糖苷键合态香气物质的提取方法及猕猴桃酒的制备方法
技术领域
本发明涉及水果加工副产物(皮渣)中糖苷键合态香气物质在猕猴桃酒中的应用，具体涉及猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的提取方法、猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的检测方法及猕猴桃酒的制备方法。
背景技术
猕猴桃是一种营养丰富的水果，以猕猴桃为原料开发的食品种类也备受消费者喜爱，其中猕猴桃酒因加工工艺健康在所有猕猴桃开发食品类中脱颖而出，但现有猕猴桃酒存在香气不足的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明目的之一是提供了一种糖苷键合态香气物质的提取方法
本发明所提供的糖苷键合态香气物质的提取方法的原料是猕猴桃皮或榨汁后的猕猴桃皮渣。
进一步，本发明提供了一种猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的提取方法。本发明所提供的猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的提取方法包括：
对猕猴桃皮或猕猴桃皮渣进行破碎均质；
对破碎均质后的物料进行浸泡，浸泡液过滤，收集滤液；
采用活化后的吸附树脂分离滤液中的非糖苷键合态香气物质和糖苷键合态香气物质，过程中依次用水、甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液；
除去甲醇洗脱液中的甲醇后得糖苷键合态香气物质提取液。
优选的，本发明所述浸泡用溶液为含乙醇的磷酸盐缓冲液，并且浸泡液过滤后需除去滤液中的乙醇。
优选的，本发明所述活化包括：采用乙醇对吸附树脂进行溶胀，之后用水洗，接着依次用戊烷、水和甲醇进行洗脱活化，最后再经水洗。
优选的，本发明活化时所述水、戊烷和甲醇的用量相同，洗脱流速相同。
本发明的目的之二是提供一种猕猴桃酒的制备方法，本发明所提的猕猴桃酒制备方法包括：
以带皮猕猴桃为原料榨取果汁，之后对去渣的果汁依次进行酶解、发酵、过滤，所得滤液为原酒，接着在原酒中添加糖苷键合态香气物质提取液，后经在15-20℃条件下进行避光陈酿，所述糖苷键合态香气物质提取液为本发明所述方法提取的糖苷键合态香气物质提取液。
具体的，本发明的猕猴桃酒制备方法包括：
(1)以带皮猕猴桃为原料榨取果汁；
(2)以榨汁后的猕猴桃皮渣为原料采用本发明所述方法提取糖苷键合态香气物质提取液；
(3)对去渣的果汁依次进行酶解、发酵、过滤，所得滤液为原酒，接着在原酒中添加步骤(2)制得的糖苷键合态香气物质提取液，后经在15-20℃条件下进行避光陈酿；所述原酒与键合态香气物质提取液的体积比为 25:1～33:1。
进一步，本发明还提供一种猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的检测方法。本发明所提供的检测方法包括：
对猕猴桃皮或猕猴桃皮渣进行破碎均质；
对破碎均质后的物料进行浸泡，浸泡液过滤，收集滤液；
采用活化后的吸附树脂分离滤液中的非糖苷键合态香气物质和糖苷键合态香气物质，过程中依次用水、戊烷、甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液；
除去甲醇洗脱液中的甲醇后得糖苷键合态香气物质提取液；
之后用β-葡萄糖苷酶对所提取的糖苷键合态香气物质提取液进行酶解，然后进行GC-MS检测或采用电子鼻探头检测。
优选的，本发明所述电子鼻探头检测包括：对酶解样品进行稀释、室温静置一定时间，之后采用电子鼻探头检测。
相比于现有技术，本发明具有如下优势：
(1)本发明采用猕猴桃加工副产物(皮渣)为原料提取糖苷键合态香气物质，可减少猕猴桃深加工产生的下脚料，避免环境污染，提高猕猴桃利用率。
(2)本发明首次将皮渣中提取到的键合态香气物质添加于猕猴桃果酒中，可有效改善猕猴桃酒的品质特性，主要包括：减少酒样抗氧化活性、总酚含量以及香气物质的降低程度，增加萜烯类化合物的浓度，从而使猕猴桃酒的香气更加浓郁协调。
(3)和传统的提取方法相比，本发明提取糖苷键合态香气物质的操作步骤没有衍生化法复杂，且可避免酸解造成萜烯类的重排和降解；提取均在低温下进行，可避免高温造成的香气损失。
附图说明
图1为本发明海沃德皮渣键合态香气物质酶解48h后的气相色谱-质谱联用检测图；
图2为实施例3的电子鼻对香气成分的雷达图，图中数字1-10和表2 中的数字相对应，图中有灰色响应的2和7代表样品中这两个传感器可以响应的物质浓度较大；
图3为本发明黄金果皮渣键合态香气物质酶解48h后的气相色谱-质谱联用检测图；
图4为本发明徐香皮渣键合态香气物质酶解48h后的气相色谱-质谱联用检测图；
图5为果汁发酵(清汁发酵)和带渣发酵原酒中多酚含量比较图；
图6为果汁发酵(清汁发酵)和带渣发酵原酒抗氧化活性比较图；
图7糖苷键合态香气物质对猕猴桃酒中酚类化合物含量的影响图；
图8糖苷键合态香气物质对猕猴桃酒抗氧化活性的影响图；
图9糖苷键合态香气物质对猕猴桃酒香气特性的影响图。
具体实施方式
糖苷键合态香气物质是糖或糖的衍生物与苷元通过糖苷键连接形成的化合物，是风味前体物质，本身无挥发性，在酶解或酸解后可产生游离态挥发物。
本发明基于发明人对猕猴桃多年的开发研究与认知，提出通过提取猕猴桃皮或/废弃的猕猴桃皮渣中的糖苷键香气物质，提升猕猴桃经济价值。本发明所述的猕猴桃皮为猕猴桃深加工过程中剥离的废弃猕猴桃果皮；所述的榨汁后的猕猴桃皮渣为猕猴桃整果经榨汁(如离心榨汁)后分离出的废弃皮渣。本发明的猕猴桃皮和猕猴桃皮渣可来源于猕猴桃深加工工厂。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
以下实施例所用的猕猴桃皮渣收集自猕猴桃果汁、果酒或果脯等生产加工产生的副产物(皮渣)，并用均质机进行均质，以便糖苷键合态香气物质充分浸提。
实施例1：
该实施例为一种具体的猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的提取方法：
(1)用均质机对随机收集到的猕猴桃皮渣进行均质，以便糖苷键合态香气物质充分浸提；
(2)将240g均质后的皮渣溶解于360mL含13％左右乙醇(V/V)的磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)中，于4℃避光浸渍48h，然后过滤除去残渣，离心10min(5500r/min，4℃)取上清液旋蒸除去乙醇，最后用 0.45μm滤膜过滤，得到皮渣中香气物质的粗提取液；
(3)将新树脂XAD-2用95％乙醇完全溶胀(24h)，再用蒸馏水冲洗至无乙醇气味；取乙醇预处理后XAD-2进行湿法装柱，然后分别用2倍柱体积的戊烷、超纯水和甲醇依次进行活化，最后用超纯水洗脱至无甲醇气味则完成活化；
(4)将(2)中得到的皮渣中香气物质提取液(250mL)上样到已活化好的XAD-2树脂柱中；用三倍柱体积的蒸馏水洗柱(2.5mL/min)以除去其中的糖、酸等水溶性物质；接着用三倍柱体积甲醇洗脱(2.5mL/min)吸附的键合态香气物质，收集洗脱液；
(5)除去洗脱液中的有机相，剩下的水相即为键合态香气物质的提取液。
实施例2：
实施例为一种具体的猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质的提取方法，具体是对海沃德猕猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质酶解释放的挥发性物质种类和含量进行检测，该实施例的步骤与实施例2的不同之处是：
(4)将(2)中得到的皮渣中香气物质提取液(250mL)上样到已活化好的XAD-2树脂柱中；用三倍柱体积的蒸馏水洗柱(2.5mL/min)以除去其中的糖、酸等水溶性物质，然后用同样量的戊烷洗柱(2.5mL/min)除游离态香气物质；接着用三倍柱体积甲醇洗脱(2.5mL/min)吸附的键合态香气物质，收集洗脱液；
(5)35℃左右条件下，将洗脱液减压浓缩至干，残留物溶解在8mL 的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH＝5)中，再用4mL戊烷将缓冲液洗两次，以除去可能存在的游离态香气物质；除去有机相，剩下的水相即为键合态香气物质的提取液；
(6)在提取液中加入适量β-葡萄糖苷酶(6units/mg)，密封试管， 37℃酶解48h。然后用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)检测键合态香气酶解后释放的苷元挥发性香气物质，具体利用顶空固相微萃取结合GC-MS技术检测键合态香气物质酶解后释放的挥发性香气物质：
(6.1)萃取条件：在15mL固相微萃取瓶中加入5mL键合态香气物质酶解液、1.5gNaCl和20μL内标物2-辛醇(0.4mg/mL)，用聚四氟乙烯-硅胶隔垫加盖密封，40℃平衡10min；然后将老化(270℃，1h)好的固相微萃取器插在样品瓶上，40℃恒温萃取45min，搅拌速率300r/min；
(6.2)色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX柱；气相色谱程序升温：50℃保持2min，以6℃/min升至230℃，保持3min；不分流进样；载气为氦气，流速1.0mL/min；进样口温度230℃；
(6.3)质谱条件：离子源为EI，电离电压70eV，离子源温度240℃，传输线温度250℃，质荷比(m/z)范围45-450。GC-MS图如图1所示。酶解释放的香气物质与标准物质和NIST谱库对比定性，利用内标2-辛醇进行半定量分析。
表1海沃德猴桃皮渣中糖苷键合态香气物质酶解释放的挥发性物质的种类和含量
实施例3：
该实施例与实施例2不同之处在于：具体采用电子鼻(PEN3型便携式电子鼻，德国Airsense公司)检测键合态香气物质酶解后释放的挥发性物质：
(1)样品稀释：取一定量酶解后的键合态香气物质提取液，稀释十倍；
(2)室温平衡：取10mL步骤(1)得到的稀释液置于30mL样品瓶中，密封室温平衡15min；
(3)检测：插入电子鼻探头吸取顶端空气，测定挥发性物质；
(4)步骤(3)中电子鼻参数设置：检测时间60s，预进样5s，清洗时间300s，进样流量和内部流量均为300mL/min。电子鼻检测结果图如图2所示，电子鼻传感器W5S和W1W对皮渣中键合态香气物质酶解后产生的挥发性物质有明显的响应，且响应值不相同，其中传感器W1W响应值显著高于W5S传感器的；W1W对萜烯类物质敏感，说明猕猴桃皮渣中含有丰富的萜烯类香气物质。
表2电子鼻传感器阵列及其主要特性
实施例4：
该实施例与实施例2不同之处在于，对黄金果猕猴桃皮渣中的糖苷键合态香气物质酶解释放的挥发性物质种类和含量进行检测，结果如图3所示。酶解释放的香气物质与标准物质和NIST谱库对比定性，利用内标2-辛醇进行半定量分析。
实施例5：
该实施例为一种具体的猕猴桃酒制备方法，具体选取徐香猕猴桃为原料，经以下步骤制备高品质的猕猴桃酒，具体制备工艺如下：
(1)猕猴桃分选清洗：选择成熟度好，无腐烂变质的猕猴桃，清洗备用；
(2)将步骤(1)得到的猕猴桃在离心式榨汁机中进行榨汁，得到猕猴桃果汁，提取皮渣中糖苷键合态香气物质，具体提取方法如实施例1，检测方法同实施例2，GC-MS图如图4所示；
(3)在步骤(2)得到的猕猴桃汁中添加60mg/果胶酶，室温酶解12h，提高出汁率；
(4)在步骤(3)酶解后的果汁中按5％的量接入酵母种子液进行发酵；
(5)发酵温度控制在22℃、发酵时间7d，当可溶性固形物含量基本不变、还原糖含量低于4g/L时终止发酵；
(6)酒精发酵结束后用纱布进行过滤，得到猕猴桃原酒；进一步，可添加SO2以抑制发酵的进行和使原酒尽快澄清；
(7)按100mL猕猴桃酒样中添加100g皮渣提取所得的糖苷键合态香气物质提取液的比例在步骤(6)得到的猕猴桃新酒中添加键合态香气物质提取液；
(8)将步骤(7)得到的添加了键合态香气物质提取液的猕猴桃酒在15-20℃进行避光陈酿。
抗氧化活性和香气物质测试：
测试一：分别以徐香猕猴桃和黄金果猕猴桃为原料，采用实施例6中前六个步骤制备带渣发酵原酒，工艺不同的是将榨汁后的皮渣与果汁同时用于发酵；同时采用实施例6中前六个步骤制备黄金果猕猴桃果汁发酵原酒；接着分别测量果汁发酵(清汁发酵)和带渣发酵原酒与实施例6制备的原酒的多酚与抗氧化活性，结果如所示图5和图6，说明实施例6工艺制备的原酒中多酚含量和抗氧化活性比带渣发酵酒的高。
其中：总酚含量用福林-酚法测定，以没食子酸当量(gallic acid equivalent，GAE)表示，单位为mg GAE/L；用DPPH、ABTS+·、·OH自由基的清除能力和还原力来评价猕猴桃酒的抗氧化活性，其中DPPH自由基清除能力参考Ramchandani等的方法测定；ABTS+·和·OH清除率测定参考Xu Changmou等的方法测定；还原力测定参考
测试二：取四份100mL由实施例6步骤(6)得到的徐香猕猴桃新酒(XXW)；一份加入实施例1中100g皮渣提取所得的糖苷键合态香气物质提取液 (XXW-B)，一份加入52mgβ-葡萄糖苷酶(XXW-β)，一份同时加入与上述(XXW-B和XXW-β)相同量的键合态香气物质提取液和β-葡萄糖苷酶(XXW- (β+B))，还有一份作为对照(XXW)；将四个测试样酒避光保存30d，每隔15d取样，测定酒样的酚类物质、抗氧化活性以及香气物质的含量，从而综合评价糖苷键合态香气物质对猕猴桃酒品质特性的影响。
其中：总酚含量采用福林-酚法测定，以没食子酸当量(gallic acid equivalent，GAE)表示，单位为mg GAE/L；总黄酮含量的测定采用氯化铝显色法，黄烷醇含量的测定采用p-DMACA衍生化法，原花青素含量的测定采用香草醛-盐酸法；以上3种物质的含量均以儿茶素当量(catechin equivalent，CE)表示，单位为mg CE/L；用还原力和FRAP法评价不同样品的抗氧化活性，且参考
