一种牛至油的制备方法、牛至油及其应用
技术领域
本发明涉及植物活性成分提取领域。更具体地说，本发明涉及一种牛至油的制备方法、牛至油及其应用。
背景技术
牛至又名止痢草、土香薷、小叶薄荷，为唇形科牛至属多年生草本植物。主要分布于地中海地区至中亚、北非、北美及我国大部分地区，生于海拔500－3600m的山坡、路旁、灌丛、草地、林下。牛至味辛、性凉、无毒，全草可入药，具有清热解表、理气化湿倒尿消肿之功效，牛至含有30多种抗菌化合物，是一种潜在的天然抗生素和药物生长促进剂。
目前，多按照《中国药典》一部附录中的水蒸气蒸馏法提取牛至油，但上述方案中牛至油的得率、纯度以及其中所包含的活性成分，如麝香草酚等的含量均不高。
对此，有通过亚临界水萃取对其进行改善的方案，如201610742161.7、“一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用”，但其精油得率仍然不高。同时，上述方案中需要设置亚临界水萃取的压强，由于该压强较大，若由于存在罐体损伤等隐患，则极容易在高压条件下造成安全隐患，但上述方案中并无对该萃取压强进行监控的方案。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种牛至油的制备方法、牛至油及其应用，其可以显著提高牛至油得率以及活性成分含量，并且对制备过程中的压力进行实时监控，并根据监控结果提醒人员执行不同的处理方案，以最大程度的消除生产隐患。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛至油的制备方法，其包括如下步骤：
S1、取牛至全草冷冻干燥，粉碎打浆，得到浆液，并获取浆液重量；
S2、将浆液温度在3-5min内降低至-40—-80℃，并维持2-3min；再在5-10min内将浆液温度升高至30—50℃；再在浆液中分别加入浆液重量1-2％的果胶酶以及浆液重量1-2％的增效剂进行一次酶解，一次酶解时间为2-3h，一次酶解过程中温度调节至40-50℃，pH值调节至3.5-4.5，且一次酶解过程中持续进行搅拌；一次酶解结束后保温1h，以得到一次酶解产物；且按照重量比即，所述增效剂包括2％的柠檬酸、1.5％的食盐以及96.5％的水；
再将一次酶解产物温度在3-5min内降低至-50—-60℃，并维持2-3min；再在8-10min内将一次酶解产物温度升高至30—40℃；再在一次酶解产物中加入浆液重量1-1.5％的纤维素酶以及浆液重量1-1.5％的所述增效剂进行二次酶解，二次酶解时间为1-2h，二次酶解过程中温度调节至50-60℃，pH值调节至4.5-5.5，且二次酶解过程中持续进行搅拌；二次酶解结束后保温1h，以得到二次酶解产物；
再将二次酶解产物温度在3-5min内降低至-30—-40℃，并维持2-3min；再在10-12min内将二次酶解产物温度升高至25—35℃；再在二次酶解产物中加入浆液重量1-2％的磷脂酶以及浆液重量1-2％的所述增效剂进行三次酶解，三次酶解时间为0.5-1h，三次酶解过程中温度调节至40-60℃，pH值调节至5.5-7.5，且三次酶解过程中持续进行搅拌；三次酶解结束后保温1h，以得到三次酶解产物；
S3、将所述三次酶解产物进行过滤，得滤液和沉淀；
S4、将所述沉淀冷冻干燥后加入超临界反应釜中，以对所述超临界反应釜内的沉淀进行超临界二氧化碳萃取，且萃取压力为20-30Mpa、萃取温度为30-50℃、CO2流速为10-20L/h、萃取时间为1-2小时，以获得液态的萃取物；
以及S5、合并所述液态萃取物以及滤液，并进行分子蒸馏，并对分子蒸馏产物进行浓缩、过滤，以得到所述牛至油。
优选的，步骤S2中，在进行一次酶解和/或二次酶解和/或三次酶解的同时进行超声处理，超声功率为500W，超声处理时间为15min。
优选的，步骤S4中需要对萃取压力进行监控，监控步骤包括：
S41、获取某段时期内超临界反应釜内的若干上部萃取压力值T1、若干中部萃取压力值T2以及下部萃取压力值T3，所述上部萃取压力值T1、中部萃取压力值T2以及下部萃取压力值T3均为未发生安全事故时的萃取压力，并分别计算出上部萃取压力值T1的平均值A1、方差V1，中部萃取压力值T2的平均值A2、方差V2以及下部萃取压力值T3的平均值A3、方差V3；
S42、在超临界反应釜内的上部、中部以及下部对应设置用于实时获取上部萃取压力t1的第一压力传感器、用于实时获取中部萃取压力t2的第二压力传感器以及用于实时获取下部萃取压力t3的第三压力传感器；且所述第一压力传感器、第二压力传感器、第三压力传感器均连接报警器；
S43、若上部萃取压力t1、中部萃取压力t2以及下部萃取压力t3中的一个或多个超过压力报警值时，所述报警器产生报警信号；
若上部萃取压力t1、中部萃取压力t2以及下部萃取压力t3均未超过压力报警值，则根据计算公式(1)获得警戒值S：
S44、根据不同的警戒值S提醒工作人员执行不同的处理方案。
优选的，所述压力报警值为50-80Mpa。
优选的，所述步骤S44包括：若第一警戒值＜S≤第二警戒值，则产生并发送第一警戒信息，以提醒人员执行第一处理方案。
优选的，所述步骤S44包括：若第二警戒值＜S≤第三警戒值，则根据公式(2)-(4)计算分别上部萃取压力t1对于所述警戒值S的第一影响因子I1、中部萃取压力t2对于所述警戒值S的第二影响因子I2以及下部萃取压力t3对于所述警戒值S的第三影响因子I3；且当第一影响因子I1、第二影响因子I2、第三影响因子I3中的任一项≥第二警戒值时产生并发送第二警戒信息，以提醒人员执行第二处理方案；
优选的，所述步骤S44包括：若S＞第三限值，则产生第四警戒信息，以提醒人员执行第四处理方案。
还提供一种通过上述制备方法获取的牛至油。
还提供一种上述牛至油在饲料添加剂中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过短时间内反复升高温度、降低温度，以及结合多层次酶解、超声处理等方式充分破坏牛至细胞的细胞结构，进一步采用超临界二氧化碳萃取，使细胞内含有的挥发油充分析出，以提高其得率和活性成分含量；同时对萃取压力进行实时有效监控，并充分考虑反应釜不同位置的实时压力对于风险的影响程度，以产生不同的警戒信号，实现分级预警，由此避免产生的错报、漏报情况发生。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
本实施例提供了一种牛至油的制备方法，其包括如下步骤：
S1、取牛至全草50kg，去除腐烂、枯黄茎叶，清洗干净后冷冻干燥，粉碎打浆，得到重量45.3kg浆液；
S2、将浆液温度在3min内降低至-40℃，并维持3min；再在5min内将浆液温度升高至30℃；再在浆液中分别加入480g的果胶酶以及500g的增效剂进行一次酶解，一次酶解时间为2h，一次酶解过程中温度调节至40℃，pH值调节至3.5，且一次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；一次酶解结束后保温1h，以得到一次酶解产物；且按照重量比即，所述增效剂包括2％的柠檬酸、1.5％的食盐以及96.5％的水；
再将一次酶解产物温度在5min内降低至-60℃，并维持3min；再在8min内将一次酶解产物温度升高至35℃；再在一次酶解产物中加入550g的纤维素酶以及550g的所述增效剂进行二次酶解，二次酶解时间为2h，二次酶解过程中温度调节至60℃，pH值调节至5.0，且二次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；二次酶解结束后保温1h，以得到二次酶解产物；
再将二次酶解产物温度在4min内降低至-35℃，并维持2min；再在10min内将二次酶解产物温度升高至30℃；再在二次酶解产物中加入650g的磷脂酶以及480g的所述增效剂进行三次酶解，三次酶解时间为0.5h，三次酶解过程中温度调节至50℃，pH值调节至6.5，且三次酶解过程中持续进行搅拌；三次酶解结束后保温1h，以得到三次酶解产物；
由此，通过不同阶段的变温处理使得细胞结构被破坏，即，在短时间内急速降温，可使得细胞内形成冰晶，刺穿细胞膜/细胞壁等结构，再升温使得冰晶结构溶解，细胞内容物(如挥发油等)析出，同时该升温过程相对缓慢，由此避免急速升温导致整个植物组织腐烂而无法使用，每一变温处理后均采用对应的酶进行酶解，进一步破坏细胞膜/细胞壁等结构；
此外，为保证酶解效果，在进行一次酶解和/或二次酶解和/或三次酶解的同时进行超声处理，超声功率为500W，超声处理时间为15min，同时，增效剂中的柠檬酸、食盐均可以改变细胞膜透性，使得细胞膜上形成穿孔，促使其内部的挥发油等活性物质得以释放；
S3、将所述三次酶解产物在5000rpm条件下离心10min，得上清液和沉淀；
S4、将所述沉淀冷冻干燥后加入超临界反应釜中，以对所述超临界反应釜内的沉淀进行超临界二氧化碳萃取，且萃取压力为20Mpa、萃取温度为30℃、CO2流速为10L/h、萃取时间为1小时，以获得液态的萃取物；
以及S5、合并所述液态萃取物以及上清液，并进行分子蒸馏，并对分子蒸馏产物进行浓缩、过滤，以得到所述牛至油；优选的，进行分子蒸馏时，调节转子刮膜的转速为200r/min，进液流速2.0ml/min。
进一步的，步骤S4中需要对萃取压力进行监控，监控步骤包括：
S41、获取某段时期内(如过去3个月内)超临界反应釜内的萃取压力历史数据，所述历史数据包括若干上部萃取压力值T1、若干中部萃取压力值T2以及下部萃取压力值T3，所述上部萃取压力值T1、中部萃取压力值T2以及下部萃取压力值T3均为未发生安全事故时的萃取压力，并假设上部萃取压力值T1、中部萃取压力值T2以及下部萃取压力值T3符合正态分布，进一步分别计算出上部萃取压力值T1的平均值A1、方差V1，中部萃取压力值T2的平均值A2、方差V2以及下部萃取压力值T3的平均值A3、方差V3；
S42、在超临界反应釜内的上部、中部以及下部对应设置用于实时获取上部萃取压力t1的第一压力传感器、用于实时获取中部萃取压力t2的第二压力传感器以及用于实时获取下部萃取压力t3的第三压力传感器；且所述第一压力传感器、第二压力传感器、第三压力传感器均连接报警器；
S43、若上部萃取压力t1、中部萃取压力t2以及下部萃取压力t3中的一个或多个超过压力报警值时，所述报警器产生报警信号；所述压力报警值为50-80Mpa，具体可根据实际的生产需要而定；
若上部萃取压力t1、中部萃取压力t2以及下部萃取压力t3均未超过压力报警值，则根据计算公式(1)获得警戒值S：
S44、根据不同的警戒值S提醒工作人员执行不同的处理方案。
具体的，所述步骤S44包括：若第一警戒值＜S≤第二警戒值，则说明萃取压力整体处于可控范围内，仅需要适当关注即可，此时产生并发送第一警戒信息，以提醒人员执行第一处理方案，例如，操作人员通过调取现场视频等方式对现场进行远程监控即可，无需到现场进行处理；
若第二警戒值＜S≤第三警戒值，则根据公式(2)-(4)计算分别上部萃取压力t1对于所述警戒值S的第一影响因子I1、中部萃取压力t2对于所述警戒值S的第二影响因子I2以及下部萃取压力t3对于所述警戒值S的第三影响因子I3；且当第一影响因子I1、第二影响因子I2、第三影响因子I3中的任一项≥第二警戒值时，说明此时萃取压力接近危险阈值，产生风险的概率增加，此时产生并发送第二警戒信息，以提醒人员执行第二处理方案，例如，通知操作人员进行现场观察和处理，但无需暂停整个工作流程以及撤离现场人员；
若S＞第三警戒值，则说明由于反应釜内不同位置的压力综合作用，因此整体风险概率显著增加，此时则产生第三警戒信息，以提醒人员执行第三处理方案，例如，将情况进行上报，停止生产，通知现场人员撤离，并派遣专业人员、设备进行现场处理。
上述步骤中，所述第一警戒值-第三警戒值的确定可根据实际监测的灵敏度确定，所述第一警戒信息-第三警戒信息的严重程度依次为第一警戒信息＜第二警戒信息＜第三警戒信息。
上述萃取过程中由压力过大引发的风险往往不是一蹴而就的，其可能是由不同位置的压力综合作用引起的，因此，本实施例的萃取压力监控过程中充分考虑不同位置压力的量变特征，以期提前把压力风险消灭在萌芽状态；同时，通过将不同位置的实时压力均纳入考虑范围，以此可避免采用单一位置压力进行报警、预警时产生的错报、漏报情况发生，提高预警的准确度，同时结合反应釜不同部位的实时压力对于警戒值的影响因子产生不同级别的警戒信息，以此提醒操作人员便于采取有针对性的措施，避免逐一排查而浪费宝贵的时间以及影响正常的生产节奏。
实施例2：
本实施例提供了一种牛至油的制备方法，其包括如下步骤：
S1、取牛至全草80kg，去除腐烂、枯黄茎叶，清洗干净后冷冻干燥，粉碎打浆，得到重量73.6kg浆液；
S2、将浆液温度在5min内降低至-60℃，并维持2min；再在10min内将浆液温度升高至50℃；再在浆液中分别加入1.2kg的果胶酶以及1.0kg的增效剂进行一次酶解，一次酶解时间为2h，一次酶解过程中温度调节至50℃，pH值调节至4.5，且一次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；一次酶解结束后保温1h，以得到一次酶解产物；
再将一次酶解产物温度在4min内降低至-55℃，并维持2min；再在10min内将一次酶解产物温度升高至40℃；再在一次酶解产物中加入1.1kg的纤维素酶以及1.1kg的所述增效剂进行二次酶解，二次酶解时间为1h，二次酶解过程中温度调节至55℃，pH值调节至5.5，且二次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；二次酶解结束后保温1h，以得到二次酶解产物；
再将二次酶解产物温度在5min内降低至-40℃，并维持3min；再在12min内将二次酶解产物温度升高至35℃；再在二次酶解产物中加入0.8kg的磷脂酶以及0.8kg的所述增效剂进行三次酶解，三次酶解时间为0.5h，三次酶解过程中温度调节至50℃，pH值调节至6.5，且三次酶解过程中持续进行搅拌；三次酶解结束后保温1h，以得到三次酶解产物；
S3、将所述三次酶解产物在6000rpm条件下离心12min，得上清液和沉淀；
S4、将所述沉淀冷冻干燥后加入超临界反应釜中，以对所述超临界反应釜内的沉淀进行超临界二氧化碳萃取，且萃取压力为30Mpa、萃取温度为50℃、CO2流速为20L/h、萃取时间为2小时，以获得液态的萃取物；
以及S5、合并所述液态萃取物以及上清液，并进行分子蒸馏，并对分子蒸馏产物进行浓缩、过滤，以得到所述牛至油。
其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例3：
本实施例提供了一种牛至油的制备方法，其包括如下步骤：
S1、取牛至全草100kg，去除腐烂、枯黄茎叶，清洗干净后冷冻干燥，粉碎打浆，得到重量94.1kg浆液；
S2、将浆液温度在4min内降低至-55℃，并维持2min；再在8min内将浆液温度升高至40℃；再在浆液中分别加入1.0kg的果胶酶以及1.5kg的增效剂进行一次酶解，一次酶解时间为2.5h，一次酶解过程中温度调节至45℃，pH值调节至4.0，且一次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；一次酶解结束后保温1h，以得到一次酶解产物；
再将一次酶解产物温度在3min内降低至-52℃，并维持2min；再在9min内将一次酶解产物温度升高至35℃；再在一次酶解产物中加入1.2kg的纤维素酶以及1.3kg的所述增效剂进行二次酶解，二次酶解时间为1h，二次酶解过程中温度调节至50℃，pH值调节至5.0，且二次酶解过程中按照转速200转/min持续进行搅拌；二次酶解结束后保温1h，以得到二次酶解产物；
再将二次酶解产物温度在5min内降低至-32℃，并维持3min；再在11min内将二次酶解产物温度升高至34℃；再在二次酶解产物中加入1.0kg的磷脂酶以及1.2kg的所述增效剂进行三次酶解，三次酶解时间为0.5h，三次酶解过程中温度调节至55℃，pH值调节至7.0，且三次酶解过程中持续进行搅拌；三次酶解结束后保温1h，以得到三次酶解产物；
S3、将所述三次酶解产物在5500rpm条件下离心11min，得上清液和沉淀；
S4、将所述沉淀冷冻干燥后加入超临界反应釜中，以对所述超临界反应釜内的沉淀进行超临界二氧化碳萃取，且萃取压力为25Mpa、萃取温度为40℃、CO2流速为15L/h、萃取时间为1.5小时，以获得液态的萃取物；
以及S5、合并所述液态萃取物以及上清液，并进行分子蒸馏，并对分子蒸馏产物进行浓缩、过滤，以得到所述牛至油。
其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例4：
本实施例提供了一种实施例1-3任一项制备方法获取的牛至油。
实施例5：
本实施例提供了一种实施例4所述的牛至油在饲料添加剂中的应用。
以下取100kg牛至全草，采用201610742161.7、“一种具有抗菌效果的植物精油及其制备方法与应用”所述方法进行牛至油提取，以获得作为对比例的牛至油，并通过肉眼观察获取颜色和透明度评估结果，以及通过常规方法检测获得得率、收油量、旋光度以及比重数据，其结果如表1所示。
表1牛至油收油率、得率、纯度、外观、透明度、比重、旋光度检测结果
从上表1可知，通过本发明实施例1-3中的方法获得的牛至油的比重、旋光度、外观(颜色和透明度)均符合要求，且杂质少；同时，由于本发明中采用多种方式促使细胞膜/细胞壁等结构被破坏，从而使得细胞内容物(如挥发油等)充分析出，所以本申请中，通过实施例1-3所获的牛至油的得率平均值为3.50％，相对对比例增加56％，同时纯度也有所提高。
进一步的，去对比例以及实施例1-3中所获的牛至油进行气相色谱分析，分别获得对-聚伞花素、麝香草酚、香荆芥酚以及香草醇的含量，其结果如表2所示。
表2牛至油对-聚伞花素、麝香草酚、香荆芥酚以及香草醇含量
类似的，从上表2可知，通过本发明实施例1-3中的方法获得的牛至油中，其对-聚伞花素、麝香草酚、香荆芥酚以及香草醇含量相对于对比例1而言也有显著提高，如实施例3与对比例(原料均为100kg)相比，实施例3的对-聚伞花素、麝香草酚、香荆芥酚以及香草醇含量相对于对比例1而言分别提高约22.4％、17.8％、11％以及15％。
以下为抑菌功效试验，具体过程如下。
取不同菌株斜面培养物，用无菌生理盐水制成浓度为1×106-1×107CFU/ml的菌悬液，无菌吸取菌悬液100μL接种于相应培养基表面，涂布均匀。分为高剂量组、中剂量组以及低剂量组，空白对照纸片上滴加无菌蒸馏水20μL。高、中、低剂量组分别对应吸取实施例1-3中的牛至油200μL、500μL以及1ml，对应滴于无菌圆纸片(φ5mm×4mm)上，37℃下烘干后贴放于培养基表面。每组3个平皿，每个平皿表面放置4张试验样品纸片和1张阴性对照纸片，37℃下培养16-18h，然后观察菌落生长状况。“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长，结果如表3所示。
表3牛至油体外抑菌试验
从上表3数据可以看出，由于本发明的制备方法可使得牛至油中的活性成分充分释放，因此，其对于多种细菌均具有明显的抑菌效果，尤其是随着剂量的增大，其抑菌效果逐步递增，说明本发明的牛至油可以作为天然植物添加剂添加到饲料中去，以取代抗生素的使用，降低抗生素滥用产生的风险。
需要说明的是，上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明通过短时间内反复升高温度、降低温度，以及结合多层次酶解、超声处理等方式充分破坏牛至细胞的细胞结构，进一步采用超临界二氧化碳萃取，使细胞内含有的挥发油充分析出，以提高其得率和活性成分含量，使其具有明显的抑菌效果，可以作为天然植物添加剂添加到饲料中去，以取代抗生素的使用，降低抗生素滥用产生的风险；同时对萃取压力进行实时有效监控，并充分考虑反应釜不同位置的实时压力对于风险的影响程度，以产生不同的警戒信号，实现分级预警，由此避免产生的错报、漏报情况发生。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。
