关系，这样使得所述第三密封隔室和所述第一密封隔室共用所述小袋内部的一个分隔壁。
在一个实施例中，所述单个隔室或多个密封隔室含有组合物。所述多个隔室可以各自含有相同或不同的组合物。
在所述方法中，热可以被施加至所述膜，通常称为热成型。可以用任何合适的手段施加热量。例如，在将所述膜供给到表面上之前或一旦在表面上，可以通过使它处于加热元件之下或通过热空气而直接对其加热。替代性地，例如，可以通过加热表面或将热物品施加到所述膜上而间接对其加热。可以使用红外光加热所述膜。可以将膜加热至至少50℃，例如约50℃至约150℃，约50℃至约120℃，约60℃至约130℃，约90℃至约120℃，或约60℃至约90℃的温度。
替代性地，可以通过任何合适的手段润湿所述膜，例如，在将其供给到表面上之前或一旦在表面上，直接通过将润湿剂(包括水、所述膜组合物的溶液、用于所述膜组合物的增塑剂、或前述项的任何组合)喷雾到所述膜上，或间接通过润湿表面或通过将湿润物品施加到所述膜上。
一旦膜已经被加热和/或润湿，可以将它牵引到一个适当的模具中，优选地使用真空。例如，所述膜可以按至少约1.5的拉伸比，以及例如，任选地高达2的拉伸比热成型。可以通过使用任何合适的手段完成所述模制膜的填充。在一些实施例中，最优选的方法将取决于产品形式和所需要的填充速度。在一些实施例中，通过在线填充技术填充所述模制膜。然后通过任何合适的方法，使用第二膜将经填充的开口包封闭，以形成小袋。这可以当处于水平位置并且在连续匀速运动中完成。可以通过以下方式完成封闭：连续地将第二膜(优选水溶性膜)供给到所述开口包上方和上面，并且然后优选将第一膜和第二膜一起密封，典型地在模具之间的区域并且因此在包之间。
可以利用任何合适的密封包和/或其独立隔室的方法。此类手段的非限制性实例包括热密封、溶剂焊接、溶剂密封或液封及其组合。水溶性的包和/或其各个隔室可在至少95℃的温度热密封，例如在约105℃至约145℃，或约110℃至约140℃的范围内。典型地，只用热或溶剂处理将形成密封的区域。典型地，可以通过任何方法将热或溶剂施加到封闭材料上，并且典型地，只施加到将形成密封的区域上。如果使用溶剂密封或液封或焊接，可以优选的是同样施加热。优选的液封或溶剂密封/焊接方法包括选择性地将溶剂施加到模具之间的区域或封闭材料上、通过例如将其喷雾或印刷到这些区域上，并且然后施加压力到这些区域上，以形成密封。例如，可以使用如上文所描述的密封辊和带(任选地也提供热)。
然后，可以通过切割装置将所形成的小袋切割。可以使用任何已知方法完成切割。可以优选的是，还可以按连续方式进行切割，并且优选地以恒定的速度并且优选地当处于水平位置时。所述切割装置可以是例如锋利物品、或热物品、或激光，由此，在后者的情况下，所述热物品或激光“烧”穿所述膜/密封区域。
多隔室小袋的不同隔室可以按并排样式一起制成，其中所得到的连体小袋可以通过切割而被分开或可以不被分开。替代性地，所述隔室可以被分开地制成。
在一些实施例中，可以根据包括以下步骤的方法制成小袋：
a)形成第一隔室(如上文所描述的)；
b)在步骤(a)中形成的封闭隔室的一些或全部内形成凹口，以产生叠加在所述第一隔室之上的第二模制隔室；
c)借助第三膜填充并封闭所述第二隔室；
d)密封所述第一、第二和第三膜；和
e)切割所述膜以产生多隔室小袋。
可以通过向步骤(a)中制备的隔室施加真空来实现步骤(b)中形成的凹口。
在一些实施例中，第二和/或第三隔室可以在分开的步骤中制成，并且然后与所述第一隔室结合，如在EP 2088187或WO 2009/152031中所描述的。
在其他实施例中，可以根据包括以下步骤的方法制成小袋：
a)任选地使用热和/或真空，在第一成型机上使用第一膜形成第一隔室；
b)用第一组合物填充所述第一隔室；
c)在第二成型机上，任选地使用热和真空使第二膜变形，以制成第二和任选地第三模制隔室；
d)填充所述第二和任选地第三隔室；
e)使用第三膜密封所述第二和任选地第三隔室；
f)将所述密封的第二和任选地第三隔室放到所述第一隔室上；
g)密封所述第一、第二和任选地第三隔室；和
h)切割所述膜以产生多隔室小袋。
可以基于所述第一成型机和第二成型机进行以上方法的适合性对其进行选择。在一些实施例中，所述第一成型机优选为卧式成型机，而所述第二成型机优选为转鼓成型机，优选地位于所述第一成型机之上。
应当理解的是，通过使用适当的进料站，有可能制造掺入多种不同或独特组合物和/或不同或独特液体、凝胶或糊状组合物的多隔室小袋。
用于形成小袋的壁的优选的材料是PVA(聚乙烯乙酸酯)膜。PVA膜用于形成各种不同的产品，包括小袋。可以选择膜的等级、结构和厚度以提供所需要的溶解特征。一些形式的PVA膜在较低温度比其他形式的膜更容易溶解，后者意图用于在更高的温度更快速地溶解。此外，膜的厚度影响溶解速度。在形成本发明的小袋中使用的优选的类型的PVA包括具有从约75％至约99％的PVA水解度的材料。
膜的厚度可以随PVA膜的类型和所需要的溶解特征而变化。然而，厚度可为从约20μm至约5000μm，优选从约50μm至约3000μm，更优选从约100μm至约2000μm。
所述小袋优选含有一个室来容纳酶材料。然而，考虑所述小袋可含有多于一个室，例如其中两种不同的酶材料优选在储存期间保持分开。
一种或多种酶
本发明的小袋中使用的组合物包含一种或多种酶，特别是适用于包括在衣物或餐具洗涤剂中的酶(洗涤剂酶)，如蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、DNA酶、过水解酶、氧化还原酶(例如漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)。优选的洗涤剂酶是蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、裂解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、DNA酶、过水解酶和氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)；或其组合。更优选的洗涤剂酶为蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、和甘露聚糖酶；或其组合。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。
蛋白酶
用于在本发明中使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶、金属蛋白酶和/或胰蛋白酶样蛋白酶。优选地，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶；更优选地，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(White,Handler和Smith,1973“Principles of Biochemistry[生物化学原理],”第五版,McGraw-Hill Book Company[麦格劳-希尔图书公司],纽约，第271-272页)。枯草杆菌蛋白酶包括I-S1和I-S2亚组，优选地由其构成，如Siezen等人，Protein Engng.[蛋白工程]4(1991)719-737；和Siezen等人，Protein Science[蛋白科学]6(1997)501-523所定义。由于丝氨酸蛋白酶的活性位点的结构高度保守，根据本发明的枯草杆菌蛋白酶可以在功能上相当于由Siezen等人(同上)提出的指定亚组的枯草杆菌酶(subtilase)。
枯草杆菌蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体(蛋白工程化的变体)，优选为碱性微生物枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中)以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。
其他有用的蛋白酶的实例是描述于WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264中的变体，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、43、57、61、62、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、156、158、160、161、167、170、182、185、188、191、194、195、199、204、205、206、209、212、217、218、224、232、235、236、245、248、252、261、262、274和275(使用BPN’编号)。蛋白酶可以在对应于WO 2004/067737的SEQ ID NO:3的171、173、175、179或180位的一个或多个位置处包含取代。
更优选的蛋白酶变体可包含一个或多个以下取代：S3T、V4I、S9R、S9E、A15T、K27R、*36D、N43R、G61E、G61D、N62D、N62E、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G、S99D、S99A、S99AD、S101E、S101D、S101G、S101M、S101N、S101R、S101H、S103A、V104I、V104Y、V104N、S106A、G118V、G118R、H120D、H120N、N123S、S128L、P129Q、S130A、S156D、A158E、G160D、G160P、S161E、Y167A、R170S、Q182E、N185E、S188E、Q191N、A194P、G195E、V199M、N204D、V205I、Y209W、S212G、L217Q、L217D、N218D、N218S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、N261W、N261D、N261E、L262E、L262D、T274A、R275H(使用BPN’编号)。
可商购的蛋白酶的实例包括以下列商品名出售的那些：AlcalaseTM、RelaseTM、RelaseTMUltra、SavinaseTM、SavinaseTMUltra、DuralaseTM、DurazymTM、EverlaseTM、PrimaseTM、PolarzymeTM、KannaseTM、LiquanaseTM、LiquanaseTM Ultra、OvozymeTM、CoronaseTM、CoronaseTMUltra、BlazeTM、Blaze EvityTM100T、Blaze EvityTM125T、BlazeEvityTM150T、NeutraseTM、EsperaseTM、CarnivalTM、Progress UnoTM、和Progress ExcelTM(诺维信公司(Novozymes A/S)；以下列商品名出售的那些：MaxataseTM、MaxacalTM、PuramaxTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、ExcellaseTM、MaxapemTM、Purafect OxTM、Purafect OxPTM、EffectenzTMP1050、EffectenzTMP1060、ExcellenzTMP1000、ExcellenzTMP1250、EraserTM、PreferenzTMP100、Purafect PrimeTM、PreferenzTMP110、EffectenzTMP1000、PurafectTM、EffectenzTMP2000、PurafastTM、ProperaseTM、OpticleanTM和OptimaseTM(杰能科公司(Genencor)/丹斯尼克公司(Danisco)/杜邦公司(DuPont))；AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))；BLAP(US 5352604的图29示出的序列)及其变体(汉高公司(Henkel AG))；和来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
裂解酶
裂解酶可以是果胶裂解酶，来源于芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌或粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)，或来源于这些来源中任一种的变体，例如，如在US 6124127、WO99/027083、WO 99/027084、WO 02/006442、WO 02/092741、WO 03/095638中所描述的，可商购的果胶裂解酶是XPectTM；PectawashTM和PectawayTM(诺维信公司)。
甘露聚糖酶
甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶描述于WO 99/064619中。可商购的甘露聚糖酶是MannawayTM(诺维信公司(Novozymes A/S))和MannastarTM(杜邦公司(DuPont))。
纤维素酶
合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中所描述的那些。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、CarezymeTM、Carezyme PremiumTM、WhitezymeTM和CellucleanTM(诺维信公司)；ClazinaseTM、RevitalenzTM、和Puradax HATM(杜邦公司)；BiotouchTMDCL和FCL(AB酶公司)；和KAC-500(B)TM(花王株式会社)。
脂肪酶和角质酶
合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如在EP258 068和EP 305 216中所描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如在WO 96/13580中所描述的特异腐质霉；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人,1993,Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学学报],1131:253-360)、嗜热脂肪芽杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其他实例是例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/060063、WO 2007/087508以及WO 2009/109500中所描述的那些脂肪酶变体。
优选的可商购的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM和LipexTM；LecitaseTM、LipolexTM；LipocleanTM、LipoprimeTM(诺维信公司)。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(杜邦公司)；Lipomax(吉斯特布罗卡德斯公司/杜邦公司)和来自苏威公司(Solvay)的芽孢杆菌属脂肪酶。
淀粉酶
合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌属(例如在GB 1,296,839中详细所描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株)获得的α淀粉酶。
合适的淀粉酶的实例包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的合适的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他合适的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的合适的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的合适的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是在以下位置具有取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他合适的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置处具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置处具有取代的变体。
其他的实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078、和WO 2013/001087中所描述的那些。
可商购的淀粉酶是StainzymeTM；Stainzyme PlusTM；DuramylTM、TermamylTM、Termamyl UltraTM；NatalaseTM、FungamylTM和BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM/EffectenzTM、PoweraseTM、AmplifyTM、Amplify PrimeTM、PreferenzTMS100和PreferenzTMS110(杜邦公司)。
脱氧核糖核酸酶(DNA酶)
合适的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是催化DNA骨架中的磷酸二酯键的水解切割从而降解DNA的任何酶。根据本发明，可获得自细菌的DNA酶是优选的；特别地，可获得自芽孢杆菌属的DNA酶是优选的；特别地，可获得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的DNA酶是优选的。此类DNA酶的实例描述于专利申请WO 2011/098579或PCT/EP 2013/075922中。
过水解酶
合适的过水解酶能够催化过水解反应，所述反应导致在过氧化物源(例如，过氧化氢)的存在下从羧酸酯(酰)底物产生过酸。虽然许多酶以低水平进行所述反应，过水解酶展现出高的过水解：水解比率，通常大于1。合适的过水解酶可以是植物、细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。
有用的过水解酶的实例包括天然存在的分枝杆菌属过水解酶或其变体。一种示例性酶来源于耻垢分枝杆菌。这种酶，其酶特性、其结构及其变体描述于WO 2005/056782、WO2008/063400、US 2008/145353以及US 2007167344中。
氧化酶/过氧化物酶
合适的氧化酶和过氧化物酶(或氧化还原酶)包括各种糖氧化酶、漆酶、过氧化物酶以及卤代过氧化物酶。
合适的过氧化物酶包括那些由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会陈述的酶分类EC 1.11.1.7包括的过氧化物酶，或来源于其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
合适的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中所描述的那些。
用于在本发明中使用的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯离子形成次氯酸盐。
在一个实施例中，所述卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，所述卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选的方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯离子来源组合。
已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已从细菌，如假单胞菌属(如吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
在一个优选的实施例中，卤代过氧化物酶来源于弯孢属菌种，特别是疣枝弯孢或不等弯孢，如在WO 95/27046中所描述的不等弯孢CBS 102.42；或如在WO 97/04102中所描述的疣枝弯孢CBS 147.63或疣枝弯孢CBS444.70；或来源于如在WO 01/79459中所描述的Drechslera hartlebii，如在WO 01/79458中所描述的盐沼小树状霉(Dendryphiellasalina)、如在WO 01/79461中所描述的Phaeotrichoconis crotalarie或如在WO 01/79460中所描述的Geniculosporium菌种。
根据本发明的氧化酶特别包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或来源于其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。所述酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
来自真菌的合适实例包括可来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。
来自细菌的合适实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
优选的是来源于拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是来源于灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或来源于嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
其他氧化酶的实例包括但不限于氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸盐氧化酶、半乳糖氧化酶、多元醇氧化酶(例如，WO 2008/051491)、以及醛糖氧化酶。氧化酶及其对应的底物可以被用作过氧化氢生成酶系统，由此作为过氧化氢的一个来源。若干种酶，如过氧化物酶、卤代过氧化物酶以及过水解酶需要一个过氧化氢的来源。通过研究EC 1.1.3._、EC1.2.3._、EC 1.4.3._、以及EC 1.5.3._或类似类别(在国际生物化学协会下)，本领域的普通技术人员容易识别氧化酶和底物的此类组合的其他实例。
如上提及的，氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在所述分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于所述分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见例de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA7:127)。
两个氨基酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite[欧洲分子生物学开放软件套件]),Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的所实施尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔-翁施算法(Needleman-Wunsch)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
稳定剂/抑制剂
可以使用常规稳定剂使如上文所描述的这种或这类酶稳定化，所述稳定剂例如为多元醇如(单、二或三)丙二醇、聚乙二醇(如PEG200-PEG1000)、甘油、糖或糖醇；或通过暂时降低蛋白酶活性起作用的化合物。
由此，本发明的组合物还可包含蛋白酶抑制剂/稳定剂，所述蛋白酶抑制剂/稳定剂是蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)的可逆抑制剂。优选地，所述蛋白酶抑制剂是(可逆的)枯草杆菌蛋白酶抑制剂。特别地，所述蛋白酶抑制剂可以是肽醛、原硼酸(boricacid)或硼酸(boronic acid)；或这些中的任一种的衍生物。
所述蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶的抑制常数Ki(mol/L)可以从1E-12至1E-03；更优选从1E-11至1E-04；甚至更优选从1E-10至1E-05；甚至更优选从1E-10至1E-06；并且最优选从1E-09至1E-07。
硼酸
所述蛋白酶抑制剂可以是硼酸或其衍生物；优选为苯基硼酸或其衍生物。在本发明的实施例中，所述苯基硼酸衍生物具有以下式：
其中R选自由以下组成的组：氢、羟基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烯基以及取代的C1-C6烯基。优选地，R是氢、CH3、CH3CH2、或CH3CH2CH2。
在一个优选的实施例中，所述蛋白酶抑制剂(苯基硼酸衍生物)为4-甲酰基-苯基-硼酸(4-FPBA)。
在另一个具体实施例中，所述蛋白酶抑制剂选自由以下组成的组：
噻吩-2硼酸、噻吩-3硼酸、乙酰胺苯基硼酸、苯并呋喃-2硼酸、萘-1硼酸、萘-2硼酸、2-FPBA、3-FBPA、4-FPBA、1-噻蒽硼酸、4-二苯并呋喃硼酸、5-甲基噻吩-2硼酸、硫茚硼酸、呋喃-2硼酸、呋喃-3硼酸、4,4联苯基-二硼酸、6-羟基-2-萘、4-(甲硫基)苯基硼酸、4(三甲基-甲硅烷基)苯基硼酸、3-溴代噻吩硼酸、4-甲基噻吩硼酸、2-萘基硼酸、5-溴噻吩硼酸、5-氯代噻吩硼酸、二甲基噻吩硼酸、2-溴代苯基硼酸、3-氯代苯基硼酸、3-甲氧基-2-噻吩、对-甲基-苯乙基硼酸、2-噻蒽硼酸、二苯并噻吩硼酸、4-羧基苯基硼酸、9-蒽基硼酸、3,5二氯苯基硼酸、二苯基硼酸酐、邻-氯代苯基硼酸、对-氯代苯基硼酸、间-溴代苯基硼酸、对-溴代苯基硼酸、对-氟代苯基硼酸、对-甲苯基硼酸、邻-甲苯基硼酸、辛基硼酸、1,3,5三甲基苯基硼酸、3-氯代-4-氟代苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸、3,5-二-(三氟甲基)苯基硼酸、2,4二氯代苯基硼酸、4-甲氧基苯基硼酸。
适合作为洗涤剂组合物中的蛋白酶抑制剂的另外的硼酸衍生物描述于US 4,963,655、US 5,159,060、WO 95/12655、WO 95/29223、WO 92/19707、WO 94/04653、WO 94/04654、US 5442100、US 5488157以及US 5472628中。
肽醛或酮
蛋白酶稳定剂可具有式：P-(A)y-L-(B)x-B0-R*，其中：
R*是H(氢)、CH3、CX3、CHX2或CH2X。优选地，R*＝H从而使得稳定剂是具有式P-(A)y-L-(B)x-B0-H的肽醛；
X是卤素原子，特别是F(氟)；
B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的L-或D-构型的单个氨基酸残基；
x是1、2或3；
Bx独立地是各自经由其C-末端连接到下一个B或连接到B0上的单个氨基酸残基；
L不存在或独立地是具有式-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝S)-C(＝S)-或-C(＝S)-C(＝O)-的连接基团；
如果L不存在，则A不存在或独立地是经由氨基酸的N-末端连接到L上的单个氨基酸残基；
P选自由以下组成的组：氢，或者如果L不存在，则N-末端保护基团；
y是0、1或2，
R独立地选自由以下组成的组：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
R'独立地选自由以下组成的组：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；并且
R”是C1-6烷基基团。
x可以是1、2或3并且因此B对应地可以是1、2或3个氨基酸残基。由此，B可以代表B1、B2-B1或B3-B2-B1，其中B3、B2和B1各自代表一个氨基酸残基。y可以是0、1或2，因此A可以不存在，或者是分别具有式A1或A2-A1的1或2个氨基酸残基，其中A2和A1各自代表一个氨基酸残基。
B0可以是经由氨基酸的C-末端连接到H上的、具有L-或D-构型的单个氨基酸残基。B0具有式–NH-CH(R)-C(＝O)-，其中R是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基侧链，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基或苄基，并且其中R可以任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代。B0的具体实例是D-或L-形式的精氨酸(Arg)、3,4-二羟基苯丙氨酸、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、间酪氨酸、对酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。一个具体实施例是当B0是亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、对酪氨酸以及缬氨酸时。
经由氨基酸的C-末端连接到B0上的B1可以是脂肪族、疏水性和/或中性氨基酸。B1的实例是丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(Val)。B1的具体实例是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B1是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸时。
如果存在，经由氨基酸的C-末端连接到B1上的B2可以是脂肪族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。B2的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(Cpd)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(Val)。B2的具体实例是丙氨酸、精氨酸、卷须霉啶、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B2是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸时。
经由氨基酸的C-末端连接到B2上的B3(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。B3的实例是异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。B3的具体实例是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。
连接基团L可以不存在，或选自由以下组成的组：-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝S)-C(＝S)-或-C(＝S)-C(＝O)-。本发明的具体实施例是当L不存在或L是羰基基团-C(＝O)-时。
经由氨基酸的N-末端连接到L上的A1(如果存在)可以是脂肪族、芳香族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。A1的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(Cpd)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。A1的具体实例是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B2是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸时。
经由氨基酸的N-末端连接到A1上的A2残基(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。A2的实例是精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。A2的具体实例是苯丙氨酸和酪氨酸。
N-末端保护基团P(如果存在)可以选自甲酰基、乙酰基(Ac)、苄酰基(Bz)、三氟乙酰基、甲氧基丁二酰基、芳香族和脂肪族氨基甲酸乙酯保护基团，如芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲氧基羰基(Moc)、(氟甲氧基)羰基、苄氧基羰基(Cbz)、叔丁氧基羰基(Boc)以及金刚烷氧基羰基；对甲氧基苄基羰基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、对甲氧基苯基(PMP)、甲氧基乙酰基、甲基氨基羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、苄基磺酰基、甲基磷酰胺基(MeOP(OH)(＝O))和苄基磷酰胺基(PhCH2OP(OH)(＝O))。
在具有保护基团的三肽醛(即x＝2，L不存在并且A不存在)的情况下，P优选地是乙酰基、甲氧基羰基、苄氧基羰基、甲基氨基羰基、甲基磺酰基、苄基磺酰基以及苄基磷酰胺基。在具有保护基团的四肽醛(即x＝3，L不存在并且A不存在)的情况下，P优选地是乙酰基、甲氧基羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基以及甲基磷酰胺基。
合适的肽醛描述于WO 94/04651、WO 95/25791、WO 98/13458、WO 98/13459、WO98/13460、WO 98/13461、WO 98/13462、WO 07/141736、WO 07/145963、WO 09/118375、WO10/055052以及WO 11/036153中。更具体地，所述肽醛可以是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H、或MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H。用于在本发明的液体组合物中使用的优选的稳定剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、或其亚硫酸氢盐加合物，其中Cbz是苄氧基羰基。
此类肽醛的另外的实例包括α-MAPI、β-MAPI、Phe-C(＝O)-Arg-Val-Tyr-H、Phe-C(＝O)-Gly-Gly-Tyr-H、Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Phe-H、Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Tyr-H、Phe-C(＝O)-Gly-Ala-L-H、Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Nva-H、Phe-C(＝O)-Gly-Ala-Nle-H、Tyr-C(＝O)-Arg-Val-Tyr-H、Tyr-C(＝O)-Gly-Ala-Tyr-H、Phe-C(＝S)-Arg-Val-Phe-H、Phe-C(＝S)-Arg-Val-Tyr-H、Phe-C(＝S)-Gly-Ala-Tyr-H、抗痛素、GE20372A、GE20372B、糜蛋白酶抑素A、糜蛋白酶抑素B以及糜蛋白酶抑素C。
亚硫酸氢盐加合物
蛋白酶稳定剂可以是上文所描述的肽醛的亚硫酸氢盐加合物，例如，如在WO2013/004636中所描述的。所述加合物可具有式P-(A)y-L-(B)x-N(H)-CHR-CH(OH)-SO3M，其中P、A、y、L、B、x和R如上文所定义的，M是H或碱金属，优选Na或K。一个优选的实施例是亚硫酸氢盐加合物，其中P＝Cbz，B2＝Gly；B1＝Ala；B0＝Tyr(因此R＝PhCH2，R’＝OH)，x＝2，y＝0，L＝A＝不存在且M＝Na。
肽醛或亚硫酸氢盐加合物
蛋白酶稳定剂可以是具有式P-B2-B1-B0-H的醛或具有式P-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的加合物(还参见WO 2013/004636)，其中
a)H是氢；
b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的L-或D-构型的单个氨基酸残基；
c)B1和B2独立地是单个氨基酸残基；
d)R独立地选自由以下组成的组：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
e)R'独立地选自由以下组成的组：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；
f)R”是C1-6烷基基团；并且
g)P是N-末端保护基团。
组分b)至g)可以如上文所描述的进行选择。
亚硫酸氢盐加合物的水溶液可以通过将对应的肽醛与亚硫酸氢钠(sodiumhydrogen sulfit或NaHSO3)的水溶液、亚硫酸氢钾(KHSO3)通过已知方法进行反应来制备，例如，如在WO 98/47523；US 6,500,802；US 5,436,229；J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志](1978)100,1228；Org.Synth.,Coll.[有机合成文集]卷7:361中所描述的。
上述肽醛(或亚硫酸氢盐加合物)与所述蛋白酶的摩尔比可以是至少1:1或1.5:1，并且它可以小于1000:1，更优选小于500:1，甚至更优选从100:1至2:1或从20:1至2:1，或最优选的，摩尔比是从10:1至2:1。
甲酸盐(例如，甲酸钠)和甲酸也示出了作为蛋白酶活性抑制剂的良好作用。甲酸盐可以与上述蛋白酶抑制剂协同使用，如在WO 2013/004635中所示。甲酸盐可以按至少0.1％w/w或0.5％w/w，例如至少1.0％、至少1.2％或至少1.5％的量存在于小袋组合物中。所述量典型地低于5％w/w，低于4％或低于3％。
在实施例中，所述蛋白酶为金属蛋白酶而所述抑制剂为金属蛋白酶抑制剂，例如，基于蛋白质水解物的抑制剂(例如，如在WO 2008/134343中所描述的)。
所述小袋中的材料还可以含有酶抑制剂和本身对酶提供稳定性的其他材料。优选的添加剂包括Z-GAY-H，及其亚硫酸氢盐形式；和4-FPBA。Z-GAY-H是Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4pOH)CHO，其中Cbz是苄氧基羰基。4-FPBA是4-甲酰基苯基硼酸。
在本发明中可以使用多种不同类型的酶，如传统上用于洗涤剂组合物中的那些。这些可包括蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和/或淀粉酶。所述小袋可以含有一种形式的酶，或者可以在同一小袋中含有多于一种类型的酶。
酶优选为喷雾干燥的。为了制备所述小袋，提供了固体形式的酶。这可以通过喷雾干燥液体形式的酶(如酶的溶液)来制备。溶液可含有除酶之外的组分。另一种方法是将酶溶液喷雾干燥，然后向喷雾干燥的固体中添加一种或多种添加剂。这种方法提供喷雾干燥的粉末，其可以与任何所希望的添加剂混合，然后放入小袋中。所述小袋可以是预成形的，或者可以按连续成形、填充和密封过程以形成包含含酶材料的小袋来形成。一旦形成，所述小袋就提供了稳定的和经预测量的酶形式，然后可以将其用于制备含酶组合物，如含酶洗涤剂组合物。
为了形成含酶洗涤剂组合物，可以将小袋添加到水性组合物，(如水性洗涤剂组合物)中。然后所述小袋将溶解以释放内容物，使酶在整个最终组合物中扩散。溶解可以在任何所希望的温度(如在室温或在升高的温度，如在约40℃或约60℃)实现。搅动(优选通过搅拌)提供了有效的方式来帮助所述过程。理想地，溶解时间应该相对较短，如从几分钟到几小时。理想地，所述小袋将在小于1小时(优选小于30分钟，并且更优选小于15分钟)内溶解。这种相对短的时间段将允许在制备洗涤剂组合物的传统方法中使用。然后可以按常规方式处理所得的含酶组合物，例如通过包装到准备出售的容器中等等。
含酶材料可包含一种或多种添加剂以提供各种功能或益处。例如，含酶材料可包含表面活性剂，其可有助于将酶溶解于洗涤剂组合物中。表面活性剂可以是非离子型表面活性剂，优选聚氧乙烯烷基醚表面活性剂。聚氧乙烯烷基醚表面活性剂优选是SoftanolTM表面活性剂(可从英力士氧化物公司(Ineos Oxide)获得)，优选SoftanolTM90。
小袋的内容物可含有多元醇，如甘油、(单、二或三)丙二醇、糖醇(如山梨醇)、聚丙二醇(PPG)或聚乙二醇(PEG)。分子量在200至1000范围内的聚乙二醇是在本发明中使用的优选的多元醇，特别优选PEG300和PEG400。已发现这些材料提供的益处包括帮助酶溶解于洗涤剂组合物中。
优选地，组合物含有0.5％至90％w/w的活性酶蛋白，更优选1％至90％w/w、更优选5％至90％w/w、更优选5％至50％w/w的活性酶蛋白。
一种或多种微生物
微生物可以是一种或多种真菌、酵母或细菌；如脱水细菌或酵母。
在一个实施例中，微生物是微生物孢子(与营养细胞相对)，如细菌(内生)孢子；或真菌孢子、分生孢子、菌丝。
特别优选的是芽孢杆菌内生孢子，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和/或巨大芽孢杆菌的内生孢子。
洗涤剂组合物
本发明的含酶小袋可以添加到任何形式的任何洗涤剂组合物(如液体洗涤剂，以及皂和洗涤剂条(例如合成洗涤剂条))中并由此形成其一部分。在添加本发明的酶小袋后，所述洗涤剂组合物包含所述小袋的壁的水溶性聚合物，如聚(乙烯醇)(PVA)。
如上文所描述的含酶小袋可以按对应于从0.0001％至5％(w/w)活性酶蛋白(AEP)；优选从0.0005％至5％，更优选从0.0005％至2％，更优选从0.0005％至1％，甚至更优选从0.001％至1％，并且最优选从0.005％至1％(w/w)活性酶蛋白的量添加到液体洗涤剂组合物中。
所述液体洗涤剂组合物具有物理形式，它不是固体(或气体)。它可以是可倾流的液体，糊剂，可倾流的凝胶或不可倾流的凝胶。它可以是各向同性的或结构性的，优选各向同性的。它可以是一种配制品，用于在自动洗衣机中洗涤或用于手洗、或用于(自动)餐具洗涤。它还可以是个人护理产品，如个人护理产品洗发水、牙膏、或洗手皂。
所述液体洗涤剂组合物能够溶解本发明的小袋并且可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％和高达95％的水，例如高达70％的水，高达50％的水，高达40％的水，或高达30％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以包含于水性液体洗涤剂中。水性液体洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
洗涤剂组分的选择可以包括(用于纺织品护理)有待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
表面活性剂
所述洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或兼性离子型、或其混合物。在具体实施例中，所述洗涤剂组合物包含一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。所述一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择所述一种或多种表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％(如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约20％至约25％)的阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0.1％至约10％的阳离子型表面活性剂。阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％(例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、或从约8％至约12％)的非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0.1％至约20％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当包含在其中时，所述洗涤剂将通常包含按重量计从约0.1％至约10％的兼性离子型表面活性剂。兼性离子型表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
水溶助剂
水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构通常不利于自发性自聚集，参见例如由Hodgdon和Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体&界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高黏度。
所述洗涤剂可以包含按重量计0-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
所述洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％(如约5％至约50％)的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg离子的水溶性复合物的螫合试剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括柠檬酸盐、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-硝基三乙醇)和羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
所述洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-50％(如约5％至约30％)的洗涤剂共助洗剂或其混合物。所述洗涤剂组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如柠檬酸助洗剂)的组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二磷酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基磷酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基磷酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％(如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。所述聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575以及US 5,955,415中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，所述洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如如WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO2005/03276以及EP 1876226(通过引用并入本文)中所描述的。洗涤剂组合物优选包含从0.0001％w/w至0.2％w/w的织物调色剂。合适的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO2007/087243中。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括上文提到的酶稳定剂/抑制剂、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉状洗涤剂]，Surfactant scienceseries[表面活性剂科学系列]，第71卷，Marcel Dekker,Inc[马塞尔德克尔公司]中。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按所述组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地含有另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，所述增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选的是荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals andChemicals)供应。适合用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01、从0.05、从约0.1的较低水平或甚至从约0.2％w/w至0.5或甚至0.75％w/w的较高水平。
污垢释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些污垢释放聚合物帮助从织物，如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉状洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至所述核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中详细描述的(通过引用并入本文)。此外，随机接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(通过引用并入本文)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP 1867808或WO 2003/040279中所描述的那些(将二者都通过引用并入本文)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
流变改性剂是结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自由以下组成的组：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如，如在EP2169040中所示。
其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
漂白系统
组合漂白剂和酶的液体洗涤剂的实例包括，例如US 5,275,753和WO 99/00478。洗涤剂可以含有0-50％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂如MnTACN、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠，预成型过酸及其混合物。
本发明的一些实施例包括：
实施例1.一种小袋，所述小袋包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物，并且所述室含有包含酶或微生物的颗粒固体以及包含表面活性剂和/或多元醇的液体。
实施例2.根据实施例1所述的小袋，所述小袋的重量大于50g。
实施例3.根据实施例1所述的小袋，所述小袋的重量大于100g。
实施例4.根据实施例1所述的小袋，所述小袋的重量大于250g。
实施例5.根据实施例1所述的小袋，所述小袋的重量大于500g。
实施例6.根据实施例1-5中任一项所述的小袋，所述小袋的重量小于25kg。
实施例7.根据实施例1-5中任一项所述的小袋，所述小袋的重量小于10kg。
实施例8.根据实施例1-5中任一项所述的小袋，所述小袋的重量小于5000g。
实施例9.根据实施例1-5中任一项所述的小袋，所述小袋的重量小于1000g。
实施例10.根据实施例1-9中任一项所述的小袋，其中所述室的内容物含有至少10％w/w的颗粒固体。
实施例11.根据实施例1-9中任一项所述的小袋，其中所述室的内容物含有至少20％w/w的颗粒固体。
实施例12.根据实施例1-9中任一项所述的小袋，其中所述室的内容物含有至少30％w/w的颗粒固体。
实施例13.根据实施例1-9中任一项所述的小袋，其中所述室的内容物含有至少40％w/w的颗粒固体。
实施例14.根据实施例1-9中任一项所述的小袋，其中所述室的内容物含有至少50％w/w的颗粒固体。
实施例15.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，所述小袋包含大于1％w/w的活性酶蛋白。
实施例16.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，所述小袋包含大于5％w/w的活性酶蛋白。
实施例17.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，所述小袋包含大于10％w/w的活性酶蛋白。
实施例18.根据实施例1-17中任一项所述的小袋，所述小袋包含小于90％w/w的活性酶蛋白。
实施例19.根据实施例1-17中任一项所述的小袋，所述小袋包含小于50％w/w的活性酶蛋白。
实施例20.根据实施例1-19中任一项所述的小袋，其中所述酶选自蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、DNA酶、过水解酶、氧化还原酶(例如漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)。
实施例21.根据实施例1-19中任一项所述的小袋，其中所述酶选自蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、和/或DNA酶。
实施例22.根据实施例1-19中任一项所述的小袋，其中所述酶是蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶。
实施例23.根据实施例1-22中任一项所述的小袋，其中所述固体包含喷雾干燥的酶。
实施例24.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是细菌、真菌或酵母。
实施例25.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是脱水细菌或酵母。
实施例26.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是微生物孢子。
实施例27.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是细菌(内生)孢子。
实施例28.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是芽孢杆菌内生孢子。
实施例29.根据实施例1-14中任一项所述的小袋，其中所述微生物是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的内生孢子。
实施例30.根据实施例1-29中任一项所述的小袋，其中所述壁包含PVA。
实施例31.根据实施例30所述的小袋，其中所述PVA的水解度为从约75％至约99％。
实施例32.根据实施例1-31中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度大于20μm。
实施例33.根据实施例1-31中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度大于50μm。
实施例34.根据实施例1-31中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度大于100μm。
实施例35.根据实施例1-34中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度小于5000μm。
实施例36.根据实施例1-34中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度小于3000μm。
实施例37.根据实施例1-34中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度小于2000μm。
实施例38.根据实施例1-34中任一项所述的小袋，其中所述壁的厚度小于1000μm。
实施例39.根据实施例1-38中任一项所述的小袋，所述小袋包含多于一种酶。
实施例40.根据实施例1-39中任一项所述的小袋，所述小袋包含多于一个室。
实施例41.根据实施例1-40中任一项所述的小袋，其中所述表面活性剂包含非离子型表面活性剂。
实施例42.根据实施例1-41中任一项所述的小袋，其中所述表面活性剂包含聚氧乙烯烷基醚表面活性剂或醇乙氧基化物表面活性剂。
实施例43.根据实施例1-42中任一项所述的小袋，其中所述表面活性剂是SoftanolTM表面活性剂。
实施例44.根据实施例1-43中任一项所述的小袋，其中所述多元醇包含甘油。
实施例45.根据实施例1-44中任一项所述的小袋，其中所述多元醇包含(单、二或三)丙二醇。
实施例46.根据实施例1-45中任一项所述的小袋，其中所述多元醇包含糖醇，如山梨醇。
实施例47.根据实施例1-46中任一项所述的小袋，其中所述多元醇包含聚乙二醇，优选分子量在200至800的范围内的聚乙二醇。
实施例48.根据实施例1-47中任一项所述的小袋，其中所述多元醇包含聚丙二醇，优选分子量在200至800范围内的聚丙二醇。
实施例49.根据实施例1-48中任一项所述的小袋，其中所述室进一步含有一种或多种添加剂。
实施例50.根据实施例49所述的小袋，其中所述一种或多种添加剂包含酶抑制剂。
实施例51.根据实施例50所述的小袋，其中所述酶是蛋白酶且所述酶抑制剂是肽醛蛋白酶抑制剂，如Z-GAY-H。
实施例52.根据实施例50所述的小袋，其中所述酶是蛋白酶且所述酶抑制剂是硼酸蛋白酶抑制剂，如4-FPBA。
实施例53.根据实施例50或51所述的小袋，其中所述添加剂包含蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂具有式P-(A)y-L-Bx-B0-R*或其亚硫酸氢盐加合物，其中：
a)R*是H(氢)、CH3、CX3、CHX2或CH2X；
b)X是卤素原子；
c)B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的单个氨基酸残基；
d)x是1、2或3；
e)Bx(B1、B2、B3)独立地是各自经由其C-末端连接到下一个B或连接到B0上的单个氨基酸残基；
f)L不存在或独立地是具有式-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝S)-C(＝S)-或-C(＝S)-C(＝O)-的连接基团；
g)如果L不存在，则A不存在或独立地是经由氨基酸的N-末端连接到L上的单个氨基酸残基；
h)P选自由以下组成的组：氢，或者如果L不存在，则N-末端保护基团；
i)y是0、1或2；
j)R独立地选自由以下组成的组：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
k)R'独立地选自由以下组成的组：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；和
l)R”是C1-6烷基基团；
m)x可以是1、2或3。
实施例54.根据实施例53所述的小袋，其中x＝2，L不存在，A不存在，且P是对甲氧基羰基(Moc)或苄氧基羰基(Cbz)。
实施例55.根据实施例50或51所述的小袋，其中所述酶抑制剂是具有式P-B3-B2-B1-B0-H的肽醛或具有式P-B3-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的亚硫酸氢盐加合物，其中
a)H是氢；
b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的单个氨基酸残基；
c)B1和B2独立地是单个氨基酸残基；
d)B3是单个氨基酸残基，或不存在；
d)R独立地选自由以下组成的组：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
e)R'独立地选自由以下组成的组：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；
f)R”是C1-6烷基基团；
g)P是N-末端保护基团；和
h)M为H或碱金属，优选Na或K。
实施例56.根据实施例50或51所述的小袋，其中所述酶抑制剂是具有式P-B2-B1-B0-H的肽醛或具有式P-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的亚硫酸氢盐加合物，其中
a)H是氢；
b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(＝O)-的单个氨基酸残基；
c)B1和B2独立地是单个氨基酸残基；
d)R独立地选自由以下组成的组：任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基；
e)R'独立地选自由以下组成的组：卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(＝N)NH2；
f)R”是C1-6烷基基团；
g)P是N-末端保护基团；和
h)M为H或碱金属，优选Na或K。
实施例57.根据实施例50或51所述的小袋，其中所述酶抑制剂是具有式P-B2-B1-B0-H的肽醛或具有式P-B2-B1-B0-SO3M的亚硫酸氢盐加合物，其中
a)H是氢；
b)B0是Phe、Tyr或Leu；
c)B1和B2独立地是单个氨基酸残基；
d)P是N-末端保护基团；和
e)M是H或碱金属，优选Na或K。
实施例58.根据实施例53-55中任一项所述的小袋，其中B3是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。
实施例59.根据实施例58所述的小袋，其中B3是亮氨酸、苯丙氨酸、或酪氨酸。
实施例60.根据实施例53-56中任一项所述的小袋，其中B0是亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、对酪氨酸或缬氨酸。
实施例61.根据实施例60所述的小袋，其中B0是亮氨酸、苯丙氨酸、或对酪氨酸。
实施例62.根据实施例53-61中任一项所述的小袋，其中B1是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
实施例63.根据实施例53-62中任一项所述的小袋，其中B2是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。
实施例64.根据实施例63所述的小袋，其中B2是精氨酸、甘氨酸、或缬氨酸。
实施例65.根据实施例55-64中任一项所述的小袋，其中P是对甲氧基羰基(Moc)或苄氧基羰基(Cbz)。
实施例66.根据实施例50所述的小袋，其中所述酶抑制剂是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H、或MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H，或这些中任一种的亚硫酸氢盐加合物，其中Cbz是苄氧基羰基，并且Moc是甲氧基羰基。
实施例67.根据实施例50所述的小袋，其中所述酶抑制剂是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、或PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H，或这些中任一种的亚硫酸氢盐加合物，其中Cbz是苄氧基羰基，并且Moc是甲氧基羰基。
实施例68.根据实施例50所述的小袋，其中所述酶抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H或Moc-Val-Ala-Leu-H，或其亚硫酸氢盐加合物，其中Cbz是苄氧基羰基，并且Moc是甲氧基羰基。
实施例69.一种制备小袋的方法，所述方法包括形成壁，所述壁形成室，所述壁包含水溶性聚合物；在所述室中提供包含酶的颗粒固体，和包含表面活性剂和/或多元醇的液体；并密封所述室以形成所述小袋。
实施例70.根据实施例69所述的方法，其中所述小袋是如实施例1-68中任一项所定义的。
实施例71.根据实施例69或70所述的方法，使用成型填充密封机进行所述方法。
实施例72.一种制备含酶的洗涤剂组合物的方法，所述方法包括将小袋添加到水性组合物中，其中所述小袋包含形成室的壁，所述壁包含水溶性聚合物，并且所述室含有包含酶的颗粒固体以及包含表面活性剂和/或多元醇的液体。
实施例73.根据实施例72所述的方法，其中将所述小袋添加到包含一种或多种洗涤剂成分如表面活性剂和/或助洗剂的水性组合物中。
实施例74.根据实施例72或73所述的方法，其中所述小袋是如实施例1-68中任一项所定义的。
实施例75.根据实施例72-74中任一项所述的方法，其中搅动所述水性组合物以帮助所述小袋的溶解。
实施例76.一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物可通过根据实施例72-75中任一项所述的方法获得。
实施例77.一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含表面活性剂和/或助洗剂、PVA和至少50％的水。
进一步通过以下实例来描述本发明，所述实例不应理解为限制本发明的范围。
实例
优选地，酶小袋是含有与配制品成分混合的喷雾干燥的酶粉末的PVA袋。
已经发现PVA膜特别有益于产品的安全性。
任选的配制品化学品的一个功能是润湿喷雾干燥的产品以避免酶粉尘并促进酶粉末的给药和处理。此外，任何此类配制品化学品都不应将酶粉末溶解在PVA膜内。由于PVA膜是水溶性的，因此酶小袋配制品中低含水量(例如，小于约5％，优选小于约3％)是优选的。
配制品成分：
蛋白酶的酶浓缩物的喷雾干燥的粉末
SoftanolTM90
PEG300和PEG400
蛋白酶抑制剂(在实例中也简称为“抑制剂”)：
Cbz-Gly-Ala-NHCH(CH2C6H4pOH)CH(OH)(SO3)Na，其中Cbz是苄氧基羰基(肽醛的亚硫酸氢盐(hydrosulfite/bisulfite)形式)。
实例中使用的蛋白酶是具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的SavinaseTM。
小袋/袋生产程序
用于制备本发明的酶小袋/袋的典型程序如图1所示。首先，将液体酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等)浓缩物喷雾干燥，以得到粉末。然后通过将添加剂、稳定剂(如多元醇、表面活性剂和/或抑制剂)和喷雾干燥的粉末均匀混合在一起来产生润湿的混合物。在此阶段，润湿的混合物的稠度可能非常粘稠。然后，将湿润的混合物置于模具中/一片水溶性膜(如PVA膜)上，然后将酶混合物密封(例如使用另一片膜)以形成小袋。可以在小袋中包含任何所希望的量的润湿混合物。便利地，从约10％-70％的混合物可以是固体形式(作为粉末/颗粒)。混合物的含水量优选低于10％w/w，并且如果添加盐以提供更高的离子强度，则水含量可高达15％。
制备和测试以下配制品以评估含酶袋(袋1、袋2、袋3和袋4)的物理和酶稳定性。
表1.酶袋中的混合物的配制品(百分比为基于袋中配制品的w/w)。每个袋中的混合物重量为约2-3克。
实例1
储存后酶袋产品中混合物的物理稳定性
与常规液体或固体产品不同，本发明的酶袋产品不像液体产品那样具有混浊或沉淀担忧。也没有像传统固体产品那样的酶粉尘问题。酶袋的物理稳定性与PVA袋的安全性和酶可能从袋中泄漏密切相关。在40℃储存13周后，酶袋2(图2所示)看起来与新鲜样品相似，但是仅有非常轻微的颜色变化。没有观察到PVA膜的泄漏和变形。
实例2
储存后酶袋产品中混合物的酶稳定性
袋(袋1、袋2、袋3)中的酶混合物是高度稳定的，如表2中所示。
表2.酶袋的内容物混合物的酶稳定性
在40℃储存13周(13W40℃)后的剩余活性高于90％，而在50℃储存13周(13W50℃)后的剩余活性为约80％-90％。
实例3
将酶袋产品中的混合物溶解于商业洗涤剂中
通过将袋1-4的内容物(“混合物”)在室温溶解在不同的洗涤剂中并伴随磁转子搅拌(600rpm)来进行溶解测试。选择三种洗涤剂作为新兴市场液体洗涤剂的代表(一种是中国标准洗涤剂基料(1％皂、3.8％LAS、0.4％TEA、8％AES、4％AEO9、2％柠檬酸钠、0.02％CaCl2·H2O，使用DI水(pH8)加至100％)，洗涤剂1。另外两种是中国商业洗涤剂：洗涤剂2和洗涤剂3。所有三种洗涤剂中含有的表面活性剂符合中国国家标准的要求(总表面活性剂>15％)。
混合物的剂量(0.08％w/w)等同于洗涤剂中相关液体酶产品的较高剂量(0.5％w/w)。
表3.袋4的内容物混合物溶解于三种洗涤剂中所需要的时间
*溶解时间从添加混合物开始直至完全溶解且没有任何混浊和沉淀。
当在室温搅拌时，袋4的内容物混合物需要超过2小时以完全溶解于洗涤剂中。
表4.袋1至袋3的内容物混合物在室温溶解于三种洗涤剂中所需要的时间
袋1的混合物需要约20-40分钟以完全溶解于洗涤剂中。袋2和袋3的混合物(其含有如表1所示的PEG300或PEG400)溶解快很多。袋2和袋3的混合物在5分钟内快速溶解在所有三种洗涤剂中。因此，特别是聚乙二醇以及抑制剂的存在促进了袋的内容物混合物在洗涤剂中非常快速溶解。
实例4
酶袋在商业洗涤剂中的基质稳定性
在三种洗涤剂中测试了袋1-3的内容物(“混合物”)的酶稳定性。一种是中国标准洗涤剂基料：洗涤剂1。另外两种是中国商业洗涤剂：洗涤剂2和洗涤剂3。所有三种洗涤剂中含有的表面活性剂符合中国国家标准的要求(>15％表面活性剂)。将1％的甲酸钠和0.06％的CaCl2预先添加到洗涤剂中作为稳定剂。
基质稳定性意指洗涤剂中的酶稳定性。在三种洗涤剂中研究了袋2和袋3的内容物混合物。混合物的剂量(0.03％w/w)等同于洗涤剂中相关液体酶产品的正常剂量(0.2％w/w)。
表5.酶袋在不同洗涤剂中的基质稳定性
在4W37℃储存后，洗涤剂中酶的剩余活性足够高以被认为是工业上可接受的。液体洗涤剂中的混合物的酶稳定性至少等同于常规液体酶产品配制品。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 包封的固体酶产品
<130> 13175-WO-PCT
<160> 10
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 迟缓芽胞杆菌（Bacillus lentus）
<400> 1
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 1015
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
202530
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
354045
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
505560
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65707580
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
859095
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 2
Leu Gly Ala Tyr
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 3
Phe Gly Ala Tyr
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Tyr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 4
Tyr Gly Ala Tyr
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Phe; MeO-CO-Phe; MeSO2-Phe;或EtSO2-Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Leu-H
<400> 5
Phe Gly Ala Leu
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Phe或MeO-CO-Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 6
Phe Gly Ala Phe
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 7
Phe Gly Val Tyr
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Met-H
<400> 8
Phe Gly Ala Met
1
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基-Trp
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Tyr-H
<400> 9
Trp Leu Val Tyr
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 枯草杆菌蛋白酶抑制剂
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> MeO-P(OH)(O)-Leu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> Leu-H
<400> 10
Leu Gly Ala Leu
1
