富集香樟精油抑菌成分的方法
技术领域
本发明涉及一种富集香樟精油抑菌成分的工艺。
背景技术
香樟(Cinnamomum camphora)，起源于中国南部、越南和日本等地，是一种广泛分布于亚洲东部、大洋洲和太平洋诸岛的大型常绿乔木。香樟在中国是重要的经济树种，也是城市绿化中栽种率最高的树种之一，种植面积已达5万多公顷，且逐年增加。按每年修枝率5％计算，仅一个中型城市修剪产生的枝叶可达3万吨，这些废弃的枝叶可用于提取香樟精油，有效地减轻环境污染。从樟属植物中提取的精油具有多种抗菌活性，可广泛用于香精、香料及医药等行业。但总体而言，与传统抑菌剂相比，作为天然产物的精油，其抑菌活性较弱，且由于植物精油是由一系列挥发性有机物组成的复杂混合物，因此找寻其中具有抑菌效果的目标组分十分困难，由此看来，如果能够找到一种合适的分离技术对香樟精油中的组分进行富集，则有望明确精油中具体的抑菌活性成分，不仅可以提高香樟精油的抑菌活性，而且能进一步增加精油产品的附加值。
浓缩精油中有效成分的方法中，化学法是精油纯化的传统方法，但制备的精油一般纯度较低，工艺流程复杂，且容易存在溶剂残留。精馏法和制备型气相色谱法的分离度高，但缺点也显而易见，精馏法过程中通常需要较高的温度，易对精油中的组分造成破坏，而制备型色谱法，不仅设备要求高，而且能够分离的精油量极少，且主要用于精油组分的定性分析，无法大规模使用。
目前，一些新方法备受关注，其中分子蒸馏因其在高真空度、低蒸发温度条件下进行，蒸发器与冷凝器之间距离小，分子在蒸发器受热区停留时间短，因而可有效地避免热敏物质被破坏，且无需使用任何溶剂，并不会存在溶剂残留等问题。已有研究表明，采用分子蒸馏能够有效富集精油中抗氧化活性成分、浓缩精风味物质，以及脱除杂质，从而提高精油品质，但现今有关分子蒸馏富集香樟精油中抑菌成分的研究还尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、高抑菌活性、安全高效、绿色环保的富集香樟精油抑菌成分的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种富集香樟精油抑菌成分的方法，包括香樟精油(香樟原油)的提取，包括以下步骤：
一)、第一阶段分子蒸馏：
以香樟精油为原料，设定分子蒸馏蒸发温度为(60±2)℃、系统压力为(100±10)Pa、一级冷凝温度为(20±1)℃、二级冷凝温度为(-20±1)℃，进行第一阶段分子蒸馏；
分别获得以下三种馏分：一级重馏分(1RH)、一级中间馏分(1DM)和一级轻馏分(1DL)；
二)、第二阶段分子蒸馏：
以一级轻馏分(1DL)为原料，设置蒸发温度为(40±2)℃、系统压力为(150±10)Pa、一级冷凝温度为(15±1)℃、二级冷凝温度为(-20±1)℃，进行第二阶段分子蒸馏；
分别获得以下三种馏分：二级重馏分(2RH)、二级中间馏分(2DM)和二级轻馏分(2DL)。
二级轻馏分(2DL)的抑菌效果最佳。
作为本发明的富集香樟精油中抑菌成分的方法的改进：所述步骤一)中，香樟精油在系统(装置)内的停留时间为8～12s。
作为本发明的富集香樟精油中抑菌成分的方法的进一步改进：所述步骤一)中，进料流速为2.5mL/min，刮膜转速为100rpm。
作为本发明的富集香樟精油中抑菌成分的方法的进一步改进：所述步骤二)中，一级轻馏分(1DL)在系统(装置)内的停留时间为8～12s。
作为本发明的富集香樟精油中抑菌成分的方法的进一步改进：所述步骤二)中，进料流速为2.5mL/min，刮膜转速为100rpm。
在本发明中，香樟精油的提取为常规方式：将香樟枝叶洗净后于室温下阴干，干燥后剪碎并用液氮研磨成粉末，通过水蒸气蒸馏进行提取，经无水硫酸钠除水后，得到香樟精油(原油)，密封保存在棕色玻璃瓶中于4℃低温下储存。
分子蒸馏：将待处理的原料置于分子蒸馏装置中，通过改变蒸发温度和系统压力来调节蒸发强度。在适合的蒸发强度下，调节一级冷凝器温度；二级冷凝器温度设置为(-20±1)℃，以保证所有达到二级冷凝器的组分均能被冷凝。每一阶段分子蒸馏可分别获得三种馏分：重馏分(RH)、中间馏分(DM)和轻馏分(DL)。采用本发明的方法，能使精油中的目标组分在相应的馏分中得到富集。
第一阶段分子蒸馏以香樟精油为原料；第二阶段分子蒸馏中，以第一阶段获得的组分富集程度高以及抑菌活性增强的馏分为原料进行。本发明采用两阶段分子蒸馏能够进一步提高目标组分的浓缩度，获得更好的富集效果及抑菌活性。
本发明中，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对香樟原油及分子蒸馏得到的各馏分进行化学组成的实时分析，通过目标组分的流向，对分子蒸馏条件进行调节。
分子蒸馏实验条件的选取主要考虑了各馏分的质量回收率及精油主要组分的浓缩比。各馏分回收率计算公式：
各馏分中主要组分浓缩比计算公式：
目标组分的浓缩比为各馏分中的目标组分在该馏分中所占质量百分比与香樟原油中相应组分所占质量百分比的比值。浓缩比大于1表明该馏分中的目标组分被浓缩，即通过分子蒸馏后得到有效地富集。浓缩比越大，富集效果越好。
本发明，通过微量稀释法分别测定香樟原油及各馏分对两种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)、两种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)和两种真菌(黑曲霉、白色念珠菌)的最小抑菌浓度。为更直观地了解两阶段分子蒸馏后各馏分抑菌活性的增益或减损，根据 MIC值定义了抑菌等级。MIC值越大，表明精油的抑菌效果越弱，因此抑菌等级越低。当 MIC值为20μg/mL时，抑菌效果为高活性等级；当MIC值分别逐渐升高到100μg/mL、500 μg/mL时，抑菌等级下降为中高活性和中活性；而当MIC值升高至1000μg/mL及以上时，抑菌效果分别为弱活性等级和无活性等级。
本发明的富集香樟精油抑菌成分的方法，是采用两阶段分子蒸馏对香樟精油中的抑菌活性成分进行富集；具体为以香樟精油为原料，利用两阶段分子蒸馏对精油中的组分进行分离浓缩，对精油中具有抑菌活性成分的组分进行富集，提高香樟精油抑菌活性的方法。
本发明中，设置进料流速为2.5mL/min，刮膜转速为100rpm时，精油进入蒸发系统后，从蒸发器的上端到达下端的停留时间约为10s，并且能在蒸发器表面形成均匀的薄膜，从而保证了流入的物料能够被充分蒸发。
在本发明设定的第一阶段分子蒸馏最佳操作条件下，所得各馏分的回收率分别为：一级重馏分(1RH)13.79％、一级中间馏分(1DM)71.93％、一级轻馏分(1DL)10.17％。
本发明所得的香樟精油各馏分，经两阶段分子蒸馏，重馏分中的目标组分为α-萜品醇和γ-萜品醇；中间馏分中的目标组分为芳樟醇和二氢香芹醇；轻馏分中的目标组分为甲基庚烯酮和1,8-桉叶油素。
本发明两阶段分子蒸馏后，一级轻馏分(1DL)中的目标组分甲基庚烯酮和1,8-桉叶油素的浓缩比可分别高达5.72和5.16，二级轻馏分(2DL)中两种目标组分的浓缩比进一步提高，最终的浓缩比分别为9.61和10.63。
本发明香樟精油的抑菌活性，经两阶段分子蒸馏后，二级轻馏分(2DL)对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果较原油显著提高，对真菌的抑制也有一定的增强。
本发明的一种富集香樟精油抑菌成分的方法，具有如下特点：
1)、通过调控蒸发温度和系统压力，可获取适宜的蒸发强度；
2)、调节一级冷凝温度，能够使易挥发的精油目标组分分别经两级冷凝器冷凝，从而在相应的馏分中得到富集；
3)、第二阶段的分子蒸馏能够进一步获得更好的目标组分富集效果；
4)、操作过程低温、隔氧，对具有热敏性、易氧化的成分具有保护作用；
5)、结合GC-MS的实时分析，能够更好的对分子蒸馏条件进行调节；
6)、香樟精油抑菌成分富集效果明显，抑菌活性显著提高。
综上所述，本发明的方法采用两阶段分子蒸馏，该方法具有系统压力低、蒸发温度温和、组分受热时间短、一级冷凝温度可调、绿色环保等优点，与传统的精油成分浓缩方法相比，有效地保护了精油成分不被破坏。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为两阶段分子蒸馏富集香樟精油组分示意图；
图2为分子蒸馏装置示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例在如图2所示的常规的分子蒸馏装置中进行，该分子蒸馏装置由蒸发系统、真空系统、加热和冷凝、进料和出料四部分组成。
当精油物料从蒸发器顶部的进料装置中进入蒸发器内后，经刮板的旋转擦拭作用，在蒸发器表面形成一层均匀的薄膜，在增加了物料蒸发面积的同时，也保证物料能够均匀受热。在适合的蒸发强度下，蒸发器表面呈薄膜状的精油物料中，不易挥发的组分(图1a中深背景色的编号)大部分无法汽化，将沿蒸发器器壁流出，成为一级重馏分(1RH)；易挥发的组分发生汽化后，由于分子平均自由程(
实施例1、一种富集香樟精油抑菌成分的方法，依次进行以下步骤：
1)、香樟精油的提取：
将香樟枝叶洗净，于室温下阴干叶片表面水分后，剪碎并用液氮研磨成粉末，采用Clevenger-type装置，通过水蒸气蒸馏提取精油，香樟枝叶与水蒸气的料液比为1g/4mL，提取1小时，所得回流液静置分层后，取上层油状物，经无水硫酸钠除水后，得到香樟精油(原油)，密封保存在棕色玻璃瓶中于4℃低温下储存；
所得的香樟精油中目标组分及其含量具体如下：
α-萜品醇39.63％、γ-萜品醇10.30％，芳樟醇26.32％、二氢香芹醇6.17％，甲基庚烯酮 1.50％、1,8-桉叶油素3.45％。
2)、第一阶段分子蒸馏：
量取100mL香樟原油，置于分子蒸馏进料装置中，设置蒸发温度为60℃、系统压力为 100Pa、进料流速为2.5mL/min，刮膜转速为100rpm、一级冷凝温度为20℃、二级冷凝温度为-20℃，进行第一阶段分子蒸馏。此时，香樟原油在蒸发器内的停留时间约为10s。
所得一级重馏分(1RH)、一级中间馏分(1DM)、一级轻馏分(1DL)回收率分别为：13.79％、 71.93％、10.17％。
将上述三种馏分进行GC-MS分析，各馏分中目标组分及其含量具体如下：
一级重馏分(1RH)：α-萜品醇47.38％、γ-萜品醇12.40％，浓缩比均为1.20。
一级中间馏分(1DM)：芳樟醇32.65％、二氢香芹醇6.64％，浓缩比分别为1.24和1.08。
一级轻馏分(1DL)：甲基庚烯酮8.57％、1,8-桉叶油素17.81％，浓缩比分别为5.72和5.16。
3)、香樟原油及第一阶段分子蒸馏所得各馏分的最小抑菌浓度(MIC)：
采用微量稀释法测定香樟原油及第一阶段分子蒸馏所得各馏分对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)以及真菌(黑曲霉、白色念珠菌)的MIC值。配制1％的DMSO精油样品溶液，开始时在96孔板第一行每孔中分别加入50μL的精油样品和50μL的肉汤培养基(Mueller Hinton broth)，后续每行按照1:1的比例进行稀释。以庆大霉素作为阳性对照，DMSO为阴性对照。每孔中均加入50μL浓度约为 1.5×108CFU/mL的测试菌菌悬液。96孔板在37℃下培养24h后，检测610nm处的菌悬液浊度，最终的MIC值为无浑浊度时的精油样品的最低浓度，试验重复三次。
抗真菌活性试验中的培养基为酵母霉菌专用培养基(Yeast and Mold Broth)，阳性对照为两性霉素B，28℃下培养72h后，观测真菌孢子液浊度的变化。
所得结果如下表1所述。
表1、香樟原油及第一阶段分子蒸馏各馏分抑菌结果
香樟精油(香樟原油)对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值均为625μg/mL，具有弱活性抑菌作用；对大肠杆菌的MIC值为625μg/mL，具有弱活性抑菌作用，而对绿脓杆菌的MIC值为1250μg/mL，无抑菌活性；对黑曲霉及白色念珠菌的MIC值分别为39μg/mL、312.5μg/mL，具有中等及以上程度的抑菌水平。
一级轻馏分(1DL)的抑菌效果最高，其中，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值均为78μg/mL，抑菌等级为中高活性；对大肠杆菌的MIC值为312.5μg/mL，抑菌等级为中等活性；而对绿脓杆菌的MIC值为1250μg/mL，无抑菌活性；对黑曲霉的MIC值为19.5μg/mL，抑菌等级为高活性；对白色念珠菌的MIC值为156μg/mL，抑菌等级为中等活性。
4)、第二阶段分子蒸馏：
取步骤2)中所得一级轻馏分(1DL)10mL，置于分子蒸馏进料装置中，设置蒸发温度为 40℃、系统压力为150Pa、进料流速为2.5mL/min，刮膜转速为100rpm、一级冷凝温度为15℃、二级冷凝温度为-20℃，进行第二阶段分子蒸馏。所得二级重馏分(2RH)、二级中间馏分 (2DM)、二级轻馏分(2DL)回收率分别为：29.75％、45.77％、19.45％。此时，一级轻馏分(1DL) 在蒸发器内的停留时间约为10s。
将上述三种馏分进行GC-MS分析，各馏分中目标组分及其含量具体如下：
二级重馏分(2RH)：α-萜品醇26.21％、γ-萜品醇6.55％，浓缩比分别为1.88和1.89。
二级中间馏分(2DM)：芳樟醇47.20％、二氢香芹醇8.39％，浓缩比分别为1.25和1.19。
二级轻馏分(2DL)：甲基庚烯酮14.42％、1,8-桉叶油素36.62％，浓缩比分别为1.68和2.06。
5)、第二阶段分子蒸馏所得各馏分的最小抑菌浓度(MIC)：
测定方法参照上述步骤3)。
所得结果为：
二级轻馏分(2DL)对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)的抑制作用进一步加强，其中对金黄色葡萄球菌的MIC值为19.5μg/mL，抑菌等级为高活性；对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)和真菌(黑曲霉和白色念珠菌)的抑制活性与一级轻馏分(1DL)基本相同。
对比例1-1、将实施例1步骤2)的蒸发温度改为65℃、系统压力改为5Pa；其余等同于实施例1的1)～3)。
对比例1-2、将实施例1步骤2)的一级冷凝温度改为10℃；其余等同于实施例1的1)～3)。
对比例2-1、将实施例1步骤2)的进料流速改为1mL/min、刮膜转速改为80rpm，从而相应改变物料在蒸发器内的停留时间(约为14s)；其余等同于实施例1的1)～3)。
对比例2-2、将实施例1步骤2)的进料流速改为3.5mL/min、刮膜转速改为150rpm，，从而相应改变物料在蒸发器内的停留时间(约为7s)；其余等同于实施例1的1)～3)。
所得一级轻馏分(1DL)的抑菌效果，如下表2所述。
表2、对比例1-1～对比例2-2的一级轻馏分(1DL)的抑菌效果
对比例3、将实施例1步骤4)的蒸发温度改为50℃、系统压力改为100Pa、一级冷凝温度改为10℃；其余等同于实施例1。
所得结果为：二级轻馏分(2DL)的抑菌效果基本同一级轻馏分(1DL)。
对比例4、将实施例1步骤4)的蒸发温度改为35℃、系统压力改为120Pa、一级冷凝温度改为20℃；其余等同于实施例1。
所得结果为：二级轻馏分(2DL)的抑菌效果基本同一级轻馏分(1DL)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
