一种巴豆精油的分离提取方法及应用
技术领域
本发明涉及生物化工及生物提取领域，更具体的涉及一种巴豆精油的分离提取方法及应用。
背景技术
巴豆属属于大戟科，属于大约1300种，广泛分布于热带和亚热带地区。巴豆(Croton tiglium L.)是巴豆属之一，其种子在中国大陆被称为“Badou”。植物的化学成分证明了不同疾病的所有用途和治疗方法。之前研究C.tiglium果实的化学成分的研究确定了不同类型的二萜，特别是从该物种中分离和评价了许多生物活性佛波酯(Bauer等，1983；Colburn等，1982；Hecker，1981；Marshall)et al。，1985)。以前的报道显示，巴豆精油具有泻药，镇痛，抗菌和炎症特性(Qiu，1996；Tsai等，2004)。在通过回流法获得的巴豆精油(CTEO)的甲基酯化样品中存在大量的亚油酸，油酸和二十碳烯酸(Mei等人，2012)。
精油也称挥发油，是一类存在于子物体中的有芳香气味在常温下能挥发可随水蒸气蒸馏出的油状液体的总称，广泛应用于化妆品香料以及医药工业。现有的挥发油提取方法有压榨法、溶剂法、水蒸汽蒸馏法和超临界二氧化碳萃取法。其中溶剂连续回流法的提取效率高，操作简单，溶剂使用量少；水蒸汽蒸馏法提取的挥发油纯度好，低沸点的挥发性成分较高，是目前生产中使用较多的提取挥发油的方法。巴豆油中含有的巴豆毒素(一种毒性蛋白质)为毒性成分，通过加热“制熟”可使其变性，失去活性，降低毒性，但是制熟温度较高会破坏巴豆中的巴豆苷的含量，影响但是传统的巴豆精油的制备方法对于现代应用来说显得繁琐复杂，且可控性差，用药安全得不到保障。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种巴豆精油的分离提取方法，以便于更好地利用巴豆植物资源，提高其经济效益，开发新型的天然香料。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种巴豆精油的分离提取方法，采用以下步骤：
(1)取巴豆果实，剥去果壳，得到巴豆种仁，将巴豆仁粉碎，处理；
(2)将步骤(1)处理后的巴豆仁粉末加入超临界提取容器中，向提取容器内输入超临界二氧化碳流体，在萃取压力为25Mpa、萃取温度的压力和35℃下进行萃取，萃取时间为1h；
(3)将萃取后的二氧化碳流体进入分离器中进行分离，二氧化碳的流量为2L/min，从分离器中排出的即为巴豆精油。
进一步地，步骤(1)所述的巴豆果实粉碎成粉末的颗粒大小为20-50目。
进一步地，步骤(2)所述的萃取时间1h为动态萃取30分钟后静态萃取30分钟。
进一步地，步骤(1)所述的处理的方法为：
(1)在巴豆仁粉中加入银合欢提取物冷冻干燥后，于湿度为20-25％、温度为40-50℃发生反应2-3小时；
(2)将反应后的巴豆仁粉与150-180Mpa压力下处理5-8min，的处理后的巴豆仁粉。
进一步地，步骤(1)所述的巴豆仁粉和银合欢提取物的质量比为10：1-1.5
进一步地，银合欢提取物的制备方法为：将银合欢和水混合均匀，于80-90℃提取1-2小时，浓缩，加入乙醇调乙醇度为75-80，静置过夜，离心，沉淀物冷冻干燥后，加入水得银合欢提取物；其中银合欢和水的质量比为1：20；干燥后的沉淀物和水的质量比为1：5。
一种上述分离提取方法制备的巴豆精油，GC-MS分析含有以下质量百分数的成分：36.73％17-十八烷酸、8.49％十四烷酸、8.17％17-十八烷酸甲酯、6.45％正十六烷酸、5.28％正癸酸、4.37％亚油酸酸乙酯和4.19％异戊基9-十八碳烯酸酯。
进一步地，上述GC-MS分析的条件为：分析在Agilent 6890B GC和5977A质量选择检测器(MSD；Agilent，Santa Clara，CA，USA)上进行，使用HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm膜厚；Restek Corporation，Bellefonte，PA，USA)；氦气以1mL/min的速度用作载气，具有以下温度程序：初始温度为100℃，以6℃/min的速率升至200℃，然后以4℃/min升至300℃并保持10分钟，总运行51.7分钟，样品(1μL)在280℃的温度下注射，分流比为1/70，历时1分钟，使用电离能量为70eV的电子碰撞电离系统和质量扫描范围为30-500m/z的电子电离谱。
一种上述的巴豆精油在制备治疗肺癌药物中的应用。
本发明采用银合欢提取物和巴豆仁粉一起冷冻干燥，在特定的条件下反应可以在保证巴豆精油的有效成分尽量保留的情况下，又能使巴豆毒素失去活性，降低毒性。
有益效果
(1)本发明既可以保证得到的巴豆精油有效成分尽量保留，巴豆资源得到充分利用，又能使巴豆毒素失去活性，降低毒性；
(2)本发明的制备工艺简单，易于操作；
(3)本发明制备的巴豆精油可以用于治疗肿瘤疾病，特别是对肺癌有两良好的治疗效果，且不良反应小，具备良好的临床应用潜力，可以产生巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为实施例2提取巴豆精油的形态学观察；
图2.为实施例2提取巴豆精油CTEO抑制A549细胞的活力。A.通过CCK-8测定检测CTEO处理48小时后A549细胞的存活率。B.将A549细胞用不同浓度(0-200μg/mL)的CTEO处理培养不同的时间点。通过CCK-8测定确定细胞活力。C.通过CCK-8测定检测CTEO处理48小时后HBE细胞的存活率。D.在暴露于不同浓度的CTEO(0,20,40和60μg/mL)后，并使集落生长10天，用集落形成测定法检测A549细胞的集落形成能力，E，F.CTEO处理后PCNA蛋白表达的Western印迹分析和定量，值代表三次独立实验的平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3.为实施例2提取巴豆精油CTEO抑制A549细胞的细胞周期进展，A-E，通过蛋白质印迹分析和定量检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中细胞周期相关蛋白cyclinA，cyclin B，CDK1和P21的表达。值代表三次独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4.为实施例2提取巴豆精油CTEO抑制A549细胞的迁移和侵袭能力；A，B划痕实验分析，用CTEO处理A549细胞，并用无菌200μL移液管进行划痕。Transwell侵袭试验。将细胞用CTEO所显示的浓度处理48小时。用Giemsa染色侵入基底膜的细胞。值代表三次独立实验的平均值±SD。与未处理的对照(剂量0)相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5.为实施例2提取巴豆精油CTEO抑制A549细胞中FAK的活性。A-C。通过蛋白质印迹分析和定量检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中FAK和p-FAK蛋白的表达。C.定量分析FAK与p-FAK蛋白表达的比率。值代表三次独立实验的平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图6.为实施例2提取巴豆精油CTEO以剂量依赖性方式促进A549细胞凋亡。A，B。通过流式细胞术检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞的凋亡情况，并进行定量。C-F。通过Western印迹分析和定量检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中BaX和BcL-2蛋白的表达。值代表三次独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7.为实施例2提取巴豆精油CTEO诱导A549细胞中的线粒体膜蛋白电位降低。A.通过JC-1染色分析检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中线粒体膜电位的变化。B，C。通过蛋白质印迹分析和定量检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中细胞色素C蛋白的表达。值代表三次独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图8.为实施例2提取巴豆精油CTEO通过A549细胞中caspase介导的途径诱导细胞凋亡。通过蛋白质印迹分析和定量检测不同浓度CTEO处理48小时后A549细胞中凋亡相关蛋白的表达。值代表三次独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图9.为实施例2提取巴豆精油CTEO对肺癌细胞的抗肿瘤作用中可能的机制。CTEO抑制A549细胞的生长，侵袭，迁移和诱导细胞凋亡：(1)降低增殖因子的表达；(2)抑制侵袭和迁移因子表达；(3)增强促细胞凋亡因子的表达。所有这些发现已经确定CTEO非常有希望成为抗非小细胞肺癌的新治疗剂。
具体实施方式
为了进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点和精神，通过下面的实施例和对比例对本发明的上述内容在作进一步的详细说明。但是，不应该将此理解为本发明上述主体范围仅仅局限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本研究得到了中国山东省省级重点研究发展计划
(NO.2018GNC110008)的支持；中国山东省自然科学基金(编号：ZR2016CB43)；中国山东省泰山学者项目；中国山东省自然科学基金重点项目(编号：ZR2018ZC0944)。
本发明所用的巴豆果实于2018年5月在中国安徽亳州的中草药市场购买。该品种由山东省农业科学院农业食品科学技术研究所成钢山教授鉴定(IAFST，SAAS)，济南，中国。凭证样本(No.18-05-05)保存在SAAS的IAFST生物活性物质和功能食品实验室。
实施例1
一种巴豆精油的分离提取方法，采用以下步骤：
(1)取巴豆果实，剥去果壳，得到巴豆种仁，将巴豆仁粉碎大小为20目，在巴豆仁粉中加入银合欢提取物冷冻干燥后，于湿度为20％、温度为40℃发生反应2小时，然后在150Mpa压力下处理8min的处理后的巴豆仁粉；其中，银合欢提取物的制备方法为：将银合欢和水混合均匀，于80℃提取1-2小时，浓缩，加入乙醇调乙醇度为75-80，静置过夜，离心，沉淀物冷冻干燥后，加入水得银合欢提取物；其中银合欢和水的质量比为1：20；干燥后的沉淀物和水的质量比为1：5；所述的巴豆仁粉和银合欢提取物的质量比为10：1
(2)将步骤(1)处理后的巴豆仁粉末加入超临界提取容器中，向提取容器内输入超临界二氧化碳流体，在萃取压力为25Mpa、萃取温度的压力和35℃下进行萃取，萃取时间为1h；所述的萃取时间1h为动态萃取30分钟后静态萃取30分钟；
(3)将萃取后的二氧化碳流体进入分离器中进行分离，二氧化碳的流量为2L/min，从分离器中排出的即为巴豆精油。
实施例2
一种巴豆精油的分离提取方法，采用以下步骤：
(1)取巴豆果实，剥去果壳，得到巴豆种仁，将巴豆仁粉碎颗粒大小为50目，在巴豆仁粉中加入银合欢提取物冷冻干燥后，于湿度为25％、温度为50℃发生反应3小时；然后在180Mpa压力下处理5min的处理后的巴豆仁粉；银合欢提取物的制备方法为：将银合欢和水混合均匀，于90℃提取2小时，浓缩，加入乙醇调乙醇度为80，静置过夜，离心，沉淀物冷冻干燥后，加入水得银合欢提取物；其中银合欢和水的质量比为1：20；干燥后的沉淀物和水的质量比为1：5。
(2)将步骤(1)处理后的巴豆仁粉末加入超临界提取容器中，向提取容器内输入超临界二氧化碳流体，在萃取压力为25Mpa、萃取温度的压力和35℃下进行萃取，萃取时间为1h；所述的萃取时间1h为动态萃取30分钟后静态萃取30分钟；
(3)将萃取后的二氧化碳流体进入分离器中进行分离，二氧化碳的流量为2L/min，从分离器中排出的即为巴豆精油。
对比例1
一种巴豆精油的分离提取方法，采用以下步骤：
(1)取巴豆果实，剥去果壳，得到巴豆种仁，将巴豆仁粉碎颗粒大小为50目；
(2)将步骤(1)处理后的巴豆仁粉末加入超临界提取容器中，向提取容器内输入超临界二氧化碳流体，在萃取压力为25Mpa、萃取温度的压力和35℃下进行萃取，萃取时间为1h；所述的萃取时间1h为动态萃取30分钟后静态萃取30分钟；
(3)将萃取后的二氧化碳流体进入分离器中进行分离，二氧化碳的流量为2L/min，从分离器中排出的即为巴豆精油。
对比例2
一种巴豆精油的分离提取方法，采用以下步骤：
(1)取巴豆果实，剥去果壳，得到巴豆种仁，将巴豆仁粉碎颗粒大小为50目；然后在180Mpa压力下处理5min的处理后的巴豆仁粉；
(2)将步骤(1)处理后的巴豆仁粉末加入超临界提取容器中，向提取容器内输入超临界二氧化碳流体，在萃取压力为25Mpa、萃取温度的压力和35℃下进行萃取，萃取时间为1h；所述的萃取时间1h为动态萃取30分钟后静态萃取30分钟；
(3)将萃取后的二氧化碳流体进入分离器中进行分离，二氧化碳的流量为2L/min，从分离器中排出的即为巴豆精油。
效果试验
1.巴豆精油毒蛋白检测
(1)蛋白质的提取：分别称取实施例1、实施例2、对比例1和对比例2步骤(1)制备的巴豆仁粉5g，置于烧杯中，加入PBS(10mmol/L磷酸盐缓冲液，PH7.2，含0.14mol/LNaCl)50Ml，不断搅拌下水域加热2小时(温度保持在40-45℃之间)，趁热过滤，得巴豆粗蛋白供试液。
(2)颜色反应(双缩脲反应)：取上述粗蛋白供试液1mL，加入40％NaOH溶液2滴，摇匀，低价1％硫酸铜溶液1-2滴，摇匀，如显紫色，则含蛋白质或多肽
2.巴豆精油成分分析
2.1GC/MS分析
实施例2制备的CTEO的GC-MS分析在Agilent 6890B GC和5977A质量选择检测器(MSD；Agilent，Santa Clara，CA，USA)上进行。使用HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm膜厚；Restek Corporation，Bellefonte，PA，USA)。氦气以1mL/min的速度用作载气，具有以下温度程序：初始温度为100℃，以6℃/min的速率升至200℃，然后以4℃/min升至300℃并保持10分钟，总运行51.7分钟。样品(1μL)在280℃的温度下注射，分流比为1/70，历时1分钟。使用电离能量为70eV的电子碰撞电离系统和质量扫描范围为30-500m/z的电子电离谱。
2.2鉴定精油成分
进行CTE+O中存在的组分的鉴定，通过比较CTEO组分的质谱与来自NIST 08质谱库的质谱，并通过比较使用同源物的混合物测定的计算的实验GC保留指数。在NIST标准参考数据库(NIST Chemistry WebBook，2014，http：//webbook.nist.gov/chemistry/)中报道的具有GC保留指数的上述相同条件下在己烷中从C7至C40的一系列正链烷烃。使用GC/FID峰面积的归一化方法计算CTEO组分的百分比。
3.药效鉴定
3.1细胞培养
A549和HBE细胞购自中国科学院(中国上海)的细胞库类型培养物保藏中心。将A549细胞和HBE细胞维持在含有10％胎牛血清(Gibco)和100U/mL青霉素-链霉素(HyClone)的RPMI-1640(HyClone)中。所有细胞在37℃，95％空气和5％CO 2的气氛下在潮湿条件下培养。
3.2CCK-8测定
通过CCK-8试剂盒监测细胞活力。简而言之，将细胞以每孔5×103个细胞的密度接种到96孔板中24小时。在用不同剂量的CTEO处理24,48和72小时后，向每个孔中加入10μLCCK-8溶液，并将细胞在37℃下再温育2小时。然后用酶标仪(Dynex，Chantilly，VA，USA)在450nm下读板的吸光度。使用GraphPad Prism软件从CCK-8生存力曲线获得生长抑制曲线和半最大抑制浓度值。
3.3伤口划痕试验
使用细胞伤口划痕试验评估癌细胞迁移。对于伤口愈合测定，将细胞接种到6孔板中并孵育过夜以形成融合的细胞单层，并用200μL无菌移液管尖端进行划痕。随后用或不用CTEO处理癌细胞48小时，并用倒置显微镜(Olympus Corp，Tokyo，Japan)获得划痕图像。每个实验独立重复一式三份。
3.4细胞侵袭测定
对于侵袭测定，在上室中用70μL稀释的基质胶(用无血清培养基1：2稀释)预涂覆24孔Transwell室。将癌细胞(1×10 5个细胞/孔)重悬于5％FBS RPMI-1640培养基中，并用CTEO或单独处理，并接种在上室中。下腔室填充有补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640，在37℃，5％CO2中。孵育24小时后，通过温和刮擦除去上室上的非侵入性细胞，将附着于下室的细胞用4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，并用结晶紫染色20分钟。然后，用PBS洗涤上室两次。随机选择不同的视野以在倒置显微镜(Olympus Corporation，Tokyo，Japan)下拍照。
3.5菌落形成测定
将A549细胞接种在6cm细胞培养皿(1000个细胞)中，培养24小时。然后，用连续不同浓度的CTEO处理细胞两周，每两天更换培养基。用PBS洗涤细胞两次，然后在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟。结晶紫(Beyotime，Nantong，China)染色用于观察集落形成。使用普通的NIKON相机拍摄典型图像。
3.6细胞凋亡分析
使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(Beyotime，Nantong，China)通过流式细胞术进行细胞凋亡测定。简而言之，在上述处理48小时后收获细胞，并用冷PBS重悬浮。然后用膜联蛋白V/FITC和PI溶液染色细胞，并在室温下在黑暗中温育10分钟。通过流式细胞术(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)分析结果，并且一式三份进行实验。
3.7线粒体膜电位(ΔΨm)测定
通过经典的JC-1(Beyotime，Nantong，China)染色方法测定线粒体膜电位(MMP)的变化。按照制造商的说明进行测定方法。将A549细胞接种在6孔板中，并用上述方法处理。48小时后，将细胞用JC-1溶液在37℃黑暗中染色20分钟。接下来，在荧光显微镜(NikonCorp.，Tokyo，Japan)下观察染色结果。
3.8蛋白质印迹分析
将A549细胞接种在6cm平板中，并用不同浓度的CTEO处理48小时。用冰冷的PBS洗涤后，将细胞在裂解缓冲液(Beyotime，Nantong，China)中在冰上裂解30分钟。随后将裂解物在12℃下在4℃下离心15分钟，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，Nantong，China)定量裂解物的蛋白质。通过SDS PAGE在10％或12％凝胶上分离约50μg总蛋白质，随后转移至聚偏氟乙烯膜。在室温下用TBST中的5％脱脂牛奶封闭1小时并摇动后，将膜与抗体的特异性一抗在4℃温育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。摇摆2小时。然后使用增强的化学发光试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)检测蛋白质。结果归一化为GAPDH。
3.9统计分析
使用GraphPad Prism 6.0软件分析所有统计数据。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。通过双尾学生t检验评估组间差异。P<0.05被认为表示统计学上显着的差异。
4.结果
4.1颜色反应结果见表1
表1颜色反应
4.2鉴定CTEO的化学成分
由SFE-CO2提取的CTEO是淡黄色油(图1)，基于C.tiglium果实的干重，产率为2.51±0.02％(w/w)。通过GC-MS分析CTEO以确定挥发性组合物。精油挥发性成分的化学分析确定了28种化合物，占总油的92.39％，精油挥发性成分的化学分析如表2所示，主要化合物为17-十八烷酸，占36.73％，其次为十四烷酸(8.49％)，17-十八烷酸甲酯(8.17％)，正十六烷酸(6.45％)，正癸酸(5.28％)，亚油酸酸乙酯(4.37％)和异戊基9-十八碳烯酸酯(4.19％)。由17种化合物组成的脂肪酸和相关酯是CTEO的主要成分。
4.3CTEO抑制A549肺癌细胞的活力
为了评估CTEO对活力肺癌细胞的影响，使用CCK-8测定法，用不同剂量的CTEO处理人A549肺癌细胞48小时。如图2A所示，观察到CTEO以浓度依赖性方式显示出显着的抗癌作用。A549细胞中48h的CTEO半数最大抑制浓度值为48.38μg/mL。随着处理时间的增加，细胞的抑制率逐渐增加。当处理时间为72小时时，CTEO在A549细胞中的IC50值为30.7μg/mL，如图2B所示。然而，CTEO对人正常支气管上皮细胞(HBE)的作用受到较少抑制，CTEO表现出IC50值>100μg/mL。
为了进一步研究CTEO的抗癌作用，使用集落形成测定法。如图2D所示，在A549细胞中用40μg/mL或60μg/mL处理后，集落形成的数量明显减少。此外，我们检测到增殖细胞核抗原(PCNA)的表达作为增殖的生物标志物。如图2E所示，与CCK-8测定和集落形成测定的结果一致，我们发现在CTEO处理后PCEL的表达在A549细胞中下调。因此，CTEO似乎抑制A549肺癌细胞的增殖。
4.4CTEO抑制A549细胞的细胞周期进程
为了研究CTEO如何抑制细胞增殖的细胞机制，我们分析了A549细胞中细胞周期因子相关蛋白的表达。我们假设CTEO治疗可能损害A549细胞中细胞周期蛋白相关蛋白的表达。因此，用不同浓度的CTEO处理A549细胞48小时。为了验证这一假设，我们检测了细胞周期蛋白的蛋白质水平，如cyclinA，cyclinB，CDK1和P21。生化结果显示CTEO处理后cyclinA，cyclin B和CDK1的蛋白水平均显着降低。然而，P21，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，蛋白质表达通过CTEO处理以浓度依赖性方式显着增加，如图3A所示。总之，所有这些结果表明CTEO可以至少部分地降低细胞周期蛋白的表达，最终导致细胞周期停滞和细胞生长抑制。
4.5CTEO抑制A549细胞的迁移和侵袭能力
为了研究CTEO对A549细胞的迁移和侵袭能力的影响，对A549细胞进行伤口划痕试验和transwell侵袭试验。根据结果，我们注意到，对于用40μg/mL CTEO处理的A549细胞，与0μg/mL CTEO相比，它们的伤口愈合率显着降低。我们还注意到，与用0μg/mL CTEO处理的A549细胞相比，用40μg/mL CTEO处理的细胞具有显着更低的侵入细胞数，如图4ABC所示。
4.6CTEO抑制A549细胞中FAK的活化
FAK在许多类型的细胞事件中起重要作用，包括增殖，存活，凋亡，迁移和侵袭。上述实验证明CTEO可显着抑制A549细胞的迁移和侵袭。然而，进一步测试CTEO是否可以通过FAK途径抑制A549细胞的转移和侵袭。在本研究中，用不同浓度的CTEO(0,20,40,60μg/mL)处理A549细胞48小时。如图5A和5B所示，用CTEO处理以剂量依赖性方式显着降低p-FAK水平，但对FAK的表达没有影响。这些结果表明，p-FAK的表达降低可能有助于其抑制细胞迁移和侵袭的活性。
4.7CTEO以剂量依赖性方式促进A549细胞凋亡
为了确定CTEO是否可以诱导A549细胞凋亡，我们首先用不同浓度的CTEO处理A549细胞48小时，并通过流式细胞仪分析细胞中凋亡标记物的变化。如图6A所示，膜联蛋白VFITC/PI的结果表明，与0μg/mL组相比，用20μg/mL CTEO处理的细胞中的凋亡率显着增加。随着浓度的增加，细胞凋亡的数量以浓度依赖性方式增加(40μg/mL时为32.6％，60μg/mL时为42.5％)。
随后，为了研究介导CTEO诱导的细胞凋亡的机制，使用蛋白质印迹试验测定Bcl 2和Bax在CTEO处理A549细胞中的表达。结果表明，与对照组相比，CTEO组Bax/Bcl2蛋白比值显着增加，抗凋亡蛋白Bcl 2表达水平降低，而促凋亡蛋白Bax表达水平升高。如图6C所示；P<0.05。结果证实，CTEO可能促进A549细胞的凋亡。
4.8CTEO诱导A549细胞中的线粒体功能障碍
众所周知，线粒体在调节细胞凋亡中起重要作用。线粒体膜电位崩溃是细胞凋亡的早期特征。我们利用JC-1染色，通过荧光显微镜和蛋白质印迹法评估线粒体膜电位的损失，以评估A549细胞中相关蛋白的表达。如图7A所示，结果表明随着CTEO(0,20,40和60μg/mL)的增加，绿色荧光逐渐增加，红色荧光逐渐减少，表明线粒体膜电位逐渐降低。随后，我们还检查了A549细胞中细胞色素C的变化。结果表明，细胞质中细胞色素C的蛋白质表达水平随着CTEO浓度的增加而逐渐增加，如图7B所示。
4.9CTEO通过caspase介导的A549细胞途径诱导细胞凋亡
半胱氨酸蛋白酶在蛋白水解级联中传递凋亡信号，半胱天冬酶裂解并激活其他半胱天冬酶，随后降解导致细胞死亡的细胞靶标。上述结果表明，CTEO处理导致Bcl2/Bax蛋白比例降低，细胞质中细胞色素C表达水平升高。研究细胞凋亡的潜在机制以及caspase介导的途径是否也参与了CTEO诱导的A549细胞凋亡。我们使用蛋白质印迹分析通过梯度CTEO处理评估A549细胞中的凋亡标记。如图8A所示，切割的半胱天冬酶-3，切割的半胱天冬酶-9的水平在A549细胞中被CTEO显着上调，并且切割的PARP的水平也显着增加。与对照相比。
肺癌是世界上第二大常见癌症，也是癌症死亡的主要原因(Hoffman和Sanchez，2017)。不受控制的细胞增殖和转移是癌症的标志，肿瘤细胞分裂和迁移的速度与几种癌症的预后相关，如肺癌，乳腺癌和骨肉瘤(Hainaut和Plymoth，2013；Hanahan和温伯格，2011年)。因此，靶向抑制细胞增殖或促进细胞凋亡可以提供癌症治疗的线索。以前的报道表明，中国C.tiglium石油提取的种子油中含有丰富的亚油酸，油酸和二十碳烯酸。相反，具有致癌作用和抗HIV-1的活性成分在样品中可能非常罕见，并且难以通过普通的分离和提取方法获得。因此，在本研究中，首先通过替代技术(SFE)获得了C.tiglium的精油用于进一步研究。
研究精油的细胞毒性作用，IC50值在10和50μg/mL之间代表强烈的细胞毒活性。此外，IC50值在50-100,100-200和200-300μg/mL之间分别表示中度，弱和非常弱的细胞毒性。考虑到这一点，本研究的结果表明，由于48.38μg/mL的值，CTEO对A549细胞表现出强烈的细胞毒性。因此，从T.tiglium获得的精油作为细胞毒性药物的来源具有很大的潜力。
在本研究中，CTEO显示的显着细胞毒活性可归因于富含脂肪酸的存在，其占总油的78.48％。许多先前的研究已经证明脂肪酸具有显着的抗肿瘤作用。组蛋白去乙酰化酶抑制剂Butyrate是典型的短链脂肪酸，其结肠癌细胞系HCT116的抗肿瘤作用是显而易见的。相关测定证明，丁酸盐处理显着抑制HCT116细胞中的增殖和诱导的细胞凋亡，其中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关的X蛋白/Bcl-2比率增加(Cao等，2019)。硝基脂肪酸(NFA)是内源性脂质介质，在基于细胞培养的实验和人类CRC的小鼠异种移植模型中对结肠直肠癌(CRC)细胞发挥强烈的抗肿瘤发生作用，并且可以抑制CRC细胞的活力(HCT)-116和HT-29)通过内在的凋亡途径诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。因此，选择总油来研究观察到的效果的相关机制。
PCNA作为增殖的生物标志物，在CTEO处理后A549细胞中的表达下调。通过集落形成测定进一步证实了CTEO的抑制作用。这些结果表明CTEO对体外A549细胞生长具有抑制作用。细胞增殖取决于细胞周期的进展。抗癌剂使用的另一种非常重要的机制是细胞周期停滞。如果癌细胞在细胞周期的任何阶段停滞，它们就不能完成细胞分裂并且肿瘤生长受到抑制。此外，CTEO对A549细胞的增殖抑制作用可能至少部分依赖于细胞周期蛋白的表达，因为注意到CTEO处理会抑制细胞周期蛋白的表达。因此，减少的细胞周期蛋白原因表达可能是细胞周期停滞和因此凋亡的原因。
癌细胞转移与各种步骤相关，包括癌细胞与ECM的粘附，基底膜的降解以允许肿瘤细胞迁移和侵入外周组织。许多类型的细胞粘附分子在转移事件的不同步骤中起重要作用。粘着斑激酶(FAK)是通过细胞和细胞外基质的信号转导的主要介质，并且在细胞增殖，存活，凋亡，迁移和侵袭中起重要作用。FAK主要通过其在Tyr 397(Y397)的自磷酸化来调节细胞迁移，其随后磷酸化FAK的其他位点，包括其激酶结构域，从而触发细胞迁移信号途径的激活。升高的FAK和磷酸-FAK Tyr397与几种人肿瘤的侵袭和转移潜能相关。以前的研究表明，一些FAK特异性抑制剂可以抑制癌细胞的粘附，迁移和侵袭。然而，在我们的结果中，CTEO能够在A549细胞中以剂量依赖性方式显着抑制迁移和侵袭，并降低p-FAK蛋白水平。
细胞凋亡抑制癌细胞存活，并已被鉴定为细胞抑制药物诱导细胞死亡的中枢机制。细胞抑制药物可通过多种途径引起细胞凋亡，包括死亡受体/配体系统的激活，线粒体膜电位的变化，DNA损伤或蛋白质合成的抑制。抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax。大多数抗肿瘤药物可通过上调Bax/Bcl-2的比例来促进肿瘤细胞凋亡。与先前的研究一致，我们的结果发现CTEO可以剂量依赖性方式增加Bax水平并降低A549细胞中Bcl-2的水平。增加的Bax/Bcl-2比率可导致线粒体膜电位降低，导致细胞色素c释放到胞质溶胶中。线粒体膜电位降低是细胞凋亡的早期现象。Caspase-9在细胞凋亡过程中被细胞色素c激活，并通过caspase-9进一步激活procaspase-3。活化的procaspase进一步激活caspase级联，PARP切割导致细胞凋亡。我们的研究结果表明，CTEO导致线粒体膜电位的显着丧失和切割的caspase-3，切割的caspase-9和切割的PARP的积累。上述结果表明，CTEO诱导的半胱天冬酶级联激活以及随后的PARP切割暗示CTEO介导的细胞凋亡通过内源途径发生。
本发明制备的CTEO对A549细胞的抗肿瘤作用部分是通过降低增殖因子的表达，抑制侵袭和迁移因子，以及增强促细胞凋亡因子的表达，如图9所示。可以诱导细胞周期停滞和凋亡细胞死亡的自然资源通常被认为是潜在的抗癌药物。因此，这些证据表明，CTEO可能是研究人类肺癌新型化学预防或化学治疗剂的有前景和未来的补充，可考虑用于药物开发的进一步临床研究。这些发现应有利于C.tiglium产业的发展。
