抗微生物聚(烷基化咪唑鎓)盐
技术领域
本发明涉及聚(烷基化咪唑鎓)氯化物盐及其作为针对广谱细菌的抗微生物剂的用途，以及包含所述聚合物盐的组合物。
背景技术
在本说明书中对先前出版的文件的列出或讨论不必一定认为是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
难以治疗的耐多药病原体的出现和传播是世界卫生保健系统、研究院所、临床医生、政府机构和广大民众极为关注的问题。最近，世界卫生组织(WHO)发布了急需新抗生素或抗细菌剂的细菌列表。该列表的制定是为了指导和促进新抗生素的研究和开发，这是WHO为应对全球对抗微生物药物日益增长的耐药性所做的努力的一部分。列表中最关键的细菌是耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(CRAB)、耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(CRPA)和产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的耐碳青霉烯的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(CREB)。ESBL-CREB的一些实例包括耐碳青霉烯的大肠杆菌(Escherichia coli)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)复合体、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和产氧克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。
另一类抗细菌药物是抗微生物肽(AMP)，被认为是治疗多药耐药细菌的有前途的候选药物。然而，它们目前的使用通常受到对哺乳动物细胞的高毒性和/或通常较高的最低抑制浓度的限制(例如参见Hancock,R.E.等人,Nat.Biotechnol.,2006.24,1551-1557)。AMP的实例包括多粘菌素，多粘菌素是一组环状脂肽，其通常对革兰氏阴性细菌表现出抗微生物选择性。然而，多粘菌素具有特定的氨基酸序列，这使得它们通常生产起来昂贵(Davis,S.D.,Antimicrob.Agents Chemother.,1975,8,50-53)。另外，粘杆菌素(多粘菌素E)的使用可能导致负面副作用，如肾毒性，因此，如果其他抗生素失败，它仅被认为是最后的解决方法而被使用。
除肽外，由于强效抗细菌作用，合成聚合物还被广泛用作消毒剂，尽管它们通常对哺乳动物细胞具有较高的毒性。广泛使用的抗细菌聚合物的一些实例是聚六亚甲基双胍(PHMB)和季铵聚合物，诸如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)。已报道的其他有希望的抗微生物聚合物包括：
·季铵聚合物(Liu,S.,等人,Biomaterials,2017,127,36-48；King,A.,等人,Biomacromolecules,2014,15,456-467)；
·聚咪唑鎓聚合物(Zheng,Z.,等人,ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8,12684-12692)；
·聚碳酸酯(Nederberg,F.,等人,Nat.Chem.,2011,3,409-414；Yang,C.,等人,Adv.Healthcare Mater.,2016,5,1272-1281；Chin,W.,等人,Macromolecules,2013,46,8797-8807)；
·聚降冰片烯(Lienkamp,K.,等人,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,9836-9843；Al-Badri,Z.M.,等人,Biomacromolecules,2008,9,2805-2810)；
·壳聚糖衍生物(Hosseinnejad,M.等人,Int.J.Biol.Macromol.,2016,85,467-475；Li,P.,等人,Adv.Mater.,2012,24,4130-4137)；
·聚甲基丙烯酰胺类(Palermo,E.F.,等人,Biomacromolecules,2012.13,1632-1641；Kuroda,K.等人,J.Am.Chem.Soc.,2005,127,4128-4129)；
·其他多肽(Xiong,M.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2015.112,13155-13160；Xi,Y.,等人,Biomacromolecules,2016,17,3922–3930)；以及
·聚(β-肽)(Liu,R.,等人,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,4410-4418；Mowery,B.P.,等人,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,9735-9745；Chakraborty,S.,等人,J.Am.Chem.Soc.,2014.136,14530-14535)。
这些聚合物中的大多数是通过自由基聚合(FRP)或开环聚合(ROP)合成的，然后其可以进行后官能化。合成路线通常涉及大量有机溶剂，并产生剧毒的产物。另外，合成难以扩大规模，这使得这种聚合物不能大量合成。
鉴于上述情况，仍然需要对广谱的微生物表现出高的抗微生物活性，同时对哺乳动物细胞显示出低毒性并且易于且廉价大量生产的新的抗微生物剂。这种抗微生物剂可以潜在地用作细菌感染的药物产品，或者可以有利地掺入清洁剂(诸如皂、洗涤剂和洗发剂)、个人护理和卫生产品中。
发明内容
下面关于以下编号的方面和实施方式描述本发明。
1.具有式(I)的重复单元的聚合物：
或包含式I的重复单元和式(II)的重复单元的共聚物：
其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-6烷基；
R2至R8和R11各自独立地表示H或C1-6烷基；
R9和R12各自独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-6烷基；
R13表示H或C1-6烷基；
X表示CR14R15、O或S；
R14和R15独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-6烷基；
m是选自0至5中的数字；
n是选自2至10中的数字；
p是选自0至5中的数字；
q是选自0至3中的数字；
x是选自2至10中的数字；
y是选自0至3中的数字；以及
其溶剂化物，
前提是，当所述化合物是共聚物时，式(I)的重复单元和式(II)的重复单元不相同。
2.根据条目1的聚合物或共聚物，其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-3烷基；
R2至R8和R11各自独立地表示H或甲基；
R9和R12各自独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-3烷基；
R13表示H或C1-3烷基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-3烷基；
m是选自0至4中的数字；
n是选自2至8中的数字；
p是选自0至3中的数字；
q是选自0至1中的数字；
x是选自2至8中的数字；和
y是选自0至1中的数字。
3.根据条目1或条目2的聚合物或共聚物，其中：
R2至R8和R11各自独立地表示H；
R9和R12各自独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
m是选自0至3中的数字；
n是选自2至7中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q和y为0；以及
x是选自2到7中的数字。
4.根据前述条目中任一项的聚合物或共聚物，其中：
R2至R8和R11各自独立地表示H；
R9和R12各自独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
m是选自0至2中的数字；
n是选自2至7中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q和y为0；以及
x是选自2到7中的数字。
5.根据前述条目中任一项的聚合物或共聚物，其中数均分子量为500至7,000道尔顿。
6.根据前述条目中任一项的聚合物或共聚物，其中该聚合物或共聚物是具有式I的重复单元的聚合物。
7.条目6的聚合物，其中：
R2至R8各自为H；
R9各自表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CH2或O；
m是选自0至2中的数字；
n是选自2至6中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q是0。
8.根据前述条目中任一项的聚合物或共聚物，其中当X为O时，p为1或2。
9.根据条目1至8中任一项的聚合物，其中，重复单元选自由以下组成的组：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
，任选地，其中聚合物的数均分子量为4,000至5,000道尔顿；以及
(vii)
10.根据条目9的聚合物，其中，重复单元选自由以下组成的组：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
，其中聚合物的数均分子量为4,000至5,000道尔顿。
11.根据条目1至5中任一项的共聚物，其中式(I)和式(II)的重复单元选自由以下组成的组：
(i)
(ii)
12.一种药物组合物，包括条目1至11中任一项的聚合物或共聚物和药学上可接受的载体。
13.条目1至11中任一项的聚合物或共聚物，或条目12中所述的药物组合物，用于作为药物的用途。
14.一种治疗遭受微生物和/或真菌感染的受试者的方法，包括以下步骤：向该受试者给药治疗有效量的条目1至11中任一项的聚合物或共聚物，或条目12中所述的药物组合物，使得感染被治疗。
15.条目1至11中任一项的聚合物或共聚物，或条目12中所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的受试者的微生物和/或真菌感染的药物的用途。
16.条目1至11中任一项的聚合物或共聚物，或条目12中所述的药物组合物，用于治疗微生物和/或真菌感染的用途。
17.一种抗微生物和/或抗真菌洗涤剂组合物，包括：
条目1至11中任一项所述的聚合物或共聚物；以及
表面活性剂。
18.根据条目17的抗微生物和/或抗真菌洗涤剂组合物，其中组合物为固体或液体皂的形式。
19.根据条目17的抗微生物和/或抗真菌洗涤剂组合物，其中组合物为洗发剂的形式。
附图说明
图1描绘了通过Debus-Radziszewski(德布斯-阮得采汪斯基)反应由盐酸、二胺、甲醛和乙二醛合成PIM 1-7氯化物。
图2描绘了(a)PIM 1；(b)PIM 2；(c)PIM 3；(d)PIM 4；(e)PIM 5；(f)PIM 6；以及(g)PIM 7的1H NMR谱(D2O中)。
图3描绘了PIM 1氯化物和聚六亚甲基双胍(PHMB)对各种分枝杆菌的剂量-响应曲线：(a)卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)；(b)耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)；(c)脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(粗糙形态类型)；以及(d)脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(平滑形态类型)。
图4描绘了(a-b)PIM 1-7氯化物的；以及(c)不同批次的PIM 1和5氯化物的毒性，使用MTT测定法在3T3成纤维细胞上评价。
图5描绘了在(a)EC8739；以及(b)PAO1细菌上评价的PIM 1-7氯化物的外膜渗透性测定，使用1-N-苯基-萘胺(NPN)作为荧光探针。多粘菌素B用作参考。
图6描绘了在(a)MRSA USA300；和(b)EC8739上评价的PIM 1-7氯化物的内膜电势测定，使用DiSC3(5)作为荧光探针。聚合物和短杆菌肽(参考)的浓度为100μg/mL。
图7描绘了磺基罗丹明B-PIM 1和PIM 5缀合物的合成。
图8描绘了用不同浓度的磺基罗丹明B-PIM 1缀合物处理的PAO1的STED荧光图像。
图9描绘了用不同浓度的磺基罗丹明B-PIM 5缀合物处理的PAO1的STED荧光图像。
图10描绘了在0.5×MIC浓度下，(a)PIM 1氯化物和(b)PIM 5氯化物对MRSAUSA300的STED荧光图像。
图11描绘了(a)PIM 1氯化物和(c)PIM 5氯化物对PAO1的杀细菌动力学；以及(b)PIM 1氯化物和(d)PIM 5氯化物对MRSA USA300的杀细菌动力学。
图12描绘了在亚MIC浓度的PIM 1氯化物、PIM 5氯化物和氧氟沙星(阳性对照)存在的情况下，通过连续传代的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(SA29213)的抗性进化。
图13描绘了在存在各种活性剂和剂量的情况下，在PAO1小鼠败血病模型中小鼠的百分比存活率。在感染后0.5h、4h和8h时间点，对不同的测试组(每组5只小鼠)，通过以0.5mg/kg、1mg/kg和2mg/kg的浓度通过腹膜内注射引入PIM 1氯化物。对于阳性对照，在完全相同的时间点以每种剂量给药1mg/kg粘杆菌素。
图14描绘了在不同的活性剂和剂量的情况下，感染(a)PAO1；(b)PAER；以及(c)AB-1的小鼠败血病模型中所用的小鼠腹膜液中的细菌菌落(CFU)。通过腹膜内途径使用两种给药方案(感染后1、4和8h三剂，每剂2mg/kg的PIM 1；或感染后1h，6mg/kg的单剂)之一给药PIM 1氯化物。所用的对照抗生素为2mg/kg亚胺培南，分三剂(感染后1、4和8小时)给药。
图15描绘了在各种剂量治疗的情况下，在感染了(a)PAO1；(b)PAER；和(c)AB-1的小鼠皮肤感染模型中的小鼠伤口上的细菌菌落(CFU)。感染后4h分别以1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg对感染的伤口给药一次PIM 1氯化物。所用的对照抗生素是感染后4h给药一次的5mg/kg的亚胺培南。
图16描绘了使用两种不同的二胺合成PIM共聚物。
具体实施方式
本文公开了一系列阳离子聚合物，即阳离子聚(烷基化咪唑鎓)(PIM)氯化物盐，其电荷被限制在具有不同疏水度的主要链和脂族主链上。这些PIM由简单且廉价的起始化学物质(甲醛、乙二醛、酸和水)通过一步Debus-Radziszewski(DR)反应合成。出乎意料的是，这些PIM氯化物盐对一系列临床上重要的ESKAPE(粪肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter))细菌菌种显示出优异的广谱抗细菌特性。不论其结构的细节如何，所测试的PIM均显示出低溶血性，并且具有良好抗微生物功效，对这些病原体具有相对于人类红细胞的非常高的选择性
术语“革兰氏阳性细菌”是指细胞壁具有大量肽聚糖的细菌。在革兰氏染色方案中，那些趋势为保持结晶紫并染色成深蓝色或紫色的被识别为革兰氏阳性细菌。
术语“革兰氏阴性细菌”是指具有较薄的肽聚糖层的细菌，它们在革兰氏染色方案中不保持结晶紫染色，而是保持复染剂，通常为番红。革兰氏阴性细菌在革兰氏染色方案中染成红色或粉红色。
因此，根据本发明的第一方面，提供了具有式(I)的重复单元的聚合物：
或包含式I的重复单元和式(II)的重复单元的共聚物：
其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-6烷基；
R2至R8和R11各自独立地表示H或C1-6烷基；
R9和R12各自独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-6烷基；
R13表示H或C1-6烷基；
X表示CR14R15、O或S；
R14和R15独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-6烷基；
m是选自0至5中的数字；
n是选自2至10中的数字；
p是选自0至5中的数字；
q是选自0至3中的数字；
x是选自2至10中的数字；
y是选自0至3中的数字；以及
其溶剂化物，
前提是，当所述化合物是共聚物时，式(I)的重复单元和式(II)的重复单元不相同。
本文(在本发明的任何方面或实施方式中)对本发明的聚合物或共聚物的提及包括对此类化合物本身的提及，此类化合物的互变异构体的提及以及此类化合物的药学上可接受的溶剂化物的提及。
如上所述，本发明的聚合物或共聚物还包括化合物及其盐的任何溶剂化物。优选的溶剂化物是通过将无毒药学上可接受的溶剂(以下称为溶剂化溶剂)的分子结合到本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)中而形成的溶剂化物。此类溶剂的实例包括水、醇(例如乙醇、异丙醇和丁醇)和二甲亚砜。可以通过用溶剂或包含溶剂化溶剂的溶剂混合物重结晶本发明的化合物来制备溶剂化物。在任何给定的情况下，是否已形成溶剂化物，可以通过使用众所周知的和标准的技术(诸如热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)和X射线晶体学)对化合物的晶体进行分析来确定。
溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，水合物的实例包括半水合物、一水合物和二水合物。
有关溶剂化物及其制备和表征方法的更详细讨论，请参见Bryn等人,Solid-StateChemistry of Drugs,Second Edition,published by SSCI,Inc of West Lafayette,IN,USA,1999,ISBN 0-967-06710-3。
本发明的聚合物或共聚物可以以区域异构体的形式存在，也可以表现出互变异构。所有互变异构形式及其混合物均包括在本发明的范围内。
本发明的聚合物或共聚物可以包含一个或多个不对称碳原子，因此可以表现出光学和/或非对映异构。非对映异构体可以使用常规技术例如色谱法或分级结晶法分离。各种立体异构体可以通过使用常规的例如分级结晶法或HPLC技术分离化合物的外消旋或其他混合物来分离。或者，所需的光学异构体可通过以下方法制得：适当的光学活性起始原料在不会引起外消旋或差向异构化的条件下反应(即“手性池”法)，使适当的起始原料与“手性助剂”(随后可以在合适的阶段除去)反应，衍生化(即拆分，包括动态拆分)，例如用同手性酸衍生化，然后通过常规手段诸如色谱法分离非对映异构体衍生物，或与合适的手性试剂或手性催化剂反应，所有这些均在技术人员已知的条件下进行。所有的立体异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
本发明的上述方面中的本发明的聚合物或共聚物可以用于医学治疗方法中。因此，根据本发明的其他方面，提供：
(a)本发明的聚合物或共聚物用于药物；
(b)本发明的聚合物或共聚物用于治疗微生物和/或真菌感染；
(c)本发明的聚合物或共聚物在制备用于治疗微生物和/或真菌感染的药物中的用途；以及
(d)一种治疗微生物和/或真菌感染的方法，该方法包括给药有效量的本发明的聚合物或共聚物。
在本文可以提及的实施方式中，本发明的聚合物或共聚物对于微生物感染可能是特别有用的。
术语“微生物感染”涵盖由受试者体内或受试者上的微生物引起的任何疾病或病症。微生物感染的实例包括但不限于，由分枝杆菌引起的结核病，由假单胞菌(pseudomonas)等引起的烧伤伤口感染，由金黄色葡萄球菌(S.aureus)引起的皮肤感染，由假单胞菌(pseudomonas)和鲍曼不动杆菌(A.baumannii)引起的伤口感染，以及败血症。术语“真菌感染”涵盖由受试者体内或受试者上的微生物引起的任何疾病或病症。微生物感染的实例包括但不限于，脚癣、癣、酵母菌感染和股癣。
可能对本发明的聚合物和共聚物敏感的细菌的非限制性列表包括：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulyticus)、龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)、Alkaliphilus metalliredigens、奥利姆兰迪嗜碱菌(Alkaliphilus oremlandii)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、青春双歧杆菌芽孢杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidiobacterium longum)、解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)、Carboxydothermus hydrogenoformans、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、柔嫩梭菌(Clostridium leptum)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、嗜热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、解脲棒状杆菌(Corynebacterium urealyticum)、哈夫尼脱亚硫酸杆菌(Desulfitobacterium hafniense)、脱硫肠(Desulfotomaculum reducens)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、大芬戈尔德菌(Fingoldia magna)、嗜碱地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、两面神菌属菌种(Janibacter sp.)、耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、威氏李斯特氏菌(Listeria welshimeri)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)、诺卡氏菌菌种(Nocardioides sp.)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、红球菌属菌种(Rhodococcus sp.)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、凝固酶阴性葡萄球菌属菌种(coagulase-negative Staphylococcus species)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、戈氏链球菌(Streptococcus gordonii)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、乙醇热厌氧菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、腾聪嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)及其组合。
为了避免疑问，在本发明的上下文中，术语“治疗”包括对需要这种治疗的患者的治疗或姑息治疗的提及，以及对易感相关的疾病状态的患者的预防性治疗和/或诊断的提及。
术语“患者(patient)”和“患者(patients)”包括对哺乳动物(例如人类)患者的提及。如本文所用，术语“受试者”或“患者”在本领域中是众所周知的，并且在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，最优选是人类。在一些实施方式中，所述受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或疾患的受试者。然而，在其他实施方式中，受试者可以是正常受试者。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成人和新生儿受试者，无论是男性还是女性。
术语“有效量”是赋予被治疗的患者治疗效果(例如足以治疗或预防该疾病)的化合物的量。效果可以是客观的(即可以通过某种测试或标志物测量)或主观的(即受试者给出了指示或感觉到效果)。
除非另有说明，否则术语“烷基”是指可以被取代或未被取代的直链或支链的饱和烃基。其中术语“烷基”是指C1-6烷基(烷基可以是乙基、丙基(例如正丙基或异丙基)、丁基(例如支链或直链丁基)、戊基，或更优选地是甲基)。
为了避免疑问，在本发明的聚合物或共聚物中两个或更多个取代基的同一性可能相同的情况下，各个取代基的实际同一性不以任何方式相互依赖。
可以提及的本发明的实施方式包括涉及本发明的聚合物或共聚物的那些，其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-3烷基；
R2至R8和R11各自独立地表示H或甲基；
R9和R12各自独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-3烷基；
R13表示H或C1-3烷基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2R13，或更特别地，H或C1-3烷基；
m是选自0至4中的数字；
n是选自2至8中的数字；
p是选自0至3中的数字；
q是选自0至1中的数字；
x是选自2至8中的数字；以及
y是选自0至1中的数字。
可以提及的本发明的其他实施方式包括涉及本发明的聚合物或共聚物的那些，其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-6烷基(例如当存在时，R1和R10独立地表示C1-3烷基)；
R2至R8和R11各自独立地表示H；
R9和R12各自独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
m是选自0至3中的数字；
n是选自2至7中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q和y为0；以及
x是选自2到7中的数字。
可以提及的本发明的还其他实施方式包括涉及本发明的聚合物或共聚物的那些，其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-6烷基(例如当存在时，R1和R10独立地表示C1-3烷基)；
R2至R8和R11各自独立地表示H；
R9和R12各自独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
m是选自0至3中的数字；
n是选自2至7中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q和y为0；以及
x是选自2到7中的数字。
可以提及的本发明的仍还其他实施方式包括涉及本发明的聚合物或共聚物的那些，其中：
当存在时，R1和R10独立地表示C1-6烷基(例如当存在时，R1和R10独立地表示C1-3烷基)；
R2至R8和R11各自独立地表示H；
R9和R12各自独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
X表示CR14R15或O；
R14和R15独立地表示CO2H，或更特别地，H或甲基；
m是选自0至2中的数字；
n是选自2至7中的数字；
p是选自0至2中的数字；
q和y为0；以及
x是选自2到7中的数字。
本发明的聚合物和共聚物可以具有任何合适的数均分子量。例如，本发明的聚合物和共聚物具有的数均分子量可以为500至7,000道尔顿，诸如500至5,500道尔顿，诸如500至2,500道尔顿(例如500至2,000道尔顿，诸如1,000至2,000道尔顿)或4,000至5,500道尔顿(例如4,000至5,000道尔顿)。
可以提及的本发明的实施方式包括其中本发明的聚合物是选自以下列表中的化合物的那些：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
，任选地，其中聚合物的数均分子量为4,000至5,000道尔顿；以及
(vii)
在特定的实施方式中，本发明的聚合物可以选自以上(i)至(vi)，诸如(i)或(ii)。
可以提及的本发明的实施方式包括其中本发明的共聚合物是选自以下列表中的化合物的那些：
(i)
(ii)
在本文中可以提及的本发明的某些实施方式中，本发明的聚合物或共聚物可以是聚合物。
可以提及的本发明的其他实施方式包括其中本发明的聚合物或共聚物被同位素标记的那些。然而，可以提及的本发明的其他特定实施方式包括其中本发明的聚合物或共聚物没有被同位素标记的那些。
当在本文中使用时，术语“同位素标记的”包括对在化合物中的一个或多个位置上存在非天然同位素(或同位素的非天然分布)的本发明的聚合物或共聚物的提及。本领域技术人员将理解本文中提及的“化合物中的一个或多个位置”是指本发明的聚合物或共聚物的一个或多个原子。因此，术语“同位素标记的”包括对在聚合物或共聚物中一个或多个位置上同位素富集的本发明的化合物的提及。
本发明的聚合物或共聚物的同位素标记或富集可以涉及氢、碳、氮、氧、硫、氟、氯、溴和/或碘中的任一种的放射性或非放射性同位素。在这方面可以提及的特定同位素包括2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、35S、18F、37Cl、77Br、82Br和125I)。
当本发明的聚合物或共聚物用放射性或非放射性同位素标记或富集时，可以提及的本发明的聚合物或共聚物包括化合物中至少一个原子显示出同位素分布的那些，其中所讨论原子的放射性或非放射性同位素的水平比该放射性或非放射性同位素的天然水平高至少10％(例如10％至5000％，特别是50％至1000％，更特别是100％至500％)。
如上所述，本发明的聚合物或共聚物为氯化物盐的形式。令人惊奇地发现，所述盐比乙酸盐更有效，并且对哺乳动物细胞的毒性也令人惊讶地低得多。出乎意料的是，抗衡离子的变化会产生如此深远的影响。
如上所述，本发明的聚合物和共聚物可用于治疗微生物和真菌感染。因此，还提供了包含本发明的聚合物或共聚物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的聚合物或共聚物可以通过任何合适的途径给药，而特别地可以口服、静脉内、肌内、皮肤、皮下、透粘膜地(例如舌下或颊)、直肠、透皮、鼻、肺(例如气管或支气管地)、局部的方式，通过任何其他肠胃外途径，以包含药学上可接受的剂型的该化合物的药物制剂形式给药。可以提及的特定给药模式包括口服、静脉内、皮肤、皮下、鼻、肌内或腹膜内给药。
本发明的聚合物或共聚物通常将与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合作为药物制剂给药，其可以通过适当考虑预期的给药途径和标准药学实践来选择。这样的药学上可接受的载体在化学上对活性化合物是惰性的，并且在使用条件下可以没有有害的副作用或毒性。合适的药物制剂可以在例如Remington The Science and Practice ofPharmacy,19th ed.,Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania(1995)中找到。对于肠胃外给药，可以使用肠胃外可接受的水溶液，其不含热原并且具有必需的pH、等渗性和稳定性。合适的解决方案是技术人员众所周知的，文献中描述了许多方法。药物递送方法的简要综述也可以在例如Langer,Science(1990)249,1527中找到。
否则，本领域技术人员可以使用常规技术和/或根据标准和/或公认的药学实践来常规地制备合适的制剂。
在根据本发明使用的任何药物制剂中本发明的聚合物或共聚物的量将取决于多种因素，诸如待治疗的病症的严重程度，待治疗的特定患者以及被使用的化合物(一种或多种)。无论如何，本领域技术人员可以常规地确定制剂中本发明的聚合物或共聚物的量。
例如，固体口服组合物诸如片剂或胶囊剂可包含1至99％(w/w)的活性成分；0至99％(w/w)稀释剂或填充剂；0至20％(w/w)的崩解剂；0至5％(w/w)的润滑剂；0至5％(w/w)的助流剂；0至50％(w/w)的造粒剂或粘合剂；0至5％(w/w)的抗氧化剂；以及0至5％(w/w)的颜料。控释片剂可另外包含0至90％(w/w)的控释聚合物。
肠胃外制剂(诸如注射用溶液剂或混悬剂或输注溶液剂)可含有1至50％(w/w)的活性成分；和50％(w/w)到99％(w/w)的液体或半固体载体或媒介物(例如溶剂，诸如水)；以及0-20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂，诸如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮稳定剂、张力调节剂和防腐剂。
取决于要治疗的疾患和患者以及给药途径，可以以变化的治疗有效剂量向有需要的患者给药本发明的聚合物或共聚物。
然而，在本发明的上下文中，向哺乳动物，特别是人的给药剂量应足以在合理的时间内在哺乳动物中产生治疗响应。本领域技术人员将认识到，确切的剂量和组合物以及最合适的递送方案的选择还将尤其受到以下影响：制剂的药学特性，治疗的病症的性质和严重程度以及接受者的身体状况和心理敏锐度，以及特定化合物的功效，待治疗患者的年龄、病症、体重、性别、响应，以及疾病的阶段/严重程度。
给药可以是连续的或间歇的(例如通过推注)。剂量还可以通过给药的时间和频率来确定。在口服或肠胃外给药的情况下，本发明的聚合物或共聚物的剂量可以为每天约0.01mg至约1000mg。
无论如何，医生或其他技术人员将能够例行确定最适合个体患者的实际剂量。上述剂量是一般情况的示例；当然对于个体病例，应当使用更高或更低的剂量范围，这也在本发明的范围之内。
本文所述的本发明的方面(例如上述聚合物和共聚物、方法和用途)可具有以下优点：在治疗本文所述的病症中，与现有技术中已知的用于治疗这些病症或其他的类似化合物、组合、方法(治疗)或用途相比，它们对于医师和/或患者更加便利，具有更高的功效，更低的毒性，更好的选择性，更大的活性范围，更高的效力，产生更低的副作用或可以具有其他有用的药学特性。
本发明的聚合物和共聚物可以根据本领域技术人员众所周知的技术制备，例如，如下文实施例部分所述。
可以使用常规技术(例如重结晶、柱色谱、制备型HPLC等)从它们的反应混合物中分离出本发明的化合物。
本发明的聚合物和共聚物显示出显著的抗微生物作用，尤其是针对致病性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，因此还可以起到对抗皮肤菌群的作用，例如干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)(引起身体异味的细菌)，以及酵母和霉菌。因此，它们还适用于皮肤和粘膜的消毒，也适用于外皮附属物(头发)的消毒，因此也适用于手和伤口的消毒。
鉴于以上所述，本发明的聚合物和共聚物可用作个人护理制剂中的抗微生物活性成分，例如洗发剂、沐浴添加剂、护发产品、液体和固体皂(基于合成表面活性剂以及饱和和/或不饱和脂肪酸的盐)、洗液(化妆水，lotion)和乳膏(面霜，cream)以及其他水性或酒精性溶液，例如皮肤清洁液。
因此，还提供了包含本发明的聚合物或共聚物和表面活性剂的抗微生物和/或抗真菌洗涤剂组合物。应当理解，该组合物还可包含另外的化妆品上可耐受的载体和/或佐剂。所述组合物可以特别地为洗发剂的形式或为固体或液体皂的形式，但是也可以考虑如上所述的其他组合物(例如，其他护发产品、洗剂和乳膏等)。
洗涤剂组合物可包含按重量计0.01至15％，诸如按重量计0.5至10％的本发明的聚合物或共聚物。应当理解，本发明的多于一种的聚合物和共聚物可以形成洗涤剂组合物的一部分。
取决于洗涤剂组合物的形式，除本发明的聚合物或共聚物外，它将包含其他成分，例如螯合剂、着色剂、香料油、增稠或固化剂(稠度调节剂)、润肤剂、UV吸收剂、皮肤保护剂、抗氧化剂、改善机械特性的添加剂，诸如二羧酸和/或C14-C22脂肪酸的Al、Zn、Ca和Mg盐，以及可选的防腐剂。
洗涤剂组合物可以配制成油包水或水包油乳液，配制成醇的或含醇的制剂，配制成离子性或非离子性两亲脂质的囊状分散体，配制成凝胶，配制成固体棒或配制成气雾剂。
作为油包水或水包油乳液，洗涤剂组合物可包含5至50wt％的油相，5至20wt％的乳化剂和30至90wt％的水。油相可以包含任何适用于化妆品制剂的油，例如一种或多种烃油、蜡、天然油、硅油、脂肪酸酯或脂肪醇。优选的一元醇或多元醇是乙醇、异丙醇、丙二醇、己二醇、甘油和山梨糖醇。
洗涤剂组合物可以以多种制剂提供。合适的组合物的实例包括但不限于，皮肤护理制剂(例如片剂或液体皂形式的皮肤洗涤和清洁制剂、无皂洗涤剂或洗涤膏)、沐浴制剂(例如液体组合物，诸如泡沫浴、牛奶制剂、淋浴制剂，或固体浴制剂)、剃须制剂(例如剃须皂、泡沫剃须膏、非泡沫剃须膏、泡沫和凝胶、用于干剃的须前制剂、须后或剃须后洗剂)、美容用头发处理制剂(例如洗发剂和护发素形式的洗发制剂、护发制剂，例如预处理制剂、头发滋养剂、定型膏、定型凝胶、润发油、润发素、护理包、密集型头发处理、头发构型制剂，例如用于永久波(热波、温和波、冷波)的卷发制剂、拉直头发的制剂、液体头发定型制剂、泡沫、发胶、漂白制剂；例如过氧化氢溶液、美亮洗发剂、漂白霜、漂白粉、漂白膏或油、临时、半永久或永久染发剂、包含自氧化染料的制剂或天然染发剂，诸如指甲花或甘菊)。
抗微生物皂可以具有，例如，如下的组成：
按重量计0.01至5％的本发明的聚合物或共聚物；
按重量计0.3至1％的二氧化钛；
按重量计1至10％的硬脂酸；以及
其余为皂基，例如牛脂脂肪酸和椰子脂肪酸或甘油的钠盐。
洗发剂可以具有例如以下的组成：
按重量计0.01至5％的本发明的聚合物或共聚物；
按重量计12.0％月桂醇聚醚-2-硫酸酯钠；
按重量计4.0％椰油酰胺基丙基甜菜碱；
按重量计3.0％的NaCl；以及
水至100wt％。
现在将描述体现本发明的某些方面的非限制性实施例。
实验
材料和方法
甲醛溶液(37wt％)、乙二醛溶液(40wt％)和所有二胺均购自Sigma-Aldrich。乙酸、L-赖氨酸、3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)购自Alfa Aesar。
使用的细菌菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 8739)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 29213)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(PAO1)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter Baumannii)(ATCC 19606)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)(ATCC13883)和耐药金黄色葡萄球菌菌株MRSA BAA40和MRSAUSA300、粪肠球菌(Enterococcus faecium)(OR1RF)、耐万古霉素的粪肠球菌(VRE V583)、多药耐药性大肠杆菌(EC958)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(ATCC13047)购自ATCC。耐碳青霉烯(CR)和多药耐药(MDR)的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(PAER)、CR和MDR肺炎克雷伯菌、CR和MDR鲍曼不动杆菌(A.Baumannii)和分枝杆菌属菌种的临床分离株购自Kevin Pethe实验室(Nanyang Technological University)。所有的肉汤和琼脂均获自Becton Dickinson(BD)公司。
使用Bruker Avance DPX 300仪器获得NMR光谱。分子量分布是使用配备2410折射率检测器(RID)的Waters凝胶渗透色谱(GPC)系统测量，使用三个串联的超水凝胶柱和乙酸钠缓冲液(0.5M的NaOAc和0.5M的AcOH，
最小抑菌浓度(MIC)
按照最小改良的标准肉汤稀释方法测量最小抑制浓度(MIC)(Wiegand,I.,等人,Nat.Protoc.,2008,3,163-175)。简而言之，将细菌菌株的传代培养物过夜生长至对数中期，然后进行光密度(OD)检查和稀释，使细菌浓度达到5×105CFU/mL。在96孔板中，将聚合物溶液在Mueller Hinton Broth(MHB)培养基中进行两倍连续稀释，以获得一系列浓度。然后将细菌悬浮液添加到每个孔中，除了两个孔以外，其中一个是阳性对照(含有MHB培养基和细菌悬浮液，而不含聚合物)，另一个是阴性对照(仅含有灭菌的MHB培养基)。将板在摇床培养箱中混合10min，然后将其转移到37℃的培养箱中。将板孵育18小时，然后测量OD。MIC值是观察到细菌生长90％抑制的最低浓度。还进行琼脂铺板接种以确认接种细菌的浓度。
溶血试验
从健康的供体那里采集新鲜的人血，并在同一天使用。通过离心浓缩红细胞并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液洗涤两次，然后在使用前在PBS中稀释至5％v/v。在96孔板中对聚合物溶液进行两倍连续稀释，然后添加红细胞溶液，并在37℃摇床中以150rpm恒定摇动孵育1h。离心悬浮液(完整的红细胞沉淀在底部)，除去80μL上清液，然后添加到新的96孔板中。然后将样品与80μL的PBS混合，并使用酶标仪在540nm下测量吸光度。加入曲拉通X-100(PBS缓冲液中1％)作为阳性对照，将PBS溶液用作阴性对照。使用以下公式确定溶血程度：
将溶血百分比相对于聚合物浓度作图，并通过线性外推法确定HC50(引起50％红细胞溶解的浓度)。对于每种实验条件，测量两个独立的样品。
细胞毒性试验
在3T3成纤维细胞系上进行细胞毒性试验。简而言之，将3T3细胞在供给有5％CO2的培养箱中于37℃在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素/链霉素)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中培养。当达到80％融合时收获细胞，并使用血细胞计数器计数细胞浓度。将细胞以每孔1×104个细胞的密度接种在96孔板中，并使其生长24h。然后用各种浓度的聚合物处理细胞24h。然后，通过显微镜定量评价细胞存活力，并且按照制造商的方案，通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)定量。细胞存活力表示为与对照(未用聚合物处理的细胞)相比，用聚合物处理的细胞群体大小的比率。数据进行了一式三份分析，并从三个独立的实验中获得。
为了确定IC50(相对于对照而言，可将细胞数量减少50％的浓度)，使用上述方案测试了每种聚合物，八种浓度在100μg/mL至1000μg/mL的范围内，并将所得的存活力数据进行线性回归和/或用S形函数拟合并内插以获得IC50值。在进一步分析中，使用在7.8μg/mL至2000μg/mL范围内的九种浓度(2倍递增)，来代替该八种浓度，并维持方案的其余部分不变。
实施例1.合成PIM 1-7氯化物盐
咪唑鎓类聚合物合成的一般程序
使用以下基本程序来制备PIM 1-7。在100mL的圆底烧瓶中，在0℃下将浓盐酸的水溶液(37wt％，10.0g，100mmol)滴加到二胺的水溶液(10mL水中50mmol)中。30分钟后，将甲醛(在水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(在水中40wt％，7.25g，50mmol)的混合物滴加到上述溶液中。溶液的颜色逐渐从无色变为黄色。将反应混合物在80℃下再搅拌1h。除去大部分溶剂和未反应的单体，得到黄色粘稠油状液体，将其用水稀释并用透析袋(截留1kDa)透析2天。
PIM 1氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和二氨基丁烷(4.41g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM 1，产率为93％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ8.84(s,1H,咪唑-H),7.50(s,2H,咪唑-H),4.24(m,4H,-CH2-),1.91(m,4H,-CH2-)。
PIM 2氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和1,6-二氨基己烷(5.81g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM 2，产率为94％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ8.76(s,1H,咪唑-H),7.47(s,2H,咪唑-H),4.16(t,4H,-CH2-),1.85(m,4H,-CH2-),1.33(m,4H,-CH2-)。
PIM 3氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和1,8-二氨基辛烷(7.21g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM 3，产率为93％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ8.76(s,1H,咪唑-H),7.47(s,2H,咪唑-H),4.16(t,4H,-CH2-),1.84(m,4H,-CH2-),1.28(m,8H,-CH2-)。
PIM 4氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和1,5-二氨基-2-甲基戊烷己烷(5.81g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM 4，产率为95％。δ8.82(s,1H,咪唑-H),7.48(s,2H,咪唑-H),4.19(m,2H,-CH2-),3.92(m,1H,-CH-),2.07-1.83(m,4H,-CH2-),1,40-1.19(m,2H,-CH2-),0.83(s,3H,-CH3)。
PIM 5氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)和乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和2,2’-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(7.40g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM 5，产率为97％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ8.86(s,1H,咪唑-H),7.57(s,2H,咪唑-H),4.42(t,4H,-N-CH2-),3.90(t,4H,-CH2-CH2-O),3.68(m,4H,-O-CH2-CH2-O-)。
PIM 6氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)、乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺(11.0g，50mmol)，得到的黄色粘稠油状液体PIM6，产率为97％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ8.84(s,1H,咪唑-H),7.52(s,2H,咪唑-H),4.30(t,4H,-CH2-),3.65(m,8H,-O-CH2-CH2-O-),3.55(t,4H,-CH2-),2.15(m,4H,-CH2-)。
PIM 7氯化物
用甲醛(水中37wt％，2.31g，50mmol)、乙二醛(水中40wt％，7.25g，50mmol)使用一般程序处理浓盐酸(37wt％，10.0g，100mmol)和L-赖氨酸(7.2g，50mmol)，得到的黄色固体PIM 7，产率为95％。1H NMR(300MHz,D2O,25℃[ppm]):δ9.11-8.77(m,1H,咪唑-H),7.65-7.46(m,2H,咪唑-H),5.13(m,1H,-CH-),4.21(m,2H,-CH2-),2.32-1.77(m,4H),1.26(m,2H,-CH2-)。
讨论
PIM 1-7氯化物很容易由盐酸、二胺以及甲醛水溶液(37wt％)和乙二醛(40wt％)的混合物通过Debus-Radziszewski反应制备，而无需使用任何有机溶剂或惰性气体(图1)。缩聚反应在80℃下有效地进行，进料二胺和醛在90min内几乎全部消耗(表1)。在D2O中记录PIM 1-7的1H NMR光谱。所有检测到的峰都可以清楚地分配给预期产物的相应质子(图2a-g)。大约8.75和7.45ppm的峰可以分配于咪唑鎓环上的质子，这证实了阳离子五元咪唑鎓环的成功形成。GPC曲线表明，所得聚合物具有的分子量(Mn)为1000至4700Da，并且分子量分布(Mw/Mn)较窄
表1.在盐酸存在下聚合二胺、甲醛和乙二醛。
a用含有0.5M NaOAc和0.5M AcOH的水作为洗脱剂进行GPC，并用支链淀粉标准物校准。
bPDI＝多分散指数
cDP＝聚合度
实施例2.磷酸盐缓冲盐水(PBS)中PIM 1-7氯化物的粒径和ζ电势
测量了PBS中聚合物的粒径和ζ电势值(表2)。在PBS缓冲液中，所有PIM的流体力学尺寸均小于或约2nm，这表明聚合物在PBS中并未聚集，但仍保持为单独的聚合物链。所有聚合物在PBS中均显示正电荷，其ζ电势范围为+1mV至+15mV。随着烷基链长度从PIM 1增加到PIM 3，观察到ζ电势略有下降，这可能是由于具有较长烷基链的阳离子咪唑鎓的电荷密度下降所致。
表2.PBS缓冲液中PIM 1-7的大小和ζ电势测量。
实施例3.PIM 1-7氯化物对实验室细菌菌株的杀菌活性
如表3所示，使用上述MIC方案研究了PIM 1-7氯化物的亲水/疏水平衡对杀菌活性的影响。进行七种聚合物对ESKAPE细菌(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属菌种)，以及一些其他的细菌的一系列测试。
PIM 1氯化物对所有受测细菌，包括ESKAPE细菌(例如革兰氏阳性的粪肠球菌(OG1RF)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)以及革兰氏阴性的肺炎克雷伯菌(ATCC 13883和KPNS-1)、鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)、铜绿假单胞菌(PAO1，和泛敏感PAES-1)、以及大肠杆菌(EC 8739))以及枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)表现出类似抗生素的低的最低抑制浓度(MIC)(<1至8μg/mL)。
烷基链长于PIM 1的PIM 2氯化物的杀细菌活性略高于PIM 1。这与以前报道的抗细菌聚合物体系是一致的(Chin,W.,等人,Macromolecules,2013,46,8797-8807；Palermo,E.F.,等人,Biomacromolecules,2012,13,1632-1641)。疏水性的增加增强了聚合物可能的插入细菌膜的能力，因此导致更好的抗微生物特性。
但是，进一步增加PIM 3中的烷基链并不能改善其MIC值。这可能是由于聚合物重复单元中电荷分数的降低，这降低了聚合物上的静电荷与细菌之间的相互作用。这样，更长的烷基链间隔基可以使静电结合效率降低。
PIM 4氯化物被设计为具有与PIM 2相同的碳原子数，但具有支链甲基而不是线性烷基链。对它们的性能进行比较表明，PIM 4的效率低于PIM 2，这可能是由于疏水性支链烷基的空间位阻所致。
为了研究疏水性对杀细菌作用的影响，合成了碳原子数与PIM 2氯化物相同但具有其他醚键的PIM 5氯化物。当分子量保持在2000Da左右时，这种相对更亲水的PIM 5(与PIM 2相比)显示出杀菌作用的显著降低(PIM 5-1；表4，其与PIM 2的分子量非常接近)(表3)。随着分子量增加到4500Da(PIM 5-2；表4)，PIM 5表现出更好的细菌杀灭特性。
在PIM 6氯化物中也观察到了类似的效果，其中在较低分子量下，亲水部分导致较差的杀细菌活性。通过用PIM 7氯化物中的羧基取代PIM 4中的甲基，进一步研究了烷基的影响。这种改变导致杀细菌效果几乎完全丧失，表明疏水部分对促进插入细菌膜的重要性。
表4.不同分子量的PIM 5氯化物的GPC和MIC
a用含有0.5M NaOAc和0.5M AcOH的水作为洗脱剂进行GPC，并用支链淀粉标准物校准。
实施例4.PIM 1-7氯化物对临床细菌菌株的杀细菌活性
为了评估此类PIM聚合物在临床应用上的潜力(特别是对于广谱抗微生物法)，用一系列耐药菌株测试PIM 1-7氯化物，耐药菌株包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素粪肠球菌(VRE V583)、多药耐药性大肠杆菌(EC958)、泛耐药铜绿假单胞菌(PAER)和MDR铜绿假单胞菌(PAES、PAD25、PAD1和PAW238)、耐碳青霉烯(CR)肺炎克雷伯菌和CR鲍曼不动杆菌，如表5和6所示。
与ATCC/实验室菌株相比，大多数聚合物保持了相似的杀灭潜力，或处于相似的数量级。PIM保持了对MRSA、铜绿假单胞菌(PAO1)和肺炎克雷伯氏菌相似的杀灭潜力，尽管PIM1对VRE583的效力略低(但在相似的数量级)。MIC数据强烈表明，PIM对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均广谱有效。这种特性使这类聚合物优于一些新近报道的并对革兰氏阳性细菌有活性或对抗革兰氏阴性细菌有活性，但不能对二者同时有活性的抗微生物剂(例如参见Liu,Y.,等人,Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,1486-1490；Ling,L.L.,等人,Nature,2015,517,455-459；Lam,S.J.,等人,Nat.Microbiol.,2016,1,16162)。此外，PIM 1显示的抗微生物效果与比最后级别的抗微生物剂粘杆菌素(Davis,S.D.,Antimicrob.AgentsChemother.,1975,8,50-53；Liu,Y.-Y.,等人,Lancet Infect.Dis.,2016,16,161-168)更宽的细菌谱相当。
表5.PIM 1-7氯化物对各种革兰氏阳性临床细菌菌株的最低抑制浓度(MIC90，μg/mL)。
表6.PIM 1-7氯化物对各种革兰氏阴性临床细菌菌株的最低抑制浓度(MIC90，μg/mL)。
另外，每个PIM似乎具有使它们能够有效杀灭细菌，同时对哺乳动物细胞的毒性较小(或无毒)的有效的分子量范围。这些分子量范围在下表7中总结。
表7.PIM 1-7氯化物的有效分子量范围
实施例5.PIM 1氯化物对各种分枝杆菌的杀细菌活性
MIC50如前所述测定，稍作修改。(Nature Communications 1(2010):57.)简而言之，将溶解在DI水中的化合物一式两份进行两倍地系列稀释，然后通过mosquito HTS(TTPLabTech)将其点样到384孔透明板上，得到每种化合物的10个稀释。将体积为50μl的结核分枝杆菌培养物(最终OD 600为0.02)添加至每个孔，并将测定板在37℃下孵育5天。使用SpectraMax M2分光光度计记录OD600值，并使用GraphPad Prism 5软件绘制MIC50曲线。在检测设置下，落在抑制曲线的线性部分中的MIC50值比MIC90更稳健且可重现。因此，在图3a-d中仅报道了MIC50值。
实施例6.PIM 1-7氯化物对哺乳动物细胞的溶血特性和毒性
聚合物的生物相容性是根据PIM 1-7氯化物对哺乳动物细胞的溶血特性和毒性来评估的。使用上述方案测量溶解50％和10％的人类红细胞(分别为HC50和HC10)的聚合物的浓度。值得注意的是，从PIM 1氯化物到PIM 6氯化物的所有聚合物即使在10mg/mL时也不溶血(表8a和b)。所有抗微生物PIM的选择性(HC50/MIC)都很出色，某些细菌菌株的HC50/MIC值甚至超过10,000。预期聚合物的疏水性成分会导致溶血，但令人惊讶的是，PIM 1-2氯化物和PIM 4-6氯化物显示为非溶血性的。
使用上文详细描述的MTT测定法，评估了PIM 1-7氯化物对3T3成纤维细胞的毒性，其结果列于表8a和b以及图4a-c，表8还结合了100和200μg/mL的测试细胞的细胞存活力。PIM 1氯化物具有相对较高的IC50(杀灭50％的3T3成纤维细胞的聚合物浓度)和HC50(>10,000μg/mL)。与PIM 1氯化物相比，PIM 3氯化物显示出最大的细胞毒性，这可能是由于PIM 3氯化物的主链烷基链长度增加所致。众所周知，更长的烷基链长度可以使聚合物更具毒性，因为更长的疏水链可以增强阳离子表面活性剂类咪唑鎓的膜透化(Ranke,J.,等人,Ecotoxicol.Environ.Saf.,2004,58,396-404)。另一方面，显示PIM 1氯化物的毒性相对较低，这可能是由于聚合物的分子量较低和非悬空疏水性烷基性质所致，这防止了其损害哺乳动物细胞。
在聚合物主链中引入醚键(在PIM 5氯化物和PIM 6氯化物中)也大大提高了生物相容性(对细胞毒性较小)，而没有牺牲太多的抗细菌功效。这可能是由于PIM亲水性的增强，使其与细胞膜的相互作用减弱，因此对哺乳动物细胞的毒性较小。
表8a表示对材料的首次分析，然后在多种情况下进行了重现，表8b中提供了更具代表性的数据。
表8a.PIM1-7氯化物对人红细胞的溶血浓度(HC50)(μg/mL)和对3T3成纤维细胞的抑制浓度(IC50，μg/mL)。
表8b.PIM 1-7氯化物对人红细胞的溶血浓度(HC50)(μg/mL)以及对3T3成纤维细胞的细胞存活力和抑制浓度(IC50，μg/mL)。
实施例7.PIM 1-7氯化物对细菌的外膜渗透性
使用疏水的1-N-苯基-萘胺(NPN)作为探针，并按照Hancock的方案进行了较小的修改(Loh,B.,等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1984,26,546-551；Hancock,R.,等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1991,35,1309-1314)来研究细菌外膜(OM)的透化作用。将对数中期细菌沉淀并重悬于5mM HEPES缓冲液(pH＝7.2)中两次，以彻底除去先前的培养基和营养物质。将OD为0.2的细菌悬浮液与NPN试剂(在HEPES缓冲液中稀释)在黑色96孔培养板的孔中孵育几分钟，以获得稳定的荧光强度。将各种浓度的聚合物溶液添加到每个孔中，并用多通道移液器快速混合。使用Tecan酶标仪读取荧光强度。NPN的最终浓度保持在10μM，每种聚合物测量至少6个浓度。
使用1-N-苯基-萘胺(NPN)作为荧光探针，使用上述细菌外膜(OM)渗透性测定法验证了聚合物的杀灭机理。疏水性的NPN在水性环境中发微弱荧光，但在疏水性环境中发出强荧光信号。能够透化细菌OM的任何化合物都可以增强NPN的吸收，从而使更多的NPN可以分配到疏水膜内部，从而导致更高的荧光强度(Loh,B.,C.Grant,and R.Hancock,Antimicrob.Agents Chemother.,1984,26,546-551)。针对两种革兰氏阴性菌株，即大肠杆菌(EC8739)和铜绿假单胞菌(PAO1)，测试了PIM氯化物(图5a-b)。PIM 1-4氯化物在MIC浓度左右及以上时对两种菌株均表现出良好的膜透化，但在亚MIC浓度时变差(图5a-b)。这与研究充分的抗生素多粘菌素B具有相同的趋势。可通过膜组分生物合成抑制、物理损伤或脂多糖(LPS)结构破坏等干扰OM(Vaara,M.,Microbiol.Rev.,1992,56,395-411)。在这种情况下，PIM 1-4氯化物可能充当可以与阴离子LPS结合并破坏其OM结构的聚阳离子部分，从而导致NPN吸收增加。
对于PIM 5-7氯化物，还观察到浓度依赖性的荧光强度。但是，要注意的是，当PIM7的浓度降至32μg/mL或更低时，它会迅速失去透化OM的能力。值得注意的是，尽管PIM 7氯化物没有细菌杀灭活性，但其可以很好地透化OM。这可能是由于主链上的侧基羧基可以与Mg2+和Ca2+离子结合从而破坏LPS结构，从而导致NPN荧光探针被吸收。尽管PIM 7主链上的阳离子咪唑鎓电荷仍可以与LPS结合，但是负羧基可以排斥聚阴离子LPS，这降低了聚合物深入渗透细菌OM的能力。这很可能导致低程度的LPS的结构破坏，因此导致杀细菌活性差。
实施例8.PIM 1-7氯化物对细菌的内膜去极化
膜电势敏感染料碘化-3,3'-二丙基硫杂二羰花青(DiSC3(5))用于确定聚合物对细菌内膜去极化的影响。这是按照Hancock的方案并稍作修改后进行的(Zhang,L.,等人,Antimicrob.Agents Chemother.,2000,44,3317-3321)。对数中期的细菌细胞通过离心沉淀，然后重悬于5mM HEPES缓冲液中，该HEPES缓冲液补充有100mM KCl以平衡细胞质和外部K+浓度。通过将制备的细胞悬液稀释20倍至OD约为0.2来制备细胞原悬液。然后加入DiSC3(5)溶液，以在原液中提供100nM浓度的DiSC3(5)。将2mL的细胞原悬液置于石英比色皿(光程为1cm)中并进行平衡，然后添加聚合物溶液以提供100μg/mL的聚合物浓度。用Perkin-Elmer LS55型荧光光谱仪连续记录由于膜电势梯度破坏引起的荧光强度变化。
用上面详细描述的DiSC3(5)荧光测定法评估内膜(IM)的去极化。通常，由跨胞质膜质子动力势产生的电势梯度(-140mV的Δψ)是稳定的，只要所研究的化合物不会损害膜对离子的不渗透性即可。使用DiSC3(5)作为荧光探针可以很容易评价。首先，将DiSC3(5)与细菌悬液一起孵育，以使其根据电势梯度的大小吸收到细菌IM中，并自猝灭其荧光。当Δψ被化合物去极化时，DiSC3(5)染料将从IM中释放出来，导致荧光强度增加(Zhang,L.,等人,Antimicrob.Agents Chemother.,2000,44,3317-3321)。对于革兰氏阴性细菌，首先使用0.2mM乙二胺四乙酸(EDTA)透化OM，以使DiSC3(5)染料吸收到IM中。然后进行类似于革兰氏阳性细菌的程序。
对于革兰氏阳性细菌MRSA USA300和革兰氏阴性细菌EC8739而言，PIM 1-3氯化物均显示易于透化IM，导致荧光强度增加(图6a-b)。去极化的能力Δψ随着疏水性烷基链长度的增加而增加。这在PIM 3氯化物中很明显，该PIM 3氯化物在几分钟内引起荧光强度的急剧增加，荧光强度大于阳性对照(即短杆菌肽)。与PIM 2氯化物(碳原子数与PIM 4相同，但具有线性烷基链)相比，PIM 4氯化物表现出相对较差的IM破坏，这与其杀细菌特性密切相关。对于PIM 5氯化物和PIM 6氯化物，较差的IM破坏可能是由于它们的亲水性增加，导致干扰细菌IM的能力较差。
实施例9.磺基罗丹明B缀合的PIM 1和5的合成，并通过受激发射损耗(STED)显微术评价其与细菌的相互作用
由于本文中使用的PIM合成方案类似于2A+B缩聚反应，因此预计该端基为质子化胺，因为该反应是在酸性环境中进行的。为了证实这点，对PIM 1氯化物进行在氘代DMSO中的NMR，并在8.36ppm处获得了清晰的新峰，该峰对应于末端胺盐酸盐。我们使用该末端胺基团将一个罗丹明衍生物染料分子与PIM 1和PIM 5缀合用于STED成像。
为了通过受激发射损耗(STED)显微术直接可视化聚合物与微生物的相互作用，通过将聚合物链的胺端与磺酸盐基团缀合，合成了磺基罗丹明B与PIM 1和PIM 5的缀合物，如图7所示。简而言之，首先将2.5当量的三乙胺(TEA)添加到PIM 1的DMF溶液中，以除去聚合物链胺端的盐酸盐。然后将磺基罗丹明B酸氯(1.2当量)引入上述溶液中，并在黑暗环境中搅拌过夜。然后将溶液透析2天以完全除去盐和残留的染料。冻干之后，得到最终的磺基罗丹明B-PIM 1缀合物。磺基罗丹明B-PIM 5缀合物的合成方法与上述相似。
为了制备可视化样品，从琼脂平板上挑出单个菌落，在MHB培养基中培养过夜，然后继代培养以达到指数期。将细菌沉淀并用PBS洗涤两次，然后将其调节至1×108CFU/mL的浓度。然后将其加入所需浓度(即0.5×MIC、1×MIC和2×MIC)的磺基罗丹明B缀合的聚合物中，并孵育2h。然后将标记的细菌悬液用PBS洗涤一次，然后在4％多聚甲醛中固定30min。然后将细胞用PBS洗涤两次，然后与FM1-43FX膜染料在冰上孵育10min。再次用PBS洗涤细胞两次，然后使用指甲油将其密封在载玻片中，然后通过STED显微术成像。
用磺基罗丹明B-PIM 1和PIM 5缀合物(浓度范围约等于0.5×MIC、1×MIC和2×MIC)处理和未处理的铜绿假单胞菌(PAO1，用FM1-43FX膜染料标记)的荧光图像如图8和9所示。在0.5×MIC下观察到磺基罗丹明B-聚合物缀合物和膜染料的清晰共定位。在较高浓度下，PIM 1缀合物溶解细胞膜并进入细胞质，从而充分渗透到相当大部分细胞的胞液中。这表明PIM 1首先通过静电相互作用与细菌膜结合，然后引起进一步渗透并损伤膜。
对于PIM 5缀合物，即使在低0.5×MIC浓度下，也发现该聚合物既存在于细菌细胞的表面和细菌细胞内，这表明该聚合物具有更好的渗透细菌膜的能力(图9)。这可能是由于PIM 5中的醚基有利于氢与PAO1的膜脂质的键合。在较高的浓度下，聚合物对膜的损伤更大，因此导致更多的缀合物进入胞液。还使用MRSA USA300进行了超分辨率STED显微术检查(图10)，并观察到了类似的共定位作用。
实施例10.评价PIM 1和PIM 5氯化物对PAO1和MRSA USA300细菌的杀灭动力学
最终浓度分别为4×、2×、1×和0.5×MIC的PIM 1氯化物和PIM 5氯化物与指数期的PAO1和MRSA USA300细胞一起恒定震荡孵育。在不同的时间点(5、15、30、45、60、90和120min)取等分的悬液，使用点铺板法确定CFU/mL。对每种聚合物/病原体组合进行了两次独立的实验。
如图11a和c所示，细菌杀灭动力学表明PIM 1氯化物和PIM 5氯化物都可以以极快的速率杀死PAO1。在4×MIC浓度下，PIM 1和5氯化物都能在5min内消除几乎所有的PAO1，表明这种PIM具有杀灭细菌作用而不是抑菌作用。PIM 1氯化物和PIM 5氯化物杀灭耐药MRSAUSA300的速度更慢，但在不到45min内观察到了大于99.99％的杀灭(图11b和d)。
实施例11.在PIM 1和5氯化物存在下SA29213的抗性进化
为了通过连续传代测试抗性发展，将指数期的SA ATCC 29213稀释到在1mL含不同浓度聚合物(2×、1×和0.5×MIC)的MHB培养基中1×107CFU/mL，然后在37℃下恒定震荡孵育(Ling,L.L.,等人,Nature,2015,517,455-459)。每隔24h监测细菌的生长，来自培养基的培养物包含允许细菌生长(OD600>0.2)的最高浓度的聚合物，用含有2×、1×和0.5×MIC聚合物的新鲜培养基按1:100稀释。评价抗性21天(或更长时间)，直到达到MIC/MIC原始的显著高值。在不同时间点将细菌等分试样储存在甘油中，并在-80℃下保存，以便在观察到抗性发展时进一步研究。氧氟沙星用作阳性对照。
连续21天在亚MIC水平的PIM 1氯化物、PIM 5氯化物和氧氟沙星(作为阳性对照)存在下，通过SA29213的连续传代测定抗性进化(图12)。对于氧氟沙星对照，抗性进化到超过128MIC倍数变化。尽管PIM 1和5氯化物可以非特异性杀灭细菌，但是用PIM 5氯化物处理的细菌在十天内迅速产生了抗性。另一方面，用PIM 1氯化物处理的细菌仅在十天后才表现出非常轻微的抗性，MIC值很低并且在临床剂量范围内。这是令人惊讶的，因为已知细菌难以对非特异性杀伤化合物产生抗性。因此，推论出PIM1氯化物和PIM 5氯化物通过不同的机制或通过多模式机制杀死不同的细菌。
实施例12.PIM 1氯化物对小鼠败血病模型的体内功效
鉴于PIM 1氯化物具有出色的细菌杀灭特性和生物相容性，使用小鼠败血病模型在体内测试了该聚合物的治疗功效(图13)。Balb/c雌性小鼠(7周，隔离一周)用于测试PIM1的PAO1败血性休克的保护功效。收集指数期PAO1，并用PBS洗涤两次，然后重悬于相同体积的PBS中。经由腹膜内注射将300μL的含有3×107CFU的PAO1的细胞悬液引入每只小鼠中以诱导败血性休克。在感染后0.5h、4h和8h，以0.25mg/kg、0.5mg/kg和1mg/kg PIM 1的3种确切IP剂量对小鼠(每组5只)进行治疗，在同样的时间点，向阳性和阴性对照组小鼠分别注射1mg/kg粘杆菌素和相同体积的PBS。监测小鼠的存活率超过7天。
阴性对照组中超过90％的小鼠在感染PAO1后24h内死亡。用粘杆菌素治疗的小鼠仅具有80％的存活率，而所有用0.5mg/kg和1mg/kg的PIM 1氯化物治疗的小鼠均存活而没有明显的不良副作用。
在另一项研究中，小鼠(每组5只)在感染PAO1后1h、4h和8h用不同剂量的PIM 1治疗。阳性和阴性对照组的小鼠在同一时间点分别注射2mg/kg的亚胺培南和相同体积的PBS。在第12小时，所有的小鼠通过注射3.0mL的PBS进入腹膜内腔来进行腹腔冲洗，随后通过按摩腹部1min而安乐死。之后，回收约1mL腹膜液以计算细菌的CFU以及进行免疫细胞定量。还评估了动物的脾脏、肝脏和肾脏的细菌负荷。
对于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(CRAB)和耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌(CRPA)败血病保护模型，应谨慎进行类似程序，并将5％粘蛋白与细菌一起注射，以使小鼠免疫功能低下(其结果与住院患者相似的情况)。使用单向方差分类分析(ANOVA)和学生t检验(Graphpad Prism for Windows,版本7)分析细菌的量。对于未经任何治疗的感染对照，由于动物都垂死了，因此在12h内将其处死。
为了定量腹膜液中PAO1 CFU，通过腹膜内途径使用两个给药方案中的一个(感染后1、4和8h三剂，每剂2mg/kg的PIM 1氯化物；或感染后1h，6mg/kg的单剂)给药PIM 1氯化物。所用的对照抗生素为亚胺培南，2mg/kg，分3剂(感染后1、4和8小时)给药。感染后12h对小鼠实施安乐死，并分析腹膜内液中PAO1的量。对于两种治疗方案，与阴性对照相比，PIM 1氯化物导致腹膜液中PAO1细菌数量的5个数量级的减少(图14a)。另外，观察到PIM 1氯化物与亚胺培南一样有效。
接下来，用体内腹膜败血病模型针对PAER(耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌(CRPA)细菌菌株)测试了PIM 1氯化物的功效。用碳青霉烯(例如亚胺培南)作为抗生素对照，未观察到腹膜内液中CRPA数量的减少，并且小鼠在感染后12h内垂死(图14b)。使用PIM 1氯化物的情况下，分别使用6mg/kg(1剂)和2mg/kg(3剂)可实现腹膜内CRPA的3.75和5.80个数量级的优异的细菌清除。
还对AB-1(耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌(CRAB)菌株)进行了PIM 1氯化物的功效测试，对于新抗生素，AB-1是一种需要注意的关键细菌。与PAER相似，与感染对照相比，阳性对照亚胺培南未显示出从腹膜液中除去任何AB-1(图14c)。PIM 1氯化物显示在体内根除AB-1有效。对于与亚胺培南相似的给药方案(即2mg/kg×3剂)，用PIM 1氯化物治疗的感染小鼠显示腹膜液中细菌显著减少了6.46个数量级(图14c)。同样，单剂量治疗可实现7.20个数量级的出色降低。
实施例13.PIM 1氯化物对小鼠皮肤感染模型的体内功效
还评价了PIM 1氯化物作为局部药物的潜力。CRAB和CRPA通常与开放性伤口相关，其会大大减慢愈合过程。为了评价PIM 1氯化物在伤口模型中的效力，先使用活检穿孔器在剃毛小鼠的背部皮肤上形成伤口，然后引入细菌。通过吸移将106CFU的细菌(野生型PAO1、CRAB或CRPA)引入到伤口上，并立即用Tegaderm层覆盖。在第4h感染的时间点，通过在Tegaderm层之下注射聚合物或抗生素来进行抗微生物治疗，随后用另一层Tegaderm覆盖伤口。处理24h后，收获1×1cm中央有伤口的正方形小鼠皮肤，均质，然后铺板。PBS用作阴性对照，亚胺培南用作阳性对照。
在消灭细菌时，PIM 1氯化物在低剂量下再次表现出很高的活性。将PIM 1氯化物以1mg/kg的剂量直接在伤口上一次给药时，细菌负荷减少了大约99.9％(图15b和图15c)。较高的剂量耐受性好，对CRPA和CRAB细菌均具有很强的抗细菌效力。
这些结果表明，合成的聚合物在败血病保护和局部伤口小鼠模型中均可有效(即有效)对抗两种最关键的MDR革兰氏阴性细菌(CRAB和CAPA)，表明该化合物可能临床环境中有效。
实施例14.含乙酸盐的PIM 1-7以及共聚物的合成与特性
含乙酸盐的PIM 1-7的合成程序遵循实施例1的方法，不同之处在于使用乙酸代替相同当量的盐酸。反应中所用酸的选择决定了聚咪唑鎓的抗衡阴离子。
对于合成含乙酸盐的共聚物，该程序与实施例1相似，不同之处在于，使用了特定摩尔百分比的两种二胺的混合物代替了单一类型的二胺(图16)。用乙酸得到含乙酸盐的共聚物。
然后使用上述方案表征含乙酸盐的PIM 1-7和共聚物，分别评价其对一系列细菌和对3T3成纤维细胞杀菌特性和毒性(表9)。与含氯化物的PIM 1-7(表3-8)相比，很明显，含乙酸盐的PIM 1-7在杀灭细菌方面效果较差，并且对哺乳动物细胞表现出更高的毒性。
表9.含乙酸盐的PIM的物理和生物学特性。
