一种酶促全自动化学发光通用洗液
技术领域
本发明属于医疗器械体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种酶促全自动化学发光通用洗液。
背景技术
化学发光免疫分析技术是将高灵敏度的发光检测系统和高特异性的免疫反应相结合，用于各种半抗原、抗原、抗体、激素、酶、维生素、脂肪酸等的定量检测分析。发光检测系统是利用化学物质经催化氧化形成激发态的中间体，当激发态的中间体回到基态时会释放光子，进而被光电倍增管检测到。免疫反应是将特异性的抗体与抗原反应，形成免疫复合物，免疫复合物上的标记物通过催化底物发光或直接受激发而发光，从而达到对待检物质的定量。
磁微粒全自动化学发光分析仪正是基于以上原理研制而成，能够实现无人值守、全天候样本随到随检，大大减轻了临床检验医师的工作量，是目前医院临床检验应用最多的仪器之一。
目前发光体系主要分为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶催化的辉光体系，ABEI、吖啶酯等标记的闪光体系，以及三联吡啶钌标记的电化学发光体系。无论何种全自动化学发光免疫分析仪均需要配备相对应的清洗液，才能保证反应过程中洗净杂质及污染物，进而保证检验结果的准确性。
目前国内外各大主流发光厂家的发光洗液仅为自己的发光体系服务，不对外开放，一般均和发光仪捆绑销售，导致价格十分昂贵。虽然有少量厂家开发洗液，但多是针对某一厂家进行定向替换，不具有通用性。全封闭系统使得临床检验机构一旦采购相关厂家的发光仪器后，必须采购对应厂家的整套试剂，检验机构处于较被动的地位，议价能力较低。检验机构由于样本量大，劳动强度较高，为了保证检验结果的准确性，亦无暇开发对应发光体系的洗液。发光试剂中特异性的抗体对及单分散的磁微粒开发难度较大，目前多依赖进口，相对而言用量较大的发光洗液的开发更为简单。但由于捆绑销售，导致洗液售价亦十分昂贵，加重了患者的检测成本。
CN105754733A公开了一种化学发光用清洗液，主要由二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、表面活性剂、防腐剂及水构成。该清洗液采用较高浓度的磷酸盐，这会抑制碱性磷酸酶的活性，不适用于碱性磷酸酶发光平台。并且仅为一种清洗液，难以灭活发光仪的管路系统及加样针模块的污染源，发光仪仍然存在被污染的可能性。
CN107118865A公开了一种针对酶促化学发光和直接化学发光的通用洗液，主要成分为磷酸盐、氯化钠、胆酸钠、表面活性剂、防腐剂及水。发明者仅验证了直接化学发光平台的使用效果，并没有验证碱性磷酸酶平台。采用较高浓度的磷酸盐同样会抑制碱性磷酸酶的活性，且也仅为单一的一种洗液，未考虑到发光仪加样针及管路的清洗维护。
发明内容
本发明的目的在于针对酶催化全自动化学发光仪的加样针模块、管路系统及磁分离模块进行系统研究，根据各模块使用目的的不同，有针对性的提供了一种酶促全自动化学发光通用洗液，该洗液包括3种洗液。将3种洗液联合使用，克服了单一洗液洗涤不彻底的问题，最大限度降低全自动化学发光仪被污染的可能性，不仅能确保检验结果准确，还能为医院降低试剂采购成本。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酶促全自动化学发光通用洗液，由洗液A、洗液B和洗液C组成；
所述洗液A包括无机盐、表面活性剂及生物防腐剂；所述无机盐为Tris、NaCl、HEPES、MES中的至少一种；所述表面活性剂为Tween-20、Triton%20X-100中的至少一种；
所述洗液B包括无机盐、表面活性剂及生物防腐剂；所述无机盐为Tris、NaCl、HEPES、MES、磷酸盐中的至少一种；所述表面活性剂为Tween-20、Triton%20X-100中的至少一种；
所述洗液C包括次氯酸钠。
酶催化化学发光体系由于原料易得，光值信号稳定，检测灵敏度高，在市场中占有重要地位。免疫反应完成，磁珠捕获免疫复合物后，需要多次脱磁清洗以除去游离的酶蛋白及反应杂质，发光仪需要定期的对管路系统及加样针模块进行有效清洗，从而避免各项目间的交叉污染，从而保证最终检验结果的准确性。
本发明的通用洗液与市面上现有的单独一种洗液不同，本发明中的3种清洗液分别针对全自动化学发光分析仪加样针模块、磁分离模块及管路系统模块进行有效清洗，最大限度降低仪器受污染的可能性，进而保证检验结果的准确性，帮助检验机构降低试剂采购成本，为患者的减轻就诊负担。
本发明的洗液A和B均采用常规的原料Tris(三羟甲基氨基甲烷)、NaCl(氯化钠)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、PBS(磷酸盐)等配置，并添加常规的表面活性剂，加强洗涤效果。制备所用的各基础原料均价廉、易得、毒性低。
次氯酸钠作为常规的消毒剂，危害小，原料易得。
优选地，所述洗液A中的无机盐浓度为50～300mM/L，表面活性剂质量体积浓度为0.1～1％，生物防腐剂质量体积浓度为0.05～0.2％。
本发明的采用的盐浓度在合适范围内，一方面能够保持蛋白活性，另一方面可以提高洗涤效果。过高的盐浓度会让蛋白变性失活，盐浓度太低又会降低洗液的溶解能力，导致洗涤不彻底。
优选地，所述洗液B中的无机盐浓度为50～200mM/L，表面活性剂质量体积浓度为0.05～0.2％，生物防腐剂质量体积浓度为0.05～0.2％。本发明洗液A仅针对磁分离模块进行清洗，一般表活浓度要比管路洗液浓度高，pH偏碱性范围，有助于保护碱性磷酸酶的活性。洗液B仅针对管路系统进行清洗，表活浓度相对低些，pH在偏酸性范围，要求能够有效抑制碱性磷酸酶活性。
优选地，所述洗液C中的次氯酸钠为有效氯含量在200～500mg/L。加样针冲洗液C采用该浓度的次氯酸钠溶液，能够有效杀灭生物活性物质，防止交叉污染的潜在风险。
优选地，所述洗液A的pH为7.0～8.0。
本发明的洗液A仅针对磁分离模块进行清洗，一般表活浓度要比管路洗液浓度高，pH偏碱性范围，有助于保护碱性磷酸酶的活性。优选地，所述洗液B的pH为6.0～7.0。洗液B仅针对管路系统进行清洗，表活浓度相对低些，pH在该酸性范围内，能够有效抑制碱性磷酸酶活性。
优选地，所述洗液C的pH为10～11。洗液C针对加样针上的残留污渍，需要对其进行彻底灭活，采用强碱性、氧化能力较强的次氯酸可以让蛋白迅速变性失活，杜绝生物活性污染。
优选地，所述洗液A的生物防腐剂为Proclin%20300。脱磁洗液A中的防腐剂采用Proclin系列产品，该系列防腐剂相对于NaN3等毒性较小，使用更安全。传统脱磁清洗多用NaN3防腐，发光仪中金属材料铸造的洗液针残留过多的NaN3，存在爆炸的危险。
优选地，所述洗液B的生物防腐剂为Proclin%20300或NaN3。
优选地，洗液A包括以下浓度含量的组分：Tris%20100mM/L、NaCl%20150mM/L、质量体积浓度为0.1％的Tween-20和质量体积浓度为0.15％的Proclin%20300，所述洗液A的pH为7.5；
洗液B为全自动化学发光分析仪对应的管路清洗液，用于清洗管路中的残留污染物，洗液B包括以下浓度含量的组分：MES%2050mM/L、NaCl%20100mM/L、质量体积浓度为0.1％的Tween-20和质量体积浓度为0.1％的NaN3；所述洗液B的pH为6.5；
洗液C为有效氯浓度为200mg/L的次氯酸钠。
本发明的有益效果在于：相比原厂封闭洗液，本发明提供的洗液保质期更久，且3种洗液同时使用，能对发光仪加样针、管路系统及磁分离模块进行全方位清洗，从而有效去除加样针及管路模块的顽固污染源。本发明洗液对临床样本的检测结果与原试剂厂家的结果高度一致，能够满足临床检验的要求。洗液配方中所用的各基本试剂组分，在国内均容易获得，且均已工业化生产，这有助于降低医院检测成本，为患者减轻就诊负担。洗液成分相对简单，毒性较低，对操作人员和环境基本无危害。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的酶促全自动化学发光通用洗液的一种实施例，所述酶促全自动化学发光通用洗液由洗液A、洗液B和洗液C组成，其中；
洗液A为全自动化学发光分析仪中对应的脱磁清洗液，用于洗涤磁珠捕获的免疫复合物，除去磁珠表面非特异性吸附的杂蛋白及游离酶；洗液A包括以下浓度含量的组分：Tris%20100mM/L、NaCl%20150mM/L、Tween-20%200.1％(w/v)和Proclin%20300%200.15％(w/v)。
洗液A的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.5，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液B为全自动化学发光分析仪对应的管路清洗液，用于清洗管路中的残留污染物，洗液B包括以下浓度含量的组分：MES%2050mM/L、NaCl%20100mM/L、Tween-20%200.15％(w/v)和NaN3%200.1％(w/v)。
洗液B的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至6.5，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液C为全自动化学发光分析仪对应的加样针清洗液，洗液C为有效氯浓度为200mg/L的次氯酸钠；
配制方法：将有效氯含量80g/L的次氯酸钠母液用去离子水稀释400倍即得有效氯浓度为200mg/L的加样针清洗液，pH为10。
实施例2
本发明的酶促全自动化学发光通用洗液的一种实施例，所述酶促全自动化学发光通用洗液由洗液A、洗液B和洗液C组成，其中；
洗液A包括以下浓度含量的组分：MES%20150mM/L、NaCl%20150mM/L、Triton%20X-1000.1％(w/v)和Proclin%20300%200.15％(w/v)。
洗液A的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至6.5，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液B包括以下浓度含量的组分：PBS%20100mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.1％(w/v)和NaN3%200.1％(w/v)。
洗液B的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.0，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液C为全自动化学发光分析仪对应的加样针清洗液，洗液C为有效氯浓度为400mg/L的次氯酸钠；
配制方法：将有效氯含量80g/L的次氯酸钠母液用去离子水稀释200倍即得有效氯浓度为400mg/L的加样针清洗液，pH为10。
实施例3
本发明的酶促全自动化学发光通用洗液的一种实施例，所述酶促全自动化学发光通用洗液由洗液A、洗液B和洗液C组成，其中；
洗液A包括以下浓度含量的组分：Tris%2050mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.1％(w/v)和Proclin%20300%200.15％(w/v)。
洗液A的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.0，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液B包括以下浓度含量的组分：PBS%20100mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.1％(w/v)和NaN3%200.1％(w/v)。
洗液B的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.0，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液C为有效氯浓度为250mg/L的次氯酸钠；
配制方法：将有效氯含量80g/L的次氯酸钠母液用去离子水稀释320倍即得有效氯浓度为250mg/L的加样针清洗液，pH为10。
实施例4
本发明的酶促全自动化学发光通用洗液的一种实施例，所述酶促全自动化学发光通用洗液由洗液A、洗液B和洗液C组成，其中；
洗液A包括以下浓度含量的组分：HEPES%2050mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.1％(w/v)和Proclin%20300%200.05％(w/v)。
洗液A的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至8.0，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液B包括以下浓度含量的组分：Tris%20200mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.2％(w/v)和NaN3%200.2％(w/v)。
洗液B的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.5，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液C为有效氯浓度为500mg/L的次氯酸钠；
配制方法：将有效氯含量80g/L的次氯酸钠母液用去离子水稀释160倍即得有效氯浓度为500mg/L的加样针清洗液，pH为10。
实施例5
本发明的酶促全自动化学发光通用洗液的一种实施例，所述酶促全自动化学发光通用洗液由洗液A、洗液B和洗液C组成，其中；
洗液A包括以下浓度含量的组分：Tris%20300mM/L、NaCl%20150mM/L、Triton%20X-1001％(w/v)和Proclin%20300%200.2％(w/v)。
洗液A的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.5，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液B包括以下浓度含量的组分：HEPES%20100mM/L、NaCl%20100mM/L、Triton%20X-1000.05％(w/v)和NaN3%200.05％(w/v)。
洗液B的配制方法：按上述配方称取试剂于烧杯中，加入800mL去离子水溶解均匀，调pH至7.0，将全部液体转入到1L容量瓶中，定溶至刻度线即可。
洗液C为有效氯浓度为400mg/L的次氯酸钠；
配制方法：将有效氯含量80g/L的次氯酸钠母液用去离子水稀释200倍即得有效氯浓度为400mg/L的加样针清洗液，pH为11。
实施例6
检验结果一致性验证
1、用实施例1配置的洗液A/B/C分别替换希森美康HISCL5000全自动化学发光分析仪中对应的原装洗液。取40位临床样本进行检验结果的一致性评价试验。实验结果如表1所示：
表1
结果显示，本发明的清洗液与希森美康HISCL5000原装洗液性能一致，可以进行替代。
2、用实施例2配置的洗液A/B/C分别替换泽成CIA600全自动化学发光分析仪中对应的原装洗液。取40位临床样本进行检验结果的一致性评价试验。实验结果如表2所示：
表2
结果显示，本发明的清洗液与泽成CIA600原装洗液性能一致，可以进行替代。
3、用实施例3配置的洗液A/B/C分别替换泽成CIA1800全自动化学发光分析仪中对应的原装洗液。取40位临床样本进行检验结果的一致性评价试验。实验结果如表3所示：
表3
实施例7
(一)加样针清洗液灭活污染物有效性验证
将发光仪加样针在1mg/ml的碱性磷酸酶溶液中浸泡10min，再悬空晾干30min。采用原装洗液和实施例1配置的洗液C分别进行3次清洗，每次清洗完后，用管路清洗液冲洗洗3次，然后用加样针吸取15ul灭活的无菌水与200μL碱性磷酸酶底物混匀，37℃温育1min后检测各自的发光值。结果如下表4所示：
表4
由表4可知，清洗液C能够有效灭活加样针表面干涸的污染物，经过洗液C的3次清洗，加样针表面已经不在残留污染物；但原装洗液洗涤的加样针表面依旧残留有大量碱性磷酸酶，导致底物发光值较高。综上可知加样针洗液能完全灭活加样针表面的污染源，从而保证检验结果的准确性。
(二)管路清洗液洗涤有效性验证
用100ng/ml的碱性磷酸酶溶液充满希森美康HISCL5000发光仪洗液管路5min，然后排空管路中的酶液，用仪器自带的原装洗液和实施例2配置的洗液B分别冲洗管路10次，用相同的AFP试剂分别检测梯度浓度的AFP校准品。对比两种洗液获得信号值的差异，数据见下表5：
表5
由数据可知实施例2中的管路清洗液B与仪器原装洗液具有相同的洗涤效果，能够清除管路系统上的污染源，2种洗液洗完后，采用相同试剂检测相同样本的的信号值基本相同，说明二者可以实现相互替代。
实施例8
洗液稳定性检验
将实施例1～5的3套洗液和原装洗液分别分装成多瓶保存，每季度末各取出一种，观察洗液色泽，并对相同浓度的PCT阳性质控品进行10次测试，考察各实施例洗液的保存稳定性。测试结果如下表6所示：
表6
由表6可知，实施例1～5的有效期均在24个月以上，在有效期内对同一浓度的质控品进行检测，CV％均小于10％，符合临床检验的要求。原装洗液在保存18个月后出现絮状沉淀，已经不能够使用。本发明的洗液可以对原装洗液进行替换，并且具有更久的保存期限。
实施例9
用100ng/ml的碱性磷酸酶溶液冲洗2台相同发光仪加样针模块、管路模块及磁分离洗液针模块，然后用实施例3的洗液A/B/C进行清洗以及原装洗液进行10次清洗。用相同的试剂检测梯度浓度的PCT样本，考察2种洗液洗涤效果，实验结果如表7所示：
表7
由表7结果可知，原装洗液清洗10次后仪器依然残存较多的碱性磷酸酶，检测低浓度样本时，发光值背景较高，拉不开梯度，导致试剂失效。本发明洗液基本洗净了仪器中的残余碱性磷酸酶，PCT在0-100ng/ml之间均有明显的信号梯度。本发明洗液采用3种洗液联合清洗，相对于单一的一种洗液，能够更有效的清除仪器各大模块的污染源，保障仪器和试剂的正常运行。
实施例10
用100ng/ml的碱性磷酸酶溶液冲洗3台相同发光仪加样针模块、管路模块及磁分离洗液针模块。然后对比单独用实施例3的洗液A清洗各模块、单独用实施例3的洗液B清洗各模块、用实施例3的配套洗液A/B/C分别清洗各模块的洗涤效果。用相同的试剂检测梯度浓度的PCT样本，考察2种洗液洗涤效果，实验结果如表8所示：
表8
由表8可知单独采用洗液A或者洗液B洗涤仪器所有模块，难以消除污染的碱性磷酸酶，导致最终检测结果无信号梯度，背景发光值异常高。采用3种洗液联合清洗可以有效去除各模块参留的污染物，测试结果梯度明显，仪器经清洗后能够满足临床使用需求。本发明洗液采用3种洗液联合清洗，相对于单一的一种洗液，能够更有效的清除仪器各大模块的污染源，保障仪器和试剂的正常运行。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
