用于产生浓缩的多不饱和脂肪酸油的过程
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月7日提交的美国临时专利申请号62/542,053的申请日的权益，其公开内容在此通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及富含多不饱和脂肪酸，特别是花生四烯酸的油组合物；包含该油组合物的组合物；以及制备和使用该油组合物的方法。
背景技术
脂肪酸基于碳链的长度和饱和特性进行分类。基于链中存在的碳数，脂肪酸被称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间不存在双键或三键时被称为饱和脂肪酸，且当存在双键或三键时被称为不饱和脂肪酸。不饱和长链脂肪酸当仅存在一个双键或三键时为单不饱和的，而当存在一个以上双键或三键时为多不饱和的。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是基于从脂肪酸的甲基末端开始的第一个双键的位置进行分类的；ω-3(n-3)脂肪酸在从甲基末端算起第三个碳上具有第一个双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳上具有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是具有22个碳的链长和6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名为“22:6n-3”。其他ω-3LC-PUFA包括二十碳五烯酸(“EPA”)，命名为“20:5n-3”，以及ω-3二十二碳五烯酸(“DPA n-3”)，命名为“22:5n-3”。ω-6LC-PUFA包括花生四烯酸(“ARA”)，命名为“20:4 n-6”，以及ω-6二十二碳五烯酸(“DPA n-6”)，命名为“22:5n-6”。
花生四烯酸(ARA，20：4n-6)是属于ω-6类别的LC-PUFA。此分子可以通过细胞色素P450(CYP450)家族中的酶进行单加氧化或环氧化，并且代谢物基于产生部位(许多器官中的血管内皮、肺、管状和角膜上皮、肝脏等)具有不同的生物学功能。可能的靶标是酶(Na+-K+-ATP酶)或离子通道(钙激活的钾通道)。骨骼肌是花生四烯酸保留的特别活跃的部位。花生四烯酸除了作为参与调节诸如PLC-γ、PLC-δ和PKC-α、-β和-γ亚型等信号传导酶的脂质第二信使参与细胞信号传导外，还是关键的炎症中间物并且起到血管扩张剂的作用。
ARA浓缩的油可以单独用作专门的活性药物成分(API)分子(例如，针对疼痛、炎症、神经和脑疾病以及认知障碍的管理的分子)的构成单元。它也可以单独、与ω-3，ωa-7和其他适用于预防或管理疼痛和炎症、神经系统和脑部疾病以及认知障碍的物质组合用作膳食补充剂。获得此ARA浓缩物开启了其他可能性，例如制造其他高效的ARA形式。
从起始油中浓缩ω-3脂肪酸(诸如EPA和DHA)的方法是已知的并且相对简单，导致效力大于95％。然而，通常由于典型地从来自被孢霉属(Mortierella)的真菌的发酵中获得的起始油的组成，浓缩ARA提供了更佳显著的挑战。
因此，仍需要从起始油中浓缩ARA以获得可观产率的高效ARA油的方法。
通过权利要求书中表征的实施方案提供了对此技术问题的解决方案。
发明内容
本申请涉及从起始油，例如从高山被孢霉(Mortierella alpina)发酵获得的油产生富含ARA的油的过程。通常，该过程包括，例如通过在乙醇钠的存在下使用干乙醇将起始油酯交换成其相应的乙酯形式，然后进行蒸馏，例如，刮膜蒸发、分馏或短程蒸馏。然后使用例如在95％乙醇中的尿素使馏出物进行第一次尿素络合步骤。分离中间物后，通过反相色谱法在等度条件下在甲醇/水中进一步对中间物进行分馏。收集适当的级分，浓缩，并进行第二次尿素络合步骤，分离并稳定产物。
本申请还公开了通过本文描述的过程产生的油。
本申请进一步公开了包含按重量计至少约70％的ARA的微生物油。特别地，微生物油可以获自一种或多种微生物，诸如，例如，微藻、细菌、真菌和原生生物。在一些实施方案中，微生物是真菌。在优选的实施方案中，所述真菌是被孢霉属的。在更优选的实施方案中，该微生物是高山被孢霉种的。
还提供了用于非人类或人类的食品、化妆品或药物组合物，其包含本文所述的油。在一些实施方案中，食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养性饮品或其组合。在一个优选的实施方案中，食品是婴儿配方食品或膳食补充剂。
附图说明
为了进一步理解本公开的性质、目的和优点，应当参考结合以下附图阅读的以下详细描述，其中相同的参考数字表示相同的元素。
图1示出了本发明的示例性过程。
图2示出了比较过程。
发明详述
在进一步描述本公开之前，应理解，本公开不限于以下描述的本公开的特定实施方案，因为可以做出特定实施方案的变型并且仍落在所附权利要求的范围内。还应当理解，所采用的术语是出于描述特定实施方案的目的，而不意图是限制性的。相反，本公开的范围将由所附权利要求书确定。
在本说明书和所附的权利要求书中，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在一个方面，本公开的特征在于一种产生富含长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的油的过程。在一个优选的实施方案中，LC-PUFA是ω-6脂肪酸。在一个更优选的实施方案中，LC-PUFA是花生四烯酸(ARA)。
起始油组合物
在一些实施方案中，起始油是微生物油或海洋油。
由微生物产生或从微生物细胞获得的油被称为“微生物油”。由藻类和/或真菌产生的油分别被称为藻油和/或真菌油。
如本文所用，“微生物”是指生物体，诸如藻类、细菌、真菌、原生生物、酵母及其组合，例如单细胞生物体。微生物包括但不限于，金藻(例如，界不等鞭毛界(Stramenopiles)的微生物)；绿藻；硅藻；鞭毛藻(例如，甲藻纲(Dinophyceae)的目的微生物，包括隐甲藻属(Crypthecodinium)的成员，诸如例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii或C.cohnii))；破囊壶菌(Thraustochytriales)目的微藻；酵母(子囊菌(Ascomycete)或担子菌(Basidiomycete))；和毛霉属(Morcor)、被孢霉属(包括但不限于高山被孢霉和Mortierella sect.schmuckeri)和腐霉菌(包括但不限于隐袭腐霉(Pythiuminsidiosum))的真菌。
在一个实施方案中，微生物来自被孢霉属、隐甲藻属、破囊壶菌属(Thraustochytrium)及其混合物。在另一个实施方案中，微生物来自寇氏隐甲藻。在另一个实施方案中，微生物来自高山被孢霉。在又另一个实施方案中，微生物来自裂殖壶菌属(Schizochytrium)种。在又一个实施方案中，微生物选自寇氏隐甲藻、高山被孢霉、裂殖壶菌属种及其混合物。
在又另一个实施方案中，微生物包括但不限于：属于被孢霉属、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、Echinosporangium属和水霉属(Saprolegnia)的微生物。
在另一个实施方案中，所述微生物来自破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微藻，其包括但不限于破囊壶菌属(种包括arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)；裂殖壶菌属(Schizochytrium)(种包括aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum、octosporum)；壶藻属(Ulkenia)(种包括吾肯氏壶藻(ameoboida)、kerguelensis、minuta、profunda、radiate、sailens、sarkariana、schiz℃hytrops、visurgensis、yorkensis)；Aurantiacochytrium属；Oblongichytrium属；Sicyoidochytium属；Parientichytrium属；Botryochytrium属；及其组合。壶藻属(Ulkenia)中描述的种将被视为裂殖壶菌属的成员。在另一个实施方案中，微生物来自破囊壶菌目。在另一个实施方案中，微生物来自破囊壶菌属。在又另一个实施方案中，微生物来自裂殖壶菌属种。
在某些实施方案中，所述油可包含海洋油。合适的海洋油的实例包括但不限于大西洋鱼油、太平洋鱼油或地中海鱼油，或其任何混合物或组合。在更具体的实例中，合适的鱼油可以是，但不限于：雪鱼油、鲣油、沙丁鱼油、罗非鱼油、金枪鱼油、海鲈鱼油、大比目鱼油、旗鱼油、梭鱼油、鳕鱼油、鲱鱼油、沙丁鱼油、鳀鱼油、毛鳞鱼油、鲱鱼油、鲭鱼油、鲑鱼油、金枪鱼油和鲨鱼油，包括其任何混合物或组合。适用于本文的其他海洋油包括但不限于鱿鱼油、墨鱼油、章鱼油、磷虾油、海豹油、鲸鱼油等，包括其任何混合物或组合。
酯化作用
在一些实施方案中，本文所述的脂肪酸可以是脂肪酸酯或酯。在一些实施方案中，脂肪酸酯包括ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸及其组合的酯。在一些实施方案中，脂肪酸酯是ARA酯。在一些实施方案中，本文所述的油或其级分被酯化以产生包含脂肪酸酯的油或其级分。术语“酯”是指脂肪酸分子的羧酸基团中的氢被另一个取代基取代。酯的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、叔丁基、苄基、硝基苄基、甲氧基苄基、二苯甲基和三氯乙基。在一些实施方案中，该酯是羧酸保护性酯基，具有芳烷基(例如苄基、苯乙基)的酯，具有低级烯基(例如烯丙基、2-丁烯基)的酯、具有低级烷氧基-低级烷基(例如，甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基)的酯，具有低级烷酰氧基-低级烷基(例如，乙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、1-新戊酰氧基乙基)的酯，具有低级烷氧基羰基-低级烷基(例如，甲氧基羰基甲基、异丙氧基羰基甲基)的酯、具有羧基-低级烷基(例如，羧甲基)的酯、具有低级烷氧基羰基氧基-低级烷基(例如，1-(乙氧基羰氧基)乙基、1-(环己基氧基羰基氧基)乙基)的酯，具有氨基甲酰基氧基-低级烷基(例如氨基甲酰基氧基甲基)的酯等。在一些实施方案中，添加的取代基是直链或环状烃基，例如C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6烯基或C1-C6芳基酯。在一些实施方案中，该酯是烷基酯，例如甲酯、乙酯或丙酯。在一些实施方案中，当脂肪酸处于纯化或半纯化状态时，将酯取代基添加至游离脂肪酸分子。
脂肪酸酯，特别是多不饱和脂肪酸酯，可以以本领域普通技术人员已知的方式制备。
例如，含有脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸的三酰基甘油酯、二酰基甘油酯和/或单酰基甘油酯可以在酸或碱的存在下与醇反应以产生酯。美国公开号2009/0023808的公开内容通过引用整体并入本文。
碱可以是，例如金属烷基氧化物。金属烷基氧化物包括乙醇钠、甲醇钠、正丙醇钠、异丙醇钠、正丁醇钠、异丁醇钠、仲丁醇钠、叔丁醇钠、正戊醇钠、正己醇钠、乙醇锂、甲醇锂、正丙醇锂、异丙醇锂、正丁醇锂、异丁醇锂、仲丁醇锂、叔丁醇锂、正戊醇锂、正己醇锂、乙醇钾、甲醇钾、正丙醇钾、异丙醇钾、正丁醇钾、异丁醇钾、仲丁醇钾、叔丁醇钾、正戊醇钾和/或正己醇钾。
在一些情况下，可以通过将钠金属、钾金属或锂金属添加到醇溶液中来制备碱。
在一些情况下，可以通过将金属氢化物(诸如，氢化锂、氢化钠或氢化钾)添加到醇溶液中来制备碱。
基于重量对重量的碱与油的比率可以例如在1：1至1000：1的范围内，包括其间的所有值和子范围，就如同明确地写出了一样。例如，基于重量对重量的碱与油的比率可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500；1、600:1、700:1、800:1或900:1。
酯化反应可以在10℃至100℃的范围内温度进行，包括其间的所有值和子范围，就如同已明确写出的一样。例如，酯化反应可以在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃下进行。
酯化反应可以在大气中或在惰性气氛(诸如氮气或氩气)下进行。
脂肪酸酯的后处理和分离可以以本领域技术人员已知的方式进行，例如，通过用有机溶剂、水或超临界流体萃取。有机溶剂可以是，例如戊烷、己烷、二乙醚、乙酸乙酯或这些的组合。水可以任选地含有其他物质，诸如碳酸氢钠、碳酸钠、氯化铵和/或稀无机酸。超临界流体可以是，诸如二氧化碳。
在一些实施方案中，有时将油进行酯交换回以将油中的酯部分的至少一部分转化为甘油三酯级分。酯交换，特别是多不饱和脂肪酸酯的酯交换，可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行。
蒸馏
在一些实施方案中，该过程包括使所述油经受至少一个蒸馏步骤，所述步骤包括将所述酯化的油进料至至少一个设备，并使所述酯化的油经受去除馏出物中的低沸点化合物的条件。
蒸馏步骤可以是分馏、短程蒸馏、降膜蒸发、刮膜蒸发器或其组合。在一个优选的实施方案中，蒸馏步骤是分馏。在另一个优选的实施方案中，蒸馏步骤是短程蒸馏。
蒸馏可以通过本领域普通技术人员已知的任何方式进行。
尿素络合
在一些实施方案中，该过程包括使油经受至少一个尿素络合步骤。在一个优选的实施方案中，该过程包括至少两个尿素络合步骤。尿素络合可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
术语“尿素/油络合物”在本文中与“尿素加合物”或“包合物”同义使用。尿素/油络合物可以在商业或实验室油处理步骤中产生，其中来自各种来源任一者的油与尿素接触。尿素优选与油中饱和和单不饱和脂肪酸/酯形成络合物，且被称为尿素/油络合物或尿素加合物。因此，尿素/油络合物是含有尿素和饱和和/或单不饱和脂肪酸/酯的组合物。尽管油的剩余级分中富含PUFA，但一些PUFA可以与尿素络合并成为尿素/油络合物的一部分。在此过程中还使用溶剂，因此残留的溶剂通常是尿素/油络合物的一部分。因此，所公开的方法开始于尿素/油络合物，其包括尿素、与尿素缔合的饱和和单不饱和脂肪酸/酯、残余量的溶剂以及任选地不期望的残余量的PUFA。
可用于形成尿素/油络合物的尿素可从多种商业来源获得。合适的尿素来源的实例包括Acros Organics(Morris Plains,N.J.)、Fisher Scientific(Pittsburgh,Pa.)或Sigma Aldrich(St.Louis,Mo.)。
尿素和油可以在溶剂存在下合并以形成尿素/油络合物。因此，由于在尿素/油络合物的产生中使用溶剂的结果，该络合物可以并且通常确实包含残余量的溶剂。在一些实施方案中，溶剂是醇(例如乙醇)。优选地，溶剂是190标准乙醇(即95％乙醇)。
在一些实施方案中，通过将尿素溶解在乙醇中以形成尿素/乙醇溶液来制备尿素/油络合物。反应混合物中尿素与乙醇的比率可以为约1:0.1至约1:10，更通常为约1:1.5。为了促进尿素在乙醇中的溶解，可以将混合物加热。乙醇和尿素可以混合的合适温度包括但不限于约60℃至约100℃、约65℃至约95℃、约70℃至约90℃或约75℃至约85℃。例如，可将混合物加热至约85℃至约90℃。
所述油可以在升高的温度下与尿素/乙醇溶液(即热尿素/乙醇溶液)合并以形成络合物。任选地，在将油与热尿素/乙醇溶液混合之前，将油脱气和/或加热。在一些实例中，将油加热至热的尿素/乙醇溶液的约15℃以内的温度。例如，当尿素/乙醇溶液处于约85℃至约90℃的温度时，可以在将油与尿素/乙醇溶液混合之前将油加热至约80℃的温度。将油与尿素/乙醇溶液混合，并使合并的混合物冷却以形成固体尿素/油络合物。相同的步骤可以与其他溶剂一起使用。
反应混合物中尿素与油的比率可以为约0.1:1至约2:1，更通常为约0.5:1.5、约0.85:1或约1.2:1。然后，通常例如通过过滤将尿素/油络合物与剩余的油分离。
所公开的方法包括以下步骤：取尿素/油络合物(尿素加合物)并除去残留的溶剂(例如乙醇)以形成干燥的尿素/油络合物(也称为尿素“饼”)。干燥的尿素/油络合物基本上不含溶剂。“基本上不含溶剂”是指干燥的尿素/油络合物包含小于约1重量％、小于约0.5重量％、或小于约0.1重量％的溶剂。可以在真空下除去溶剂。用于进行溶剂去除的合适温度包括但不限于约4℃至约60℃，优选约10℃至约22℃。在其他实例中，可以在约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃去除溶剂，其中任何所述值均可形成范围的上限和/或下限。
从尿素/油络合物中除去溶剂后，将干燥的尿素/油络合物或饼与水合并。干燥的尿素/油络合物的尿素成分溶解在水中。尿素的这种溶解可以在升高的温度下进一步促进，部分原因是在升高的温度下尿素在水中的溶解度增加。室温下尿素在水中的溶解度为每100mL水约108g尿素。但是，在约60℃至约80℃的温度下，尿素在水中的溶解度增加到每100mL水约250-400克尿素。因此，在优选的实施方案中，水合并步骤在包括但不限于约50℃至约80℃、约55℃至约75℃或约60℃至约70℃的温度下进行。在一些实例中，干燥的尿素/油络合物可以在约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或约80℃下与水合并，其中任何指定的值均可形成范围的上限和/或下限。在一些具体实例中，干燥的尿素/油络合物可以与水在约60℃至约80℃，或更具体地，从约65℃至约75℃，或者仍更具体地，在约72℃下合并。任选地，将水加热到升高的温度并在升高的温度下提供给干燥的尿素/油络合物。
由于在升高的温度下尿素在水中的溶解度增加，因此在此步骤中可以使用最少量的水以形成浓缩尿素水溶液。当然，添加的水的总量将取决于饼中存在多少尿素。在一些实施方案中，在合并步骤中的水以干燥的尿素/油络合物的按重量计约30％至按重量计约50％提供。例如，可以以干燥尿素/油络合物的按重量计约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％或约50％提供水，其中任何指定的值都可以形成范围的上限和/或下限。在一些实例中，在合并步骤中的水以干燥的尿素/油络合物的按重量计约40％提供。
还可以通过以下方式重复地执行此步骤：即，将干燥的尿素/油络合物与水合并，分离水层，然后再次将干燥的尿素/油络合物与水合并。更进一步，此步骤可以在氮气气氛下搅拌进行。
如所指出的，将干燥的尿素/油络合物与水合并形成两相：含有溶解的尿素的浓缩尿素水溶液和含有油(饱和和/或单饱和脂肪酸和可选的PUFA)的有机相。然后可以使两相进一步分离成水层和有机层。相分离可以在约50℃至约80℃的温度下进行。例如，分离步骤可以在约55℃至约75℃、或约60℃至约70℃的温度下进行。在一些实例中，可允许两相在约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃或约80℃下分离，其中任何指定的值都可以形成范围的上限和/或下限。
通过用水洗涤并干燥该层，有时可以以大量，从有机相中回收油。
浓缩方法
在一些实施方案中，该方法包括使油经受至少一个浓缩步骤。在一些实施方案中，浓缩步骤包括色谱法、蒸馏、尿素络合及其组合。
在一个实施方案中，浓缩步骤包括色谱法。在一个优选的实施方案中，色谱法是银离子色谱法。在一个更优选的实施方案中，色谱法是模拟移动床色谱法。在进一步优选的实施方案中，色谱法是反相色谱法。
在一个实施方案中，浓缩步骤包括蒸馏。在一个优选的实施方案中，蒸馏是分馏。在另一个优选的实施方案中，蒸馏是短程蒸馏。
在一个实施方案中，浓缩步骤包括尿素络合。
反相色谱法
在一些实施方案中，该过程包括使油经受至少一个反相色谱步骤。可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行反相色谱。
在一些实施方案中，色谱柱可具有约3.8cm的内径，约27cm的有效长度和/或约313mL的体积。
在一些实施方案中，色谱柱填充有二氧化硅基质。在一个优选的实施方案中，二氧化硅基质是C18键合的硅胶。在一个优选的实施方案中，基质的粒度为约40μm至约63μm。
在一些实施方案中，洗脱液包含甲醇。在一个优选的实施方案中，洗脱液是甲醇和水的混合物。
在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计至少约80％甲醇、至少约85％甲醇，按重量计至少90％甲醇，或按重量计至少约95％甲醇。在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计至少80％甲醇、按重量计至少85％甲醇、按重量计至少90％甲醇或按重量计至少95％甲醇。
在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计少于约20％水、按重量计少于约15％水、按重量计少于约10％水或按重量计少于约5％水。在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计少于20％水、按重量计少于15％水、按重量计少于10％水或按重量计少于5％水。
在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计约80％至约95％甲醇。在一个优选的实施方案中，洗脱液包含按重量计约90％至约95％甲醇。在一个更优选的实施方案中，洗脱液包含按重量计约92％甲醇。
在一些实施方案中，洗脱液包含按重量计约5％至约20％水。在一个优选的实施方案中，洗脱液包含按重量计约5％至约10％水。在一个更优选的实施方案中，洗脱液包含按重量计约8％水。
在一些实施方案中，以等度模式从色谱柱洗脱油。
柱色谱法
在一些实施方案中，该过程包括柱色谱法。柱填充有固定相，诸如硅胶、氧化铝和/或浸渍有硝酸银的硅胶，并用溶剂或溶剂混合物润湿。将含有一种或多种所需产物的油负载至柱，并用一种或多种流动相溶剂(诸如二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、己烷、甲醇、丙酮、乙醇、丙醇、四氢呋喃、二乙醚、戊烷、二氯甲烷、氯仿和四氢吡喃)洗脱。
一种或多种所需产物可以收集在级分中(例如，在管中)，然后可以通过在减压下去除溶剂或可替换地，通过在收集的级分上吹惰性气氛而被浓缩，以产生富含一种或多种所需产物的油。
分馏
在一些实施方案中，该过程包括分馏。将油放入加热烧瓶中，并任选在减压下加热烧瓶。在一个实例中，一种或多种所需产物在达到其沸点时转化为气相，并通过分馏柱，在冷凝器中冷凝，并收集在接收瓶中。在另一个实例中，一种或多种所需产物保留在加热瓶中，并且杂质从一种或多种所需产物中蒸馏除去。
分馏可以在例如40℃至500℃范围内的温度下进行，包括其间的所有值和子范围，就如同已明确写出一样。例如，分馏可以在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、或120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃、220℃、230℃、或240℃、250℃、260℃、270℃、280℃、290℃、300℃、310℃、320℃、330℃、340℃、350℃、或360℃、370℃、380℃、390℃、400℃、410℃、420℃、430℃、440℃、450℃、460℃、470℃、480℃或490℃下进行。
分馏优选在减压下进行。减压的范围可以从0.0001个大气压到0.9个大气压，包括其间的所有值和子范围，就如同明确写出一样。大气压缩写为“atm”，且等于101,325Pa。减压可以是，例如0.001atm、0.01atm、0.1atm、0.2atm、0.3atm、0.4atm、0.5atm、0.6atm、0.7atm或0.8atm。
固相萃取
在一些实施方案中，该过程包括使油经受至少一个固相萃取步骤。固相萃取(SPE)可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
在一些实施方案中，使用二氧化硅SPE盒执行SPE步骤。
在本发明中，可以将任何浓缩、反应和/或纯化技术与任何其他浓缩、反应和/或纯化技术组合以产生富含以下物质的微生物油：多不饱和脂肪酸、其酯、其盐，其醛和/或其醇。富集技术可以以任何顺序和组合使用。
所得的油组成
在一些实施方案中，所述油包含一种或多种LC-PUFA。在一些实施方案中，所述油包含至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％LC-PUFA。在一个优选的实施方案中，LC-PUFA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，LC-PUFA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，LC-PUFA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。在一些实施方案中，LC-PUFA为甘油三酯形式。
在一个实施方案中，油包含按重量计至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％ARA。在一个优选的实施方案中，ARA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，ARA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，ARA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含约3％至约13％、约4％至约12％、约5％至约11％、约6％至约10％、或约7％至约9％亚油酸(“LA”)。在一个优选的实施方案中，LA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，LA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，LA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含约0.5％至约5％、约1％至约5％、或约3％至约4％的LA。在一个优选的实施方案中，LA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，LA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，LA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％或小于约0.5％的EPA。在一个优选的实施方案中，EPA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，EPA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，EPA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，所述油包含约0.1％至约5％，约0.5％至约3％，或约1％至约2％的EPA。在一个优选的实施方案中，EPA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，EPA的重量％是以油的重量计的％。在一个更优选的实施方案中，EPA的重量％是以酯级分中脂肪酸的重量计的％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％、或小于约0.5％的DHA。在一个优选的实施方案中，DHA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，DHA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，DHA的按重量％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含约0.1％至约5％、约0.5％至约3％、或约1％至约2％的DHA。在一个优选的实施方案中，DHA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，DHA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，DHA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％或小于约0.5％的γ-亚麻酸(“GLA”)。在一个优选的实施方案中，GLA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，GLA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，GLA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％或小于约0.5％的二高-γ-亚麻酸(“DGLA”)。在一个优选的实施方案中，DGLA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，DGLA的按重量计％是油的按重量计％。在一个更优选的实施方案中，DGLA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％、或小于约0.5％的十八碳四烯酸(“SDA”)。在一个优选的实施方案中，SDA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，SDA的按重量计％是油的按重量计％。在一个优选的实施方案中，SDA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方案中，油包含小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2.5％、小于约2％、小于约2％、小于约1.5％、小于约1％、或小于约0.5％的具有多于22个碳的多不饱和脂肪酸(超长链PUFA)。在一些实施方案中，超长链PUFA是7,10,13,16,19,22,25二十八碳八烯酸(C28:8)。在一个优选的实施方案中，所述油包含0％的7,10,13,16,19,22,25二十八碳八烯酸(C28:8)。在一个优选的实施方案中，超长链PUFA为酯形式。在一个更优选的实施方案中，该酯是乙酯。在一个优选的实施方案中，超长链PUFA的按重量计％是油的按重量计％。在一个优选的实施方案中，超长链PUFA的按重量计％是酯级分中脂肪酸的按重量计％。
在一些实施方式中，油包含酯级分，其中酯级分中脂肪酸的按重量计至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是花生四烯酸(ARA)，并且酯级分中ARA的量为酯级分中总ω-6脂肪酸的按重量计至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。在一些实施方案中，酯级分中脂肪酸的按重量计至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约35％或至少约40％是LA。在一些实施方案中，在酯级分中的LA的量为酯级分中总ω-6脂肪酸的按重量计至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％。
在一些实施方案中，油包含油的按重量计至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在一些实施例中，酯级分中脂肪酸的按重量计至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是ARA。在一些实施方案中，酯级分中脂肪酸的按重量计约0.5％至约5％、约1％至约5％或约3％至约4％是LA。
在一些实施方案中，酯级分中脂肪酸的按重量计至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％是ARA和LA。
在一些实施方案中，酯级分中的脂肪酸的ARA含量为酯级分中脂肪酸的ARA和LA含量的量的按重量计至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
在一些实施方案中，酯级分中脂肪酸的LA含量为酯级分中脂肪酸的ARA和LA含量的约0.5％至约5％、约1％至约5％、或约3％至约4％。
在一个优选的实施方案中，酯级分是乙酯。
在一些实施方案中，油的总异构体值为小于5％、小于4.5％、小于4％、小于3.5％、小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或0％。
在一些实施方案中，油的ARA异构体值为小于5％、小于4.5％、小于4％、小于3.5％、小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或0％。
在一些实施方案中，每克油中油中ARA的量为约100mg至约300mg、约100mg至约600mg、约100mg至约800mg、约100mg至约900mg、约100mg至约950mg、约800至约950mg、或0至约100mg。
食品、补充剂和/或药物组合物
在一些实施方案中，本发明是包含本发明的油的食品、补充剂或药物组合物。该药物组合物可以含有药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，组合物是食品。食品是用于非人类动物或人类食用的任何食品，并且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人类食品的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗性饮品和营养性饮品；功能食品；补充剂；营养品；婴儿配方食品，包括早产儿的配方食品；孕妇或哺乳妇女的食品；成人食品；老年食品；和动物食品。
在一些实施方案中，该组合物是动物饲料。“动物”包括属于动物界的非人类生物，并且包括但不限于水生动物和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”是指意欲用于非人类动物的任何食物，无论是鱼类；商品鱼；观赏鱼；仔稚鱼；双壳类；软体动物；甲壳纲动物；贝类动物；虾；仔虾；卤虫；轮虫类；丰年虾；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；农场动物；动物园动物；运动动物；种畜；竞赛动物；展览动物；传家宝动物；稀有或濒临灭绝的动物；伴侣动物；宠物，诸如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠或马；灵长类动物，诸如猴子(例如卷尾猴、恒河猴、非洲绿、赤猴、食蟹猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；诸如狗和狼等犬科动物；诸如猫、狮子、老虎等猫科动物；诸如马、驴和斑马等马科动物；食用动物，诸如奶牛、牛、猪和绵羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；或啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产饲料、包括宠物饲料的家畜饲料、动物园动物饲料、工作动物饲料、牲畜饲料及其组合。
在一些实施方案中，所述组合物是用于人类食用肉或产品的任何动物(例如从其来源的肉、蛋或奶以供人类食用的任何动物)的饲料或饲料补充剂。当喂食此类动物时，可以将诸如LC-PUFA的营养物掺入此类动物的肉、奶、蛋或其他产品中，以增加其中这些营养物的含量。
实施例
以下阐述了以下实施例以说明根据所公开主题的方法和结果。这些实施例并不旨在包括本文公开的主题的所有方面，而是用于说明代表性的方法和结果。这些实施例并非旨在排除对本领域技术人员显而易见的等同方案和变型。
分析方法：根据欧洲药典方法2.04.29，使用具有火焰离子化检测器的气相色谱仪(GD/FID)进行脂肪酸组成的测定。
实施例1
产生ARA乙酯浓缩物
步骤1.酯交换
阶段1.向含有500g含ARA的油的2L圆底烧瓶中加入24g 21％(基于重量)的乙醇钠(Sigma)的乙醇溶液和131g无水乙醇。将混合物加热至75℃持续1小时，同时在N2气氛下使用回流冷凝器搅拌以防止乙醇离开反应混合物。将反应混合物从热源中移出并冷却至约40℃，然后将其转移至2L分液漏斗中，在其中排出底部甘油层。
阶段2.将顶部油层转移至干净的2L圆底烧瓶中，并加入另外的2.4g乙醇钠的乙醇溶液和13.1g无水乙醇。再次将混合物在N2气氛下和回流冷凝器上加热至75℃持续1小时。
冷却至约40℃后，将反应混合物在真空下蒸发以除去残留的乙醇。将残余物转移到2L分液漏斗中，并用柠檬酸溶液(1％w/w)洗涤，直到含水洗涤部分的pH不再为碱性为止。用1.5L蒸馏水以三等分的500mL部分洗涤中性油，然后将其在70℃下真空干燥2h，得到含有按面积计53.88％ARA的油，产率为95％。
步骤2.短程蒸馏
通过短程蒸馏纯化步骤1中制备的ARA乙酯。根据标准方案组装短程蒸馏单元。加热油中的工作温度设定为130℃，同时控制内部冷凝器的加热单元中的温度设定为50℃。当系统中的压力平衡至100mTorr时，在短程单元中以每小时500g的流速蒸馏约475g的油。得到约445g澄清的浅黄色馏出物，用于进一步纯化，其包含按面积计44.56％的ARA，产率为93％。丢弃未蒸馏的部分(残余物)。
步骤3.尿素络合
将步骤2中制备的蒸馏的ARA乙酯通过尿素络合进行浓缩。在500mL圆底烧瓶中，加入50g尿素和75g 95％v/v乙醇水溶液。将混合物置于加热套中，并在回流冷凝器的存在下搅拌的同时使其回流。当溶液看起来澄清时，将油加入尿素/乙醇水溶液混合物中。将烧瓶从热源移开，并在搅拌下将混合物风冷过夜。第二天，将混合物真空过滤并将液体滤液在真空下蒸发以除去残留的乙醇。将干燥的残余物转移至500mL分液漏斗，并用三份相等的100mL份的预热至60℃的蒸馏水洗涤3次。将来自最后一次水洗的上部油层在70℃的真空下干燥2h，得到含有按面积计75.2％ARA的油，产率为52.4％。
步骤4.反相色谱
将步骤3中制备的油通过反相色谱法进一步浓缩。采用以下流动参数：
柱：内径3.8厘米
有效长度：27厘米
体积：313毫升
二氧化硅基质：Silicycle 60A。C-18硅胶，碳含量17％，粒度40-63μm。
制备206g硅胶在500mL洗脱剂中的浆液，该洗脱剂由92重量％的甲醇和8重量％的水组成，并用于填充柱。填充柱时，仅使约1L洗脱液通过柱以使其平衡。将约8.0g步骤3中制备的ARA浓缩物以纯净的形式加载到硅胶上。然后将该柱以等度模式用92/8甲醇/水混合物洗脱。通过柱的前1.5L洗脱液(约4.8个柱体积)被丢弃，因为其不包含任何油。剩余的洗脱液以15mL级分收集。总共收集了86个级分，得到额外的1290mL(4.1个柱体积)。将来自这些级分的等分试样进行通过GC的脂肪酸谱分析。合并含有按面积计89％或更高的ARA的级分，并在真空下干燥，得到含有按面积计89.34％ARA的油，产率为55％。
步骤5.尿素复合
通过第二个尿素络合步骤将步骤4中制备的油进一步浓缩。在250mL圆底烧瓶中，加入9.8g尿素和24.5g 95％v/v乙醇水溶液。将混合物置于加热套中，并在回流冷凝器的存在下在搅拌的同时进行加热。当大部分尿素已经溶解后，将室温油加入到尿素/乙醇水溶液混合物中。将烧瓶从热源移开，并在搅拌下将混合物风冷过夜。第二天，将混合物真空过滤并将液体滤液在真空下蒸发以除去残留的乙醇。将干燥的残余物转移至125mL分液漏斗，并用三份相等的50mL份的预热至60℃的蒸馏水洗涤3次。将来自最后一次水洗的顶部油层在70℃的真空下干燥2h，得到含有97.35％ARA的油，产率为51.1％。
步骤6.固相萃取
使用二氧化硅SPE筒通过固相萃取将步骤5中制备的油进一步浓缩。将约4.5g油材料溶解在10mL己烷/乙酸乙酯的90/10v/v混合物中。将该溶液装入Hyper Sep SI二氧化硅筒中，该筒先前已用90/10己烷/乙酸乙酯溶剂混合物平衡。使用200mL的溶剂混合物从硅胶筒上洗脱油。在真空下蒸发溶剂，产生含有按重量计90.1％ARA(按面积计97.3％ARA)的油，产率为82.2％。
在图1中提供了此过程的图。
实施例2
比较例
在此实施例中，除了省略蒸馏步骤(步骤2)和固相萃取步骤(步骤6)以外，所进行的过程与实施例1中描述的过程相同。
从此过程获得的最终所得油含有按重量计74.0％ARA(以面积计96.9％ARA)，产率为52.0％。
在图2中提供了比较过程的图示。
在本说明书中引用的所有参考文献均通过引用并入本文，就如同每个参考文献均被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。任何参考文献的引用都是针对其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本公开由于在先发明而无权早于该参考文献。
应理解的是，上述每个元素或两个或更多个元素也可以在不同于上述类型的其他类型的方法中具有有用的应用。在没有进一步分析的情况下，前述内容将如此充分地揭示本公开的要旨，以至于其他人可以通过应用当前的知识而容易地使其适应各种应用，而不会遗漏从现有技术的观点来看相当构成所附权利要求书中阐述的本公开的一般或具体方面的基本特征。前述实施方案仅以示例的方式给出；并且本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
