一种超临界状态下OPO油脂的固定化磁酶制备方法
技术领域
本发明涉及一种超临界状态下OPO油脂的固定化磁酶制备方法。
背景技术
母乳是婴儿出生早期的主要营养来源，以满足其出生后第一个月内不断增长的生理需求。母乳中的能量大约50％是由乳汁中甘油三酯提供，甘油三酯是由3个脂肪酸和三羟基甘油骨架酯化形成，其结构上的差异包含脂肪酸的特殊定位效应(定位在三酰甘油外侧的Sn-1和Sn-3位，以及中间的Sn-2位)。现已知棕榈酸是母乳中最重要的饱和脂肪酸，大约有70％酯化在甘三酯分子Sn-2位上。婴儿对母乳脂肪的消化吸收之所以比婴儿配方奶粉高，与母乳脂肪酸在甘三酯中的位置分布有着密切联系。植物油中的饱和脂肪酸分布在Sn-1,Sn-3位上，不饱和脂肪酸分布在Sn-2位。婴儿配方奶粉的生产中如果通过几种植物油脂的混合可以得到脂肪酸组成与母乳脂肪相接近的产品，但结构类型不能达到与母乳脂肪相接近的水平。这种结果差异对婴幼儿的消化吸收以及新陈代谢有很大影响，容易造成能量摄入不足、钙元素流失，婴儿容易便秘。随着人们对母乳脂肪和婴儿营养吸收认识的逐渐深入，具有Sn-2定位效应的结构油脂在婴儿配方奶粉行业中的应用在逐步展开，结构油脂的应用是婴儿配方奶粉母乳化进程的重要组成部分。
结构油脂1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)是一种新型婴幼儿食品营养强化剂(Sn-1,3位置上都是油酸，Sn-2位置上是棕榈酸)，也是母乳结构脂肪的重要成分，能使婴幼儿最大限度地吸收利用钙质和能量，并显著降低婴幼儿发生便秘、腹痛和肠梗阻的可能性。早在20世纪80年代，关于棕榈酸主要位于Sn-2位的结构油脂的制备研究已经展开。目前已有多家公司数年来也一直致力于研究OPO结构油脂，生产工艺采用脂肪酶催化酯交换，使脂肪酸在丙三醇分子上的位置重新排列而得。目前，OPO油脂存在的问题是OPO含量低、生产成本高，产品的生产效率有待进一步提高。
酶作为一种催化剂在生物化学领域被广泛的研究和应用，酶法具有催化条件温和、专一性强、反应设备简单、能源消耗低、环境污染少等显著优势。目前，酶己被广泛应用于医药、食品生产、化工和农业等领域。Sn-1,3专一性脂肪酶是OPO合成中的关键生物催化剂，对Sn-1,3专一性脂肪酶进行固定化后，能提高其重复利用次数和比活力，保证其专一性，显著降低OPO结构油脂的生产成本和市场价格。
酶的固定化是将酶固定在载体上，达到使酶具有较高的稳定性和能够重复使用的目的，固定化酶的出现极大促进了酶的应用。在种类繁多的固定化酶载体中，磁性载体以其独有的磁性特点成为一种重要的固定化载体。磁性载体作为新近研究出来的一种复合材料它不仅具有磁性材料的磁响应性，还拥有高分子材料的诸多特性。由于较高的磁效应，磁性固定化载体可以在磁场作用下实现快速分离及定位，是近年来脂肪酶载体研究的热点。
超临界CO2萃取是目前国际上最先进的物理萃取技术，具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度。超临界状态下的CO2是一种非极性反应溶剂，具有良好的溶解特性，可代替脂溶性有机溶剂进行酶催化反应。脂溶性反应物溶于超临界状态的CO2中，使其具有了类似气体的扩散系数，能在较低温度下实现溶质的快速传质，促进化学反应的进行。固定化酶不溶解超临界状态的CO2中，并且有些酶的生物活性在超临界条件下反而会有所提高，从而可双重提高反应速率，有利于产品的分离及精制。CO2是安全、无毒、廉价的液体，超临界CO2萃取具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。
本发明以超临界CO2为溶剂，采用磁性固定化脂肪酶定向催化的方法合成OPO结构油脂，最终达到提升合成效率、提高OPO含量的目的。
发明内容
本发明采用的技术方案概述如下：
(1)以纳米级Fe3O4粒子为磁性基体，采用食用多糖为载体，通过交联剂的黏附作用对磁纳米粒子进行包裹，制备得到新型磁性载体。然后，将酯化合成酶、Sn-1,3位置专一性脂肪酶在交联剂的作用下与磁性载体进行黏附，分别得到固定化酯化合成脂肪酶、固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。
其中所述的食用多糖为海藻酸钠、双醛淀粉、羧甲基壳聚糖或其复配混合物；交联剂为戊二醛、聚多巴胺、3,4-二羟基苯甲醛或其复配混合物。
(2)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸，然后加入与棕榈酸摩尔比(1.1-2.0):1的甘油，加入棕榈酸摩尔数3-8％的固定化酯化合成脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度42-60℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在24-32MPa，控制分离器压力恒定在2-5MPa，在此条件下反应4-6小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为高质量的棕榈酸甘油三酯。
(3)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸甘油三酯，加入与棕榈酸甘油三酯摩尔比(1.1-1.8):1的油酸，加入棕榈酸甘油三酯摩尔数2.5-6.5％的固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度42-60℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在24-32MPa，控制分离器压力恒定在2-5MPa，在此条件下反应4-6小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为OPO结构油脂粗产物。反应产物在抽真空条件下，控制温度115-135℃，分子蒸馏去除反应体系中游离的油酸、棕榈酸，最后得到含量65-85％的OPO油脂。
具体实施方式：
具体实施方式一：
(1)以纳米级Fe3O4粒子为磁性基体，采用食用多糖为载体，通过交联剂的黏附作用对磁纳米粒子进行包裹，制备得到新型磁性载体。然后，将酯化合成酶、Sn-1,3位置专一性脂肪酶在交联剂的作用下与磁性载体进行黏附，分别得到固定化酯化合成脂肪酶、固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。
其中所述的食用多糖为海藻酸钠、双醛淀粉、羧甲基壳聚糖或其复配混合物；交联剂为戊二醛、聚多巴胺、3,4-二羟基苯甲醛或其复配混合物。
(2)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸，然后加入与棕榈酸摩尔比1.2:1的甘油，加入棕榈酸摩尔数6％的固定化酯化合成脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度45℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在28MPa，控制分离器压力恒定在4MPa，在此条件下反应5小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为高质量的棕榈酸甘油三酯。
(3)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸甘油三酯，加入与棕榈酸甘油三酯摩尔比1.5:1的油酸，加入棕榈酸甘油三酯摩尔数5.5％的固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度50℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在27MPa，控制分离器压力恒定在4MPa，在此条件下反应5小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为OPO结构油脂粗产物。反应产物在抽真空条件下，控制温度125℃，分子蒸馏去除反应体系中游离的油酸、棕榈酸，最后得到含量75％的OPO油脂。
具体实施方式二：
(1)以纳米级Fe3O4粒子为磁性基体，采用食用多糖为载体，通过交联剂的黏附作用对磁纳米粒子进行包裹，制备得到新型磁性载体。然后，将酯化合成酶、Sn-1,3位置专一性脂肪酶在交联剂的作用下与磁性载体进行黏附，分别得到固定化酯化合成脂肪酶、固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。
其中所述的食用多糖为海藻酸钠、双醛淀粉、羧甲基壳聚糖或其复配混合物；交联剂为戊二醛、聚多巴胺、3,4-二羟基苯甲醛或其复配混合物。
(2)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸，然后加入与棕榈酸摩尔比1.5:1的甘油，加入棕榈酸摩尔数5％的固定化酯化合成脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度50℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在30MPa，控制分离器压力恒定在4MPa，在此条件下反应6小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为高质量的棕榈酸甘油三酯。
(3)在超临界萃取器中加入1摩尔的棕榈酸甘油三酯，加入与棕榈酸甘油三酯摩尔比1.6:1的油酸，加入棕榈酸甘油三酯摩尔数6％的固定化Sn-1,3位置专一性脂肪酶。旋紧萃取器密封盖，保持萃取器恒定温度50℃，逐步泵入液体CO2，使萃取器压力恒定在30MPa，控制分离器压力恒定在4MPa，在此条件下反应5小时。反应结束后，停止液体CO2的泵入，打开分离器阀门收集反应产物，直到分离器和萃取器内压力为零，收集到的产物即为OPO结构油脂粗产物。反应产物在抽真空条件下，控制温度130℃，分子蒸馏去除反应体系中游离的油酸、棕榈酸，最后得到含量72％的OPO油脂。
