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一种富含油脂的栅藻及其培养应用

2021-03-21 05:41:25

一种富含油脂的栅藻及其培养应用

　　技术领域

　　本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种富含油脂的栅藻及其培养应用。

　　背景技术

　　由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。

　　随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重，除此之外来自石油和化工行业的工业废气中，除了含有高浓度CO2气体（15v%-30v%）外，SOx、NOx等酸性气体的浓度也很高。微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx%20等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少了有害气体排放。因此，利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

　　目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻（Scenedemus%20sp.）藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN201110427579.6公开了一株栅藻藻株(Desmodesmus%20sp.)%20ENN2203A，该栅藻藻株具有耐高温、易收集的特点，环境适应性强，适于高密度养殖，可用于含氮磷污水的污处理，可用于二氧化碳减排，用于生物柴油生产或用于水产品饵料或动物饲料等。但是，该藻株在培养过程中，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，培养进行到第16%20天，最终干重达到10.93g/L。但是在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率。而且当通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx等气体时，也会抑制微藻生长和降低固碳效率。

　　发明内容

　　针对现有技术的不足，本发明提供了一种富含油脂的栅藻及其培养应用。本发明提供的栅藻能够耐受高浓度的SO2，可以利用含CO2和SO2的烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。

　　本发明富含油脂的栅藻HY-D3，其分类命名为栅藻（Scenedesmus%20acutus），已于2018年2月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.%2015298。

　　本发明提供的富含油脂的栅藻HY-D3在显微镜下藻细胞呈绿色，常聚集成群，群体常见为4-8个细胞的组成，群体细胞排列成一直线。单个细胞为长圆形、卵形，细胞壁平滑，内有色素体，每个细胞含有一个蛋白核，单个细胞长约3-6μm，宽约2-3μm。群体两侧细胞的上下两端，各具1长或直或略弯曲的剌，中间部分细胞的两端及两侧细胞的侧面游离部上，均无棘剌。4细胞的群体宽10-24微米，剌长10-13微米。

　　本发明提供的富含油脂的栅藻HY-D3能够耐受CO2的浓度可达40v%，耐受SO2的浓度可达400×10-6（v/v），SO2的去除率达到50%以上。

　　本发明提供的富含油脂的栅藻HY-D3的18S%20rDNA基因测序分析结果见序列表。根据序列比对，本发明的栅藻HY-D3与已公布的栅藻藻株的18S%20rDNA数据存在差异。

　　本发明富含油脂的栅藻HY-D3的培养方法，在光生物反应器中，利用BG11、SE等淡水培养基培养，在光照强度1500-20000Lux，pH值为6-9，温度为20-40℃下培养，从反应器底部通入CO2含量为5v%-40v%的气体，培养至稳定期结束，收获微藻细胞。经检测，藻细胞干重达到8g/L以上，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。

　　本发明的栅藻HY-D3在固定CO2中的应用。该藻株能够耐受高达40v%的CO2浓度，具有较高的CO2固定效率。

　　本发明的栅藻HY-D3在生产微藻油脂中的应用。该栅藻藻株在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

　　本发明的栅藻HY-D3在净化含CO2和SO2的废气或烟气中的应用。该藻株可以利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO2含量不超过40v%，SO2含量不超过400×10-6（v/v）。具体为利用BG11、SE等淡水培养基培养，从反应器底部通入含CO2和SO2的烟气，培养的光照强度1500-20000Lux，pH值为5-9，温度为10-40℃。

　　本发明的栅藻HY-D3还能耐受低温，在低至10-15℃的温度下仍能正常生长，保持较高的生物量产量。

　　与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

　　（1）本发明选育的栅藻HY-D3能够耐受高浓度的SO2，可以利用废气中的CO2进行自养生长，固定CO2，缓解目前工业社会带来的温室效应问题；同时能够耐受废气中的SO2，避免了微藻利用废气生长时高浓度SO2对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。

　　（2）该藻株在固定烟气中CO2%20的同时，可以利用烟气中的部分SO2，通过硫代谢途径转化为藻细胞的生物大分子，可以净化烟气。

　　（3）该藻株的生长速率快，生长周期短，不超过10天，藻细胞所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题。

　　生物材料保藏说明

　　本发明提供的栅藻（Scenedesmus%20acutus）HY-D3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号%20中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC%20No.%2015298；保藏日期：2018年2月5日。

　　具体实施方式

　　下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，v%为体积分数。

　　实施例1%20分离和驯化筛选获得栅藻HY-D3

　　（1）出发藻株的获得：2013年10月从黑龙江黑鱼明湖取回水样150mL，将水样用纱布过滤，除去大的杂质，取过滤后的水样50ml接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为HY-3。

　　（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养10天后结束，反复驯化培养3次。

　　（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。

　　（4）SO2的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，培养光照为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入SO2气体对藻种进行SO2的耐受性培养，培养过程中混合气中SO2的含量从50×10-6（v/v）逐级提高到400×10-6（v/v），培养过程中每天提高100×10-6（v/v），培养10天结束，反复驯化培养3次，收获耐受SO2的藻液。

　　（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为HY-D3。

　　实施例2%20藻株的鉴定

　　将获得HY-D3藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S%20rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S%20rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S%20rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Scenedesmus%20acutus有最大的相似性，其BLASTn值为2614，Max%20index值为99%，可以确定HY-D3为栅藻（Scenedesmus%20acutus）。

　　实施例3%20栅藻HY-D3的应用

　　将对数生长期的HY-D3的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表1和表2，培养在光生物反应器中进行，接种后培养液的OD690为0.2。从反应器底部通入CO2含量为30v%的烟气，其中SO2含量为400×10-6（v/v）。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养7天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量；并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测，HY-D3藻株的生物质产量为8.1237g/L，细胞总脂含量占细胞干重的%2041.56%。

　　表1%20BG11培养基

　　*表2 表1中A5+Co solution的组成

　　实施例4 HY-D3和HY-3的生长效果的比较

　　将对数生长期的HY-D3和HY-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，，接种后的密度调整为OD690为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO2和SO2混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为10天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表3。从结果可以看出，经过驯化筛选的HY-D3比初始藻株HY-D3对CO2和SO2有较好的耐受性，生物量稳定性好，同时对SO2也有较高的脱除率。

　　表3 不同CO2和SO2含量的效果比较

　　实施例5 HY-D3和HY-3的耐低温性

　　将对数生长期的HY-D3和HY-3的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在光生物反应器中进行，接种后的培养液的OD690为0.2。从反应器底部通入CO2含量为10v%的烟气，其中SO2含量200×10-6（v/v）。培养过程中光照强度为8000Lux，pH值控制在7-8，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天。培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如表4。

　　表4 HY-D3和HY-3培养结果对比