一种异形血管模型或人工血管及其制备方法
技术领域
本发明属医疗器械技术领域，具体涉及异形血管模型或人工血管及其制备方法。
背景技术
心脑血管疾病最常见的是脑中风和心肌梗死，发病率和死亡率在全球最高。根本原因是以动脉粥样硬化为主的血管病变，其危害不仅反映在脑和心脏，其它组织器官如眼、肝、肾、下肢等都会发生缺血性坏死。因此，研究血管疾病的发生和发展机制，开发预防和治疗动脉粥样硬化的药物一直是心脑血管研究领域的最重要课题。
导致血管疾病的因素很多，如高血脂、高血压、高血糖和药物等，这些因素先是诱发了了血管内皮细胞、平滑肌细胞的损伤和功能的改变，随后导致血管病变。因此，在血管生物学、血管生理学研究中，需要大量的体外细胞实验，观察和验证各种因素如何引发血管内皮细胞和平滑肌细胞的损伤和功能改变。目前，这些细胞实验主要依靠在培养皿简单的二维细胞培养，个别实验室利用流动小室(Flow%20Chamber)培养血管内皮细胞或平滑肌细胞来进行研究。
考虑到血管细胞在自然条件下所处的空间、压力、流动力学、收缩与舒张等环境，只有在模拟血管的环境条件下开展血管细胞实验，才能获得更有意义的血管生物学、血管生理学信息，从而更加准确地研究血管疾病机制和防治策略。因此，制备仿生活性人工血管，用于血管生物学、生理学研究的体外模型，极具应用价值。天然血管的形状多样，有分支、弯曲等异形结构，血液在天然血管中脉动流动时，管壁内会产生多种功复杂的应力作用，是流动小室无法模拟的。此外，临床常见的心脏血管搭桥、头颈血管搭桥、血液透析动静脉瘘等都采用血管侧面缝合方式(桥接)。血管分支或者桥接位置的血流动力学不均匀，内膜增生或血栓等血管病变都发生在这些位置。因此，在体外细胞实验研究血管病变机制时，尤其需要异形结构的人工血管。据我们所知，目前没有用于实验研究的血管模型，尤其是没有活性、异形结构的血管模型的制备技术和产品。
此外，人工血管在心血管疾病或外周血管疾病的治疗中存在巨大的需求，目前临床上使用的人工血管主要是聚苯二甲酸乙二醇酯
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种异形人工血管或血管模型及其制备方法，根据需要研究或置换的天然血管的形状、管径变化、曲率变化、分叉、血液动力学等异型结构与特性，设计制备出相似的异型结构人工血管或血管模型。解决现有技术中，规则血管不能开展的特定部位血管生物学、生理学和流动力学研究，以及不能移植治疗结构复杂的病变血管的难题。
本发明公开了一种异形血管模型或人工血管的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、利用计算机软件对动物或人体特定部位的血管进行尺寸三维数据获取，数据获取的方法包括CT扫描、多普勒超声成像、核磁成像、血管造影中至少一种。利用获取的血管尺寸三维数据，采用医用不锈钢、聚丙烯(PP)、硅胶等材料，通过3D打印、浇铸、切割，激光刻蚀等方法，构建仿生的血管3D模具。
步骤2、在步骤1所述的血管模具上制备出多孔、网状聚合物支架。材料选用聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、对二氧六环酮(PDO)、聚L-丙交酯-己内酯(PLCL)中一种或几种的任意比例混合物，制备方法采用静电纺丝、熔融纺丝、纤维编织、3D打印中至少一种。所述血管模具与所述网状聚合物支架合并称为血管复合体。
步骤3、将步骤2制备的所述血管复合体移除血管模具，血管模具的移除采用拖拽取出、机械拆解、溶解取出、融化取出中至少一种，得到血管模型或人工血管A。
步骤4、将步骤3制备的所述A种植细胞，于体外生物反应器中进行流动培养，待细胞充分增殖和产生胞外基质以后，脱除细胞，得到活性血管模型或人工血管B。
步骤5、将步骤2制备的所述血管复合体埋植到动物或人皮下，待充分细胞化和产生胞外基质后，从动物或人皮下取出，移除血管模具，脱除细胞，得到活性血管模型或人工血管C。
进一步地，步骤2所述制备的多孔、网状聚合物支架，其中结构参数包括纤维直径、孔径、壁厚、纤维取向和纤维间交叉角度。所述纤维直径为5-100μm，纤维间的交叉角度是30-150°，纤维支架的厚度是100-1000μm。
优选地，所述网状纤维支架的纤维直径为60±5μm，纤维间的交叉角度是130°。所述网状纤维支架通过加热法或者有机溶剂溶胀法，使纤维之间形成一定程度的粘连。
步骤4与步骤5所述的脱细胞处理步骤，包括SDS法、液氮冻融法中至少一种。
优选地，所述SDS法包括如下步骤：将细胞化的血管支架浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将血管支架上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将血管支架上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
优选地，所述液氮冻融法包括如下步骤：将细胞化的血管支架于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌生理盐水将血管支架上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
本发明还公开了一种异形血管模型或人工血管，利用所述异形血管模型或人工血管的制备方法生产。
本发明的有益效果在于：
1、一种异型结构血管模型或人工血管具有和天然血管相匹配的形状、直径变化、曲率变化、分叉力学，血液动力学等不规则特点，解决了现有规则形状人工血管因为结构均一而导致的结构、力学特征与天然血管不匹配等问题，能够更好作为血管模型研究血管生物学问题、研究血管病变机制，和进行血管移植治疗；
2、本发明构建的异形血管模型或人工血管尤其具有活性，活性的取得是分别通过接种成体细胞或干细胞，在体外生物反应器中流动培养，或者通过皮下埋植实现的，两种方式均能产生细胞外基质，将聚合物纤维支架包埋。脱除细胞后，聚合物纤维和细胞外基质的成分与活性不受影响。
3、获得的异形血管模型可以用于血管细胞培养，模拟天然血管的结构、力学和活性组织微环境，能够研究特定部位、特殊形状病变血管的病理机制，获得更有价值的血管生物学信息。作为新型有效的血管模型和研究工具，服务于心血管科学研究。
4、同时，带有活性细胞外基质的人工血管的组织再生性能显著优于单纯材料制备的人工血管，能够用于临床血管移植治疗，显著提高治疗效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明采用的技术实施例如下：
实施例1
本实施案例用近场直写系统制备出具有曲率变化和“喇叭口”结构缝合端的多孔人工血管支架，用于心脏搭桥手术血管模型，研究搭桥血管在狭窄发生和发展的机制，包括如下步骤：
对比格犬冠状动脉搭桥手术部位进行CT成像和血管造影，通过软件对需要搭桥的部位和所需血管进行准确测量，构建出具有XYZ轴三维曲率变化和“喇叭口”结构、用以控制缝合端血流动力的异形人工血管三维模型，并对血管血流进行血液动力学数据采集；
根据构建出的具有三维曲率变化的人工血管三维模型，用聚丙烯(PP)通过铸造技术制备出直径为2.5mm、曲率半径分别为8cm、13cm垂直弯曲的、两端为锥形结构的异型结构模具；
根据移植血管的三维构建和血管移植部位的血液动力学数据，利用计算机软件设计出能与该移植部位血液动力学相匹配的多孔纤维支架，通过近场直写系统在PP模具上用聚合物PCL制备出上述口径为2.5mm、曲率半径分别为8cm、13cm垂直弯曲的，纤维直径为6μm，壁厚为250μm的、且两端带“喇叭口”结构的多孔纤维支架；
先将PP模具拆卸取出，在纤维支架上种植人源诱导性多能干细胞(h-iPS)，种植过程中每4小时旋转90°，以保证种植的细胞均匀分布。静置培养24小时，随后继续培养5天，以使细胞增殖。增殖培养结束后，将培养基更换为添加有平滑肌细胞诱导因子的培养基，继续开展7天的流动培养，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，并以每天30mL/min的增加速度从20mL/min逐渐增加至200mL/min。
上述培养过程结束后，将细胞化的纤维支架按照以下步骤进行脱细胞处理：于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌生理盐水将纤维支架上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
采用上述过程制备直径为2.5mm，形状规则、无曲率变化的活性血管模型，作为对照材料。
将上述得到的具有曲率变化的异型结构活性血管模型作为比格犬心脏搭桥的体外血管模型，以形状规则、无曲率变化的活性血管模型作为对照，探究冠状动脉搭桥吻合口处血流动力学对冠状动脉移植物再狭窄的影响。具体步骤如下：在两种血管模型上分别种植血管平滑肌细胞，种植过程中每4小时旋转90°，种植完成后将血管支架在37℃，5％CO2的培养箱中静置培养24小时，使接种细胞黏附于血管模型支架上。随后将血管模型接入流动培养反应器中，根据研究需要，施加模拟心脏搭桥部位血液流动条件的切应力和/或径向压应力培养7天。通过分析和比较细胞增殖、基因表达和蛋白表达等，探究血流动力学刺激引起心脏搭桥部位血管再狭窄的发生机制，评价异形血管和“喇叭口”缝合方式在心脏搭桥手术中的意义。
实施例2
本实施案例采用生物编织制备具有分叉结构的PU纤维支架，并构建组织工程血管，作为血管模型，模仿腹主动脉分叉部位的血管，在体外研究流体力学、材料顺应性和微环境对血管生理和功能的影响，包括如下步骤：
通过血管造影对比格犬的腹主动脉分支位置成像，确定直径(8-6-4mm，主干血管8mm，一级分支血管6mm，二级分支血管4mm)、分叉角度(70°)和长度(6-5-4cm，主干血管6cm，一级分支血管5cm，二级分支血管4cm)，构建出血管的三维结构，对该部位血液动力学数据进行采集分析；
将医用不锈钢采用锻造技术分段制备出符合移植所需血管三维结构的模具，模具组装不影响与后续网状纤维支架的分离；
根据上述步骤构建的血管三维结构和腹主动脉血液动力学特性，采用计算机软件设计出满足腹主动脉移植力学强度的网状纤维支架；
采用生物编织技术，在组装好的腹主动脉分叉模具上用PU聚合物编织出纤维直径为100μm，管径为8-6-4mm、分叉角度为70°和长度为6-5-4cm的网状纤维支架，得到由医用不锈钢和网状纤维支架共同组成的复合体；
将复合体埋植于羊皮下，一个月后取出，将不锈钢模具拆卸移除，获得由聚合物纤维、细胞和细胞外基质组成的人工血管材料；
将人工血管材料进行脱细胞处理，首先置于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将人工血管材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(体系同上2.1)，于摇床上室温摇晃24h，随后在超净工作台中用无菌生理盐水将管上残留的DNase和RNase冲洗干净，制得具有分叉的异型结构活性血管模型；
将上述步骤得到的具有分叉的异型结构活性血管模型作为比格犬腹主动脉分叉部位血管研究的体外模型，以常规的流动小室模型作为对照。在血管模型上种植血管内皮细胞，种植过程中每4小时旋转90°，种植完成后将血管支架在37℃，5％CO2的培养箱中静止培养24小时，使接种细胞黏附于血管模型支架上。在对照组中，内皮细胞种植在细胞专用载玻片上，放入流动小室。随后将血管模型和流动小室同时接入流动培养反应器中。根据研究需要，施加模拟犬腹主动脉分叉部位血液流动条件的切应力和/或径向压应力培养7天。在培养结束后，通过银染技术对血管内皮细胞外轮廓进行染色，以观察内皮细胞的形态和朝向分布情况。此外，分别提取血管模型和载玻片上所培养细胞的总蛋白，通过双向凝胶电泳技术寻找差异表达蛋白，并采用质谱技术进行蛋白质鉴定。分析上述步骤中得到的差异表达蛋白，找出与力学刺激相关的蛋白质并采用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)等软件对差异蛋白进行功能和信号通路分析，考察流体力学刺激对于血管细胞基因调控、蛋白表达的影响。分析结果与常规的流动小室模型作对比，研究在仿生条件下血流动力学对血管内皮细胞生理功能的影响与作用。
实施例3：
本实施案例以网状PLCL纤维支架构建活性人工血管，选取羊颈动脉为移植部位，开展血管生理功能重塑研究，包括如下步骤：
本实施案例采用熔融纺丝制备管径变化的PLCL纤维支架组织工程血管，用羊颈动脉旁路移植，包括如下步骤：
对实验动物羊的颈动脉进行多普勒超声成像系统、CT和核磁共振成像检测，获取移植部位血管的结构数据，用计算机模型将天然血管的管径修正为由4mm均匀递减到2.5mm，长度为8cm，并用生物传感器检测该部位血液动力学数据；
采用3D打印方法制备出管径由4mm均匀缩至2.5mm，长度为8cm的医用硅胶棒模具；
利用计算机控制软件根据上述测量的管径变化和长度，以及移植部位的血液动力学数据，计算出PLCL熔融纺丝网状纤维支架的所需强度；
设置熔融纺丝机的熔化温度为200℃，将2g PLCL熔化1h，在长度8cm，外径由4cm均一变化至2.5cm的硅胶棒上利用计算机编程软件控制，纺出纤维直径为60μm，纤维交叉角度为50°，厚度为400-350μm变化的网状纤维支架，制备完成后取出硅胶棒模具；
在上述管状纤维支架进行细胞种植。首先在支架上种植血管平滑肌细胞，在37℃和5％CO2的培养箱中静止培养24小时，以使平滑肌细胞粘附于血管支架上，开展7天的流动培养，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，并以每天30mL/min的增加速度从20mL/min逐渐增加至200mL/min。随后，在人工血管内腔面种植内皮细胞，通过匀速旋转培养8小时，以使内皮细胞均匀附着于内腔面。随后继续以与第一周相同的流动培养参数继续培养一周；
流动培养结束后，对获得的组织血管进行脱细胞处理，步骤如下：将细胞化的血管支架浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将血管支架上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将血管支架上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存；
将制备得到的活性人工血管植入到对应的羊的颈动脉中，采用血管搭桥、端侧吻合模式，使直径4mm一端接入近心端，直径2.5mm一端接入远心端。通过体外监测血流动力学和取材后的组织学等分析，对异形人工血管在体内的血管生物学、病理学再生与重构过程开展评价研究，重点关注吻合部位由于直径不同带来的血液动力学、细胞学、管壁生理学的变化。
实施案例4
本实施例采用3D打印技术制备具有仿生的PCL多孔纤维支架，并在支架上种植细胞，通过流动培养技术在体外建立人颞浅动脉人工血管模型，研究血流动力学对内皮细胞和平滑肌细胞的影响、血管病变机制，以及用于药物筛选评价，步骤如下：
对人颞浅动脉进行CT成像获得血管的三维结构，以医用硅胶为材料熔铸制备出相应的血管模具，以PCL为材料，用生物3D打印技术在模具上打印制备纤维直径为10μm，结构与颞浅动脉一致的多孔纤维支架，制备完成后取出硅胶模具；
在多孔纤维支架接种血管平滑肌细胞，按照3ⅹ106个细胞/cm2的密度接种到多孔支架上，接种过程中每6小时接种一次，每次管体旋转90°。接种完成后，连通流动培养，继续培养5天使细胞增殖。增殖培养结束后，在管腔内部按照1ⅹ106个个细胞/cm2均匀接种血管内皮细胞，静置培养8小时后，开展7天的流动培养，流动培养过程中通过蠕动泵控制培养基流速，并以每天30mL/min的增加速度从20mL/min逐渐增加至200mL/min。获得颞浅动脉组织工程血管；
作为对照，在商用ePTFE人工血管上采用上述相同的方法接种细胞并培养；此外，在流动小室的玻璃片上接种血管平滑肌细胞，在平滑肌细胞层上面接种血管内皮细胞。
将上述三种类型的模拟动脉血管的模型用于体外实验，研究血管生物学和生理学问题。三种血管模型分别被连接到流动培养生物反应器，给与相同的模拟正常血液流动条件的流动力学、剪切力和压力刺激，分析和比较各组细胞生长、基因表达和蛋白表达的规律。或者模拟血管损伤，使用LPS或TNF-α处理血管细胞，造成细胞伤害，在培养基中添加250mmol/L曲匹地尔或30μg/mL丹参提取物等，对上述三种模拟动脉血管模型给予药物治疗，检测细胞功能的恢复，对曲匹地尔或丹参提取物等药物的药理药效进行筛选与评价。与商用ePTFE血管或流动小室模型相比，仿生组织工程血管可以更真实地模拟血管生理环境，开展更加科学的体外实验研究。
实施案例5
本案例采用湿法纺丝技术，以PLCL为材料在医用硅胶管上构建出纤维支架，经过兔子皮下埋植，制备具有细胞外基质的活性人工血管，用于血管移植治疗，实施步骤如下：
首先，利用多普勒超声成像系统对成年新西兰兔天然颈动脉进行测试，获取移植部位的血管规格，并根据天然血管规格熔铸制备内径硅胶管；
将浓度为10％的PLCL溶液以2.5ml/h的速度挤出到凝固浴中，将硅胶管套在不锈钢管上作为接受棒，以1000rpm的速度收集PLCL纤维。制备的纤维支架用乙醇洗涤3次，然后在真空干燥器中干燥2天，以除去残留的溶剂；
支架的纤维直径为20μm，将纤维支架和医用硅胶管组成的复合体在两端用医用缝合线扎紧，植入到新西兰兔的背部皮下，培育一个月；
将包含细胞和细胞外基质的PLCL纤维支架从皮下取出后，去除周围的结缔组织和硅胶管，直接进行自体兔颈动脉移植，或者按照上述脱细胞处理工艺，制备脱细胞活性人工血管，用于异体兔颈动脉移植。通过多普勒超声、血管造影考察血管通畅性，取材后进行组织学分析，评价组织工程血管和活性人工血管在体内的再生与重塑。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
