抗人Tim3抗体或其功能性片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学和抗体工程技术领域，尤其是涉及一种抗人Tim3抗体或其功能性片段及其应用。
背景技术
免疫治疗为肿瘤治疗提供了新途径，以PD1/PDL1和CTLA4免疫检查点抑制剂为代表的抗体药物，已经使部分肿瘤患者受益，但多数患者表现为药物初始无反应或部分应答患者仍然出现肿瘤进展，这可能与存在其他免疫抑制分子的作用及免疫系统的不完全激活相关。筛选并联合新的免疫治疗靶标，优化治疗策略，是当前肿瘤治疗的一大发展趋势。
T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-3，Tim3；也称为HAVCR2)是继PD1/PDL1和CTLA4之后最热门的免疫抑制分子之一。Tim3是一种I型跨膜糖蛋白，最初在产生IFN-γ的Th1和细胞毒性CD8+T(Tc1)细胞表面发现。随后发现Tim3可表达于多种肿瘤细胞和其他免疫细胞，如Th17细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TILs)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)和天然免疫细胞。Tim3与其配体结合负性调控免疫应答。目前已报道的Tim3配体有4个，包括半乳凝素-9(Galectin-9,Gal9)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(carcino-embryonic antigenrelated cellular adhesion molecule 1，CEACAM1)、高迁移率族蛋白B1(high mobilitygroup protein B1，HMGB1)和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PtdSer)。Tim3与其配体结合介导免疫抑制。具体而言，Tim3与PtdSer结合介导凋亡细胞的清除；Tim3与HMGB1结合抑制肿瘤微环境中树突状细胞介导的天然免疫应答；Tim3与CEACAM1结合与Tim3介导的免疫耐受和T细胞耗竭相关；Tim3与Gal9结合调控肿瘤微环境中T细胞的凋亡，介导T细胞免疫抑制。
Tim3介导自身免疫和同种异体免疫的免疫耐受，Tim3表达失调与自身免疫性疾病相关，T细胞上Tim3的表达水平与自身免疫性疾病进展呈负相关。然而，在慢性病毒感染(如人类免疫缺陷病毒HIV、丙型肝炎病毒HCV)和肿瘤发展过程中，Tim3的高水平表达与T细胞抑制和功能耗竭相关。在多种类型的肿瘤中可检测到Tim3表达升高，如非小细胞肺癌、肝细胞癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、头颈部癌、肾细胞癌、胃癌、食道癌、前列腺癌、膀胱尿路上皮癌和非霍奇金淋巴瘤等。已报道Tim3表达升高常与患者较短的生存期有关。Tim3是实体瘤潜在的预后标志物。Tim3可以从细胞表面切割下来成为可溶性Tim3(sTim3)。sTim3水平一定程度上反映了细胞膜表面Tim3表达水平。
肿瘤微环境中，抗肿瘤免疫的主要效应细胞CD8+T细胞一旦表达或共表达Tim3、PD1和CTLA4等免疫抑制分子，则标志着CD8+T细胞功能耗竭。肿瘤浸润性淋巴细胞中Tim3的表达水平与PD1/PDL1水平正相关，Tim3表达上调可能是诱导PD1抗体治疗耐药的重要机制。Tim3是肿瘤免疫治疗的有效靶点，抗Tim3单抗可与CTLA-4、PD-1和PD-L1抗体等起到协同作用，并且能够治疗PD-1和PD-L1耐药的患者。Tim3抗体的抗肿瘤治疗目前处于临床试验阶段。Tim3抗体在肿瘤治疗中具有较好的临床应用前景。现有的Tim3单抗大多是通过鼠杂交瘤技术制备。抗体工程技术的进步促进了抗体的制备，并提高了其检测性能。噬菌体抗体库技术可以用于筛选任何抗原特异性的抗体。利用免疫的小鼠噬菌体抗体库筛选人Tim3高性能单克隆抗体，与鼠杂交瘤抗体筛选技术相比，更有机会获得高亲和力抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人Tim3抗体或其功能性片段及其应用。本发明提供的抗体具有高敏感性、高特异性、高亲和力和结合不同抗原表位的特点，可以用于检测可溶性Tim3蛋白及细胞膜表面Tim3蛋白，有助于提高检测结果的准确性。
为了实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗人Tim3抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含如下CDR区：
重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，或者分别如SEQID NO.4-5以及SEQ ID NO.3所示，或者分别如SEQ ID NO.6-8所示；
轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14-16所示；或者分别如SEQ ID NO.17-19所示；或者分别如SEQ ID NO.20-22所示；或者分别如SEQ ID NO.23-25所示。
在一些实施方式中，所述抗体或其功能性片段的重链可变区序列和轻链可变区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.26所示，或者分别如SEQ ID NO.10和SEQID NO.27所示，或者分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.28所示，或者分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.29所示。
在一些实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包含抗体恒定区Fc；优选地，所述恒定区Fc包括重链恒定区和轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区选自：IgD、IgE、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4中任意一种；
优选地，所述轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区；
更优选地，所述重链恒定区选自IgG1，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
更优选地，所述轻链恒定区为κ型，氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
在一些实施方式中，所述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述抗体为小鼠单克隆抗体。
一种核酸分子，所述核酸分子编码所述抗体或其功能性片段。
一种载体，所述载体包含所述核酸分子。
一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述核酸分子或所述载体。
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E(humanembryonic kidney 293E cell)细胞、CHO(Chinese hamster ovary cell)细胞或NSO胸腺瘤细胞。
一种抗体偶联物，其包括所述抗体或其功能性片段。
所述抗体或其功能性片段在制备检测Tim3蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
一种试剂盒，所述试剂盒包括所述抗体或其功能性片段、所述核酸分子、所述载体和所述抗体偶联物中的一种或多种。
有益效果：
本发明提供的抗Tim3抗体具有较强的亲和力和较高的特异性，能够识别并结合Tim3不同抗原表位，可以用于检测可溶性Tim3蛋白及细胞膜表面Tim3蛋白，有助于提高检测结果的准确性，本发明提供的抗体开发前景广阔。
本发明研制出一种全新的Tim3抗体，为鼠抗人Tim3的单克隆抗体，对可溶性Tim3蛋白和细胞膜表面Tim3蛋白检测具有高敏感性、高特异性、高亲和力和具有可结合Tim3不同表位的特征，可通过多种免疫学方法检测肿瘤细胞和免疫细胞膜表面Tim3蛋白和体液中sTim3，将其用于检测以Tim3作为靶点的细胞或体液时，具有较高的灵敏度和特异性，为Tim3蛋白检测提供了一种新的抗体选择，为肿瘤、自身免疫病及感染性疾病的诊断和治疗提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Tim3抗体纯度的SDS-PAGE鉴定；图中，A：非还原条件；B：还原条件；M：Marker；1：MsT001；2：MsT065；3：MsT229；4：MsT286；
图2为Tim3抗体检测Tim3蛋白特异性的ELISA鉴定；
图3为Tim3抗体检测Tim3蛋白特异性的Western blotting鉴定；图中，A：丽春红染色的代表性结果；B：Western blotting检测结果；M：Marker；1：非还原条件下的Tim3重组蛋白；2：还原条件下的Tim3重组蛋白；
图4为Tim3抗体识别Tim3-GFP重组质粒转染293FT细胞表面Tim3蛋白的流式细胞术鉴定；
图5为Tim3抗体识别U937细胞表面天然表达Tim3蛋白的流式细胞术鉴定；
图6为Tim3抗体检测Tim3蛋白敏感性的ELISA鉴定；
图7为生物素标记Tim3抗体检测Tim3蛋白敏感性的放大ELISA鉴定；
图8为Tim3抗体对Tim3蛋白结合的亲和力鉴定；
图9为Tim3抗体结合Tim3蛋白不同表位的夹心ELISA鉴定；
图10为Tim3抗体结合Tim3蛋白不同表位的ForteBio Octet蛋白相互作用鉴定；
图11为识别Tim3不同表位的Tim3配对抗体检测Tim3蛋白敏感性的夹心ELISA鉴定。
具体实施方式
为了本发明可以更容易地理解，进一步描述如下：
本发明提供了一种Tim3抗体或其功能性片段及其应用。
本发明涉及抗T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(Tim3)鼠单克隆抗体，具体地，所述单克隆抗体以其特定核酸序列编码特异性结合细胞膜表面Tim3蛋白及可溶性Tim3蛋白的抗体。
本发明提供了特异性结合Tim3的抗体或其功能性片段，其轻链和重链的互补决定区具有如下(1)-(4)任一项所示的序列：
(1)：重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14-16所示；
(2)：重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-5以及SEQ ID NO.3所示；轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.17-19所示；
(3)：重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示；轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20-22所示。
(4)重链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示；轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23-25所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(1)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(2)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(3)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(4)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
术语“抗体”是指包含至少一个并优选两个重链(H)可变区(此处缩写VH)、至少一个并优选两个轻链(L)可变区(此处缩写VL)以及至少一个并优选两个重链恒定区的蛋白质。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(complementarity determiningregions，CDR)，与称为“框架区”(framework regions，FR)的更保守区域相间。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。
本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。
本发明所述的“功能性片段”特别地指具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。这些功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本发明所述功能性片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv中的一种或多种。抗体功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
在本发明公开了上述Tim3的单克隆抗体或其功能性片段的氨基酸序列上，本领域技术人员容易利用本领域常规的技术例如基因工程技术获得上述Tim3的单克隆抗体或其功能性片段，无论其以什么方式获得上述Tim3的单克隆抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种用于Tim3定量检测的配对抗体，其中，第一抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO.9的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID NO.26的轻链可变区；第二抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO.11的重链可变区和氨基酸序列为SEQ ID NO.28的轻链可变区，或者第二抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO.12的重链可变区和氨基酸序列为SEQ IDNO.29的轻链可变区。
所述第一抗体为捕获抗体，第二抗体为检测抗体。
本发明提供的配对抗体用于检测Tim3，可以利用所述配对抗体建立双抗体夹心酶联免疫反应体系、胶体金层析检测体系、化学发光定量检测体系或荧光免疫层板检测体系进行检测。
一种检测人Tim3的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述试剂盒含有上述第一抗体和第二抗体。
本发明的另一方面还在于提供一种核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的抗体或其功能性片段。
在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。
基于本发明公开的氨基酸序列上，本领域技术人员容易获取编码这些抗体的核苷酸序列，无论其核苷酸分子序列如何变化，其只要是编码上述抗Tim3的单克隆抗体或其功能性片段，即属于本发明的保护范围。
本发明的另一方面还在于提供一种载体，其包含上述的核酸分子。所述载体可以是克隆载体与表达载体，包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
本发明的另一方面还在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如上所述的核酸分子或上述的载体。
所述宿主细胞主要涉及真核细胞，真核细胞包括哺乳细胞、酵母、昆虫细胞。尤其是全抗体或全长抗体制备，常用到哺乳细胞，可以是CHO、293、NSO细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳细胞293。
一种生产能够特异性地结合Tim3抗体及其功能片段的方法，包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体及其功能片段。
本发明的另一方面还在于提供所述抗体或其功能性片段在检测Tim3蛋白的试剂或试剂盒中的应用。
在本发明公开的抗体的基础上，本领域技术人员容易地将上述单克隆抗体或其功能性片段用于制备检测Tim3蛋白的试剂或试剂盒，无论试剂或试剂盒是基于何种检测原理例如免疫沉淀、ELISA等，只要其利用了本发明的抗体或其功能性片段，即属于本发明的保护范围。
本发明的另一方面还在于提供包含所述的抗体或其功能性片段的抗体偶联物或抗体组合物。
本发明还提供了一种试剂盒，其包括前述的抗体或其功能性片段、核酸分子、载体或抗体偶联物。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：小鼠抗人Tim3单克隆抗体制备
(1)动物免疫
实验动物选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养一周无异常后，进行编号。经眼眶后静脉丛采血约0.1ml。室温静置1小时后4℃过夜，经1500g离心后取上层血清，-20℃保存备检。基础免疫用100μg/100μl的Tim3-His重组蛋白(ACRO Biosysterms公司)与等体积弗式完全佐剂(Sigma公司，货号F5881)乳化混匀，经腹部、背部皮下多点注射进行免疫。间隔3周进行加强免疫，等量Tim3-His重组蛋白与弗式不完全佐剂(Sigma公司，货号F5506)乳化混匀，多点皮下注射进行免疫。免疫三次后，小鼠休息六个月，加强免疫一次，末次免疫7天后经眼眶后静脉采血并分离血清，检测血清效价。一月后选取效价较高的小鼠腹腔注射Tim3-His重组蛋白100μg进行冲击免疫，免疫后第3天处死小鼠，无菌采集脾脏，迅速转移至液氮冻存备用。
(2)效价检测流程
Tim3-His重组蛋白用包被缓冲液(pH9.5的0.1M碳酸钠)稀释成5μg/ml，加入到96孔板酶标板中，100μl/孔，轻微震荡混匀，用保鲜膜封严，4℃过夜；洗板机洗三次，拍干酶标板，加入200μl/孔封闭液封闭非特异性结合位点，37℃，2h；洗板机洗三次，加入梯度稀释的血清100μl/孔，37℃反应2h；洗板机洗五次，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，100μl/孔，37℃反应1h；洗板机洗五次，以100μl/孔加入显色液37℃放置30min；加入终止液50μl/孔加入；用酶标仪测定OD450nm值。小鼠血清稀释度在1:16000，抗体检测阳性，选取OD450值较高的小鼠进行冲击免疫。
(3)抗体分泌淋巴细胞的提取分离及cDNA的合成
免疫小鼠脾脏用Trizol法提取总RNA，经反转录过程合成cDNA。
(4)scFv噬菌体抗体库构建和抗体筛选
反转录后用特异引物对通过PCR扩增抗体可变区(V)基因，之后将重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)片段拼接，获得融合的scFv片段并插入到pCOMB3X噬菌体载体，电转XL1-Blue感受态细胞，获得噬菌体抗体库，库容不低于108。ELISA法包被Tim3-His重组蛋白对噬菌体库进行筛选，采用“淘洗-扩增-富集”循环方式，一般2轮以上得到阳性克隆。将ELISA检测阳性克隆PCR扩增，酶切分型后送测序，根据测序结果挑选适合的可变区序列。
(5)抗体表达载体构建
以噬菌体菌液或质粒为模板，扩增可变区基因，将可变区基因片段插入到包含抗体恒定区的表达载体上，构建IgG抗体重链(pCMV3-H)和轻链(pCMV3-L)表达载体。扩增质粒后送下游表达。
实施例2：Tim3抗体序列分析
抗体可变区氨基酸序列分析通过scFv实施噬菌体抗体库筛选确证4个Tim3单克隆抗体，命名为MsT001、MsT065、MsT229和MsT286。
阳性克隆通过测序获得轻链和重链可变区序列。
通过IGBLAST软件分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，发现scFv抗体属于VH类别和Vκ型；ABodyBuilder软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/abodybuilder/)在Kabat模式下进一步分析每个抗体VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)三个CDR区位置。
抗体重链可变区CDR序列如下表1所示。
表1
重链可变区氨基酸序列如下(下划线为信号肽氨基酸序列)：
MsT001-VH氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVQLQQSGAEVVMPGASVKMSCKTSGYTFTDYLIHWVKQRPGQGLVWIGAIDTSDSYASYNQKFKGKATLTLDESSRTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTGEGLDYWGQGTSVTVSS；
MsT065-VH氨基酸序列SEQ ID NO.10)：
MGWSLILLFLVAVATRVLSQVQIQQSGAELVMPGASVKMSCKASGYTFTDHLMHWVKQRPGQGLEWIGAIDTSDSYASYNRKFKGKATLTVDESSRTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAGEGLDYWGQGTSVTVSS；
MsT229-VH氨基酸序列SEQ ID NO.11)：
MGWSLILLFLVAVATRVLSEIQLVQSGPELVKPGASMKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGQNLEWIGLINPQTGGTSYNQNFRGKATLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARERGFDSPGFPYWGQGTLVTVSA；
MsT286-VH氨基酸序列SEQ ID NO.12)：
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQSGPELVKPGASMKMSCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGQNLEWIGLINPQTGGTSYNQNFRGKATLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARERGFDSPGFPYWGQGTLVTVSA；
四个抗体重链恒定区氨基酸序列相同(SEQ ID NO.13)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK；
轻链可变区CDR氨基酸序列如表2所示。
表2
轻链可变区氨基酸序列如下(下划线为信号肽氨基酸序列)：
MsT001-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.26)：
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKPGQSPKLLIYKVSYRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK；
MsT065-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.27)：
MGWSCIILFLVATATGVHSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLEMK；
MsT229-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.28)：
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK；
MsT286-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.29)：
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK；
四个抗体轻链恒定区氨基酸序列相同(SEQ ID NO.30)：
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
此外，编码抗体的核苷酸序列如下所示：
编码抗体重链可变区的核苷酸序列(下划线为信号肽编码序列)：
MsT001-VH核苷酸序列(SEQ ID NO.31)：
ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGTGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGGTTGTGATGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACATTCACTGACTACTTGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGTATGGATCGGAGCGATTGATACTTCTGATAGTTATGCTAGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTTTAGACGAATCCTCCAGGACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTACAGGAGAGGGTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA；
MsT065-VH核苷酸序列(SEQ ID NO.32)：
ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGTCAGGTCCAGATACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGATGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTCACTGACCACTTGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGCGATTGATACTTCTGATAGTTATGCTAGCTACAATCGAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACGAGTCCTCCAGGACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAGGAGAGGGTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA；
MsT229-VH核苷酸序列(SEQ ID NO.33)：
ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGTGAGATTCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGACAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTCAGACTGGAGGCACTTCCTACAACCAGAATTTCAGGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAAAGGGGGTTTGATTCACCCGGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACTGTCTCTGCA；
MsT286-VH核苷酸序列(SEQ ID NO.34)：
ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGTCAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGACAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTATTAATCCTCAGACTGGAGGCACTTCCTACAACCAGAATTTCAGGGGCAAGGCCACATTAACTGTAGACAAGTCATCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAAAGGGGGTTTGATTCACCCGGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACTGTCTCTGCA；
四个抗体编码重链恒定区的核苷酸序列相同(SEQ ID NO.35)：
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA；
编码抗体轻链可变区的氨基酸序列如下(下划线为信号肽编码序列)：
MsT001-VL核苷酸序列(SEQ ID NO.36)：
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGATATCCAGATGACTCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTAAATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCTACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA；
MsT065-VL核苷酸序列(SEQ ID NO.37)：
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAAATGAAA；
MsT229-VL核苷酸序列(SEQ ID NO.38)：
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGATATCCAGATGACTCAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA；
MsT286-VL核苷酸序列(SEQ ID NO.39)：
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGATATTGTGCTAACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGCTGGAAATAAAA；
四个抗体编码轻链恒定区的核苷酸序列相同(SEQ ID NO.40)：
CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA。
实施例3抗体表达及纯化鉴定
同一抗体轻链和重链表达载体同时瞬时转染293细胞，转染后6-7天取培养上清，通过蛋白A纯化柱进行亲和纯化，获得纯化抗体。依据蛋白分子量计算器预测抗体分子量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对抗体纯度和分子量进行鉴定。
SDS-PAGE电泳检测流程：分别取5μg纯化抗体，在非还原条件(蛋白电泳上样缓冲液不添加β巯基乙醇，样本不煮)和还原条件(蛋白电泳上样缓冲液添加β巯基乙醇，样本煮沸5min)下，利用10％SDS-PAGE胶进行电泳分离，150V，电泳约1h。电泳结束后考马斯亮蓝染液进行染色，4℃过夜。第二日脱色液脱色至条带清晰，背景干净后，相机拍照记录染色结果。
SDS-PAG检测结果(图1)：四个抗体重链的分子量预测约为48kDa，轻链的分子量预测约为24kDa，全IgG抗体的分子量预测约为145kDa。经SDS-PAGE电泳鉴定，蛋白分子量与预测分子量相近，抗体纯度良好，纯度在95％左右。图中，A：非还原条件下检测结果；B：还原条件下检测结果；M：Marker；1：MsT001；2：MsT065；3：MsT229；4：MsT286。
实施例4抗体特异性和敏感性鉴定
(1)抗体特异性鉴定
①ELISA检测Tim3抗体的特异性
利用人Tim3、鼠Tim3、人CD137、人PD-L1和人OX40重组蛋白鉴定Tim3抗体的特异性。
ELISA检测流程：包被液包被人Tim3、鼠Tim3、人CD137、人PD-L1和人OX40重组蛋白(全部为His标签)，1μg/ml，4℃过夜。次日，洗板机用Wash Buffer工作液洗3次后，加入5％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，200μl/孔，37℃反应2小时。用洗板机洗3次后，加入用5％脱脂奶粉稀释为1μg/ml的Tim3抗体(Biolegend公司Tim3抗体对照F38-2E2以及MsT001、MsT065、MsT229和MsT286)，100μl/孔，于37℃反应2h。洗涤5次后，加入1:5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)37℃反应1h。洗涤5次后，加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃反应30min。加入终止液，50μl/孔。利用酶标仪测定OD450值。Graphpad软件分析检测结果。
注:主要试剂来源和配制：
包被液(BD OptEIA Coating Buffer，51-2713KC)pH9.5的0.1M碳酸钠；
洗液(BD OptEIA Wash Buffer，51-9003739)20×浓缩洗液，应该用去离子水或者蒸馏水稀释成1×的工作液；
显色液A(BD OptEIA Substrate ReagentA，51-2606KZ)含有过氧化氢的缓冲液；
显色液B(BD OptEIA Substrate ReagentB，51-2607KZ)含有3,3',5,5'四甲基联苯胺(TMB)的有机溶剂；
终止液(BD OptEIA Stop Solution，51-2608KZ)1硫酸；
5％牛奶：5克牛奶加入100ml的1×洗液中(1×wash buffer)。
检测结果(图2)：Tim3抗体F38-2E2、MsT001、MsT065、MsT229和MsT286均可以很好的识别人Tim3重组蛋白，仅MsT286对鼠Tim3重组蛋白有弱交叉结合，制备的四个抗体不与人CD137、PDL1和OX40重组蛋白结合，对人Tim3蛋白有很好的特异性。
②Western blotting检测Tim3抗体的特异性
通过western blotting方法，鉴定Tim3抗体对非还原条件和还原条件下Tim3重组蛋白结合特性。利用市售的Tim3抗体F38-2E2作为对照。
Western blotting检测流程：分别取1μg的Tim3重组蛋白，在在非还原条件(蛋白电泳上样缓冲液不添加β巯基乙醇，样本不煮)和还原条件(蛋白电泳上样缓冲液添加β巯基乙醇，样本煮沸5min)下，利用10％SDS-PAGE胶进行电泳分离，150V，电泳约1h。电泳结束后进行转模，SDS-PAGE胶分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜，300mA，1h。膜用丽春红染液染10min，拍照记录染色结果(图3中A)。去离子水洗涤后用5％脱脂奶粉室温封闭2h。0.5μg/ml抗体(F38-2E2，MsT001，MsT065，MsT229和MsT286)分别4℃过夜结合。PBST溶液洗膜3遍，5min/次。二抗加入1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，室温反应1h。PBST洗涤去除未结合抗体。加入化学发光底物，凝胶成像仪记录检测结果。
检测结果(图3)：对照抗体F38-2E2、MsT229和MsT286抗体主要识别非还原条件的Tim3重组蛋白(短时曝光仅可见非还原条件下目的条带)，考虑其识别的抗原表位主要为构象表位；MsT001和MsT065抗体对非还原条件和还原条件下的Tim3重组蛋白均可很好的识别，考虑其识别的抗原表位主要为顺序表位(也称线性表位)。图中，A：丽春红染色的代表性结果；B：Western blotting检测结果；M:Marker；1:非还原条件下的Tim3重组蛋白；2:还原条件下的Tim3重组蛋白。
③流式细胞术检测细胞膜表面Tim3蛋白
利用Tim3-GFP重组质粒转染293FT细胞后表达于细胞膜表面的Tim3蛋白和U937细胞膜表面天然表达Tim3蛋白通过流式细胞术进行鉴定。以市售小鼠抗人Tim3抗体(F38-2E2)作为阳性对照。
流式细胞术检测流程：Tim3-GFP重组质粒转染293FT细胞24h后，胰酶消化细胞制备单细胞悬液。U937细胞为悬浮细胞。备检细胞用PBS洗一遍，分别加入1μg的抗Tim3抗体(F38-2E2，MsT001，MsT065，mAb和MsT286)室温反应30min，PBS洗1遍，加入1:2000稀释的AF647标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体，室温避光反应30min。PBS洗涤2遍，细胞重悬于200μlPBS溶液。利用BD LSRFortessaTM流式细胞仪进行检测，通过BDFACSDiva软件分析结果。
流式细胞术检测Tim3-GFP重组质粒转染293FT细胞表面Tim3蛋白结果(图4)：Tim3抗体全部可与Tim3重组质粒转染293FT细胞膜表面表达的Tim3蛋白结合。检测时某些293FT细胞GFP标签阳性，Tim3抗体识别Tim3阴性，考虑因GFP标签干扰Tim3抗体对Tim3蛋白的识别所致。
流式细胞术检测U937细胞表面Tim3蛋白结果(图5)：Tim3抗体均可与U937细胞表面天然表达的Tim3重组蛋白结合，检测阳性率在20％左右。
(2)抗体敏感性鉴定
①间接ELISA检测Tim3抗体检测Tim3蛋白敏感性
检测流程：Tim3重组蛋白以10倍梯度稀释(1000-0.001ng/ml)包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。一抗加入1μg/ml的MsT001、MsT065、MsT229、MsT286和对照抗体(F38-2E2)。其余步骤同所述ELISA检测流程。
ELISA敏感性检测结果(图6)：通过间接ELISA法，MsT001和MsT286可以检测Tim3-His重组蛋白的敏感性为1ng/ml，MsT065和MsT229检测敏感性为10ng/ml，F38-2E2检测敏感性为100ng/ml。筛选的4个抗体敏感性均比市售的Tim3抗体F38-2E2敏感性高。
②生物素-链霉亲和素放大ELISA检测Tim3抗体识别Tim3蛋白敏感性
Tim3抗体委托相关公司标记生物素，通过生物素-链霉亲和素放大ELISA鉴定生物素标记Tim3抗体识别Tim3-His重组蛋白的敏感性。
检测流程：Tim3-His重组蛋白以10倍梯度稀释(1000-0.001ng/ml)包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。一抗加入1μg/ml生物素标记的MsT001、MsT065、MsT229、MsT286。二抗加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。其余步骤同所述ELISA检测流程。
放大ELISA敏感性检测结果(图7)：放大ELISA法检测Tim3抗体识别Tim3-His重组蛋白的敏感性，MsT001-Bio和MsT286-Bio抗体的检测敏感性为100pg/ml，MsT065-Bio抗体的检测敏感性为10ng/ml，MsT229-Bio抗体检测的敏感性为(1ng/ml)。
对非标记抗体与生物素标记抗体检测敏感性进行比较(图6和图7)：MsT001-Bio和MsT286-Bio检测敏感性(100pg/ml)较MsT001和MsT286检测敏感性(1ng/ml)提高了10倍。MsT065-Bio和MsT065检测敏感性相同(10ng/ml)，MsT065标记生物素并未提高其检测敏感性。MsT229-Bio检测敏感性(1ng/ml)较MsT229检测敏感性(10ng/ml)提高10倍。
实施例5：Tim3抗体亲和力鉴定
抗体亲和力通过ForteBio Octet分子相互作用仪器检测。Tim3-hFc重组蛋白(Sino Biological)作为检测用抗原，应用FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器，并以Tim3抗体F38-2E2作为对照抗体。
亲和力检测流程：FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器在平衡液中(0.1％BSA+0.02％Tween20的PBS溶液)预湿10分钟，将Tim3-hFc重组蛋白用平衡液稀释为5μg/mL，加到避光96孔板第二列中，200μl/孔；将Tim3抗体从250nM起始倍比稀释至15.6nM，加入避光96孔板第四列中，200μl/孔，设置抗体0nM空白对照，加入200μl平衡液。将平衡液加入第一列与第三列中，200μl/孔。ForteBio Octet分子相互作用仪检测，将传感器在第一列中平衡60s获得基础平衡曲线，然后在第二列中进行抗原固化100s。在第三列中进行洗涤120s，在第四列中结合抗体180s获得结合曲线，回到第一列中解离300s，获得解离曲线。ForteBioOctet分析软件对曲线进行拟合分析，获得亲和力数值。
亲和力检测结果(图8)：通过ForteBio Octet系统对抗体亲和力进行测定，以不添加Tim3蛋白的缓冲盐溶液作为空白对照，以市售Tim3抗体F38-2E2作为检测对照。数据分析后，抗体的亲和力KD值分别为8.40×10-10M(F38-2E2)、4.61×10-11M(MsT001)、1.59×10-9M(MsT065)、3.70×10-9M(MsT229)和7.73×10-10M(MsT286)。曲线拟合优度R2分别为0.9956(F38-2E2)、0.9929(MsT001)、0.9917(MsT065)、0.9702(MsT229)和0.9965(MsT286)。
实施例6：Tim3配对抗体筛选及检测敏感性鉴定
(1)夹心ELISA筛选Tim3的配对抗体
检测流程：捕获抗体固化2μg/ml的Tim3单克隆抗体(MsT001、MsT065、MsT229或MsT286)，4℃过夜；检测用Tim3-His重组蛋白为1μg/ml，100μl/孔，37℃，2h；检测用生物素标记Tim3抗体(MsT001-Bio、MsT065-Bio、MsT229-Bio或MsT286-Bio)，浓度为1μg/ml，37℃，2h；生物素识别加入1：5000过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃，1h。其余步骤同所述ELISA检测流程。
夹心ELISA筛选Tim3抗体配对表位结果(图9；表3)：MsT001可与MsT001-Bio、MsT229-Bio和MsT286-Bio抗体配对，考虑MsT001抗体可能结合Tim3蛋白重复表位，MsT001与MsT229和MsT286具体不同抗原结合表位；MsT065可与MsT001-Bio、MsT229-Bio和MsT286-Bio抗体配对，考虑MsT065与MsT229和MsT286具体不同抗原结合表位。MsT001和MsT065抗体检测结果的不一致性，考虑两个抗体的抗原结合位点存在部分重叠或由于抗体结合后的空间位阻造成，Tim3蛋白先与MsT001结合阻碍MsT065结合，而先与MsT065结合，对再次结合MsT001的影响则较小。MsT229可与MsT001-Bio抗体配对；与MsT065-Bio配对检测OD450值较低，考虑其对MsT065-Bio抗体的结合存在干扰；与MsT286-Bio不能配对，考虑二者结合同一抗原表位。MsT286可与MsT001-Bio、MsT065-Bio抗体配对；与MsT229-Bio抗体不能配对，再一次说明二者结合表位相同。
表3.Tim3抗体配对情况
+++(OD450>2.0)；+(0.12<OD450<0.5)；-(OD450<0.1)
(2)ForteBio Octet分子相互作用仪鉴定Tim3抗体结合Tim3蛋白表位
通过ForteBio Octet分子相互作用仪鉴定Tim3抗体结合Tim3蛋白的表位特征。Tim3-hFc重组蛋白作为检测用抗原，应用FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器。
抗体结合表位鉴定流程：FORTEBIO抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器在平衡液中(0.1％BSA+0.02％Tween20的PBS溶液)预湿10分钟。一组AHC生物传感器(4个)在平衡液中反应60s，与5μg/ml的Tim3-hFc重组蛋白结合反应100s，平衡液中平衡120s，结合5μg/ml的MsT001抗体(或MsT065、MsT229、MsT286)300s，达到饱和状态，再与四个抗体(5μg/ml)分别反应180s。ForteBio Octet分析软件对抗体结合表位特征进行分析。
抗体表位特征鉴定结果(图10)：AHC生物传感器固化的Tim3-hFc蛋白结合检测Tim3抗体(MsT001、MsT065、MsT229或MsT286)达到饱和后，再分别与4个Tim3抗体结反应，分析抗体结合抗原表位特征。结果部分显示的将检测抗体饱和时记为零点的后续反应曲线特征。MsT001和MsT065抗体结合Tim3抗原表位不完全相同，二者的抗原结合表位可能存在部分交叠或二者结合抗原后存在空间位阻干扰，MsT001结合Tim3蛋白后，MsT065不能与之结合；而MsT065与Tim3结合后，MsT001仍可与Tim3蛋白结合；二者与MsT229和MsT286抗体结合表位不同。MsT229和MsT286抗体结合Tim3蛋白表位相同，一个抗体与Tim3蛋白结合后，另一个抗体不能再结合。
(3)夹心ELISA测定Tim3配对抗体检测Tim3蛋白敏感性
检测流程：夹心ELISA对上述配对抗体检测的敏感性进行鉴定。检测用Tim-His重组蛋白进行10倍梯度稀释(1000-0.001ng/ml)。其余步骤同上述夹心ELISA流程。
夹心ELISA测定Tim3配对抗体检测Tim3蛋白敏感性(图11，表4)：MsT001与自身MsT001-Bio配对检测敏感性低(10ng/ml)，与MsT229-Bio和MsT286-Bio配对检测敏感性最高(0.01ng/ml)。MsT065与其他抗体配对敏感性均为1.0ng/ml。MsT229和MsT286分别与MsT001-Bio配对，敏感性为0.1ng/ml。MsT229和MsT286分别与MsT065-Bio配对，敏感性为10ng/ml。总而言之，MsT001与MsT229-Bio或MsT286-Bio配对具有最高检测敏感性。
表4.Tim3配对抗体检测敏感性(ng/ml)
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院；北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> 抗人Tim3抗体或其功能性片段及其应用
<130> PA20023125
<160> 40
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Tyr Leu Ile His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 1015
Gly
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp His Leu Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Arg Lys Phe Lys
1 5 1015
Gly
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Leu Ile Asn Pro Gln Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Arg
1 5 1015
Gly
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Arg Gly Phe Asp Ser Pro Gly Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 1015
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Met
202530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
354045
Thr Asp Tyr Leu Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
505560
Val Trp Ile Gly Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn
65707580
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Glu Ser Ser Arg
859095
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Thr Gly Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 1015
Val Leu Ser Gln Val Gln Ile Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Met
202530
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
354045
Thr Asp His Leu Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
505560
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn
65707580
Arg Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Arg
859095
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 11
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 1015
Val Leu Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
202530
Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
354045
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Asn Leu
505560
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gln Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn
65707580
Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn
859095
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Phe Asp Ser Pro Gly Phe Pro Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 12
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 1015
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
202530
Pro Gly Ala Ser Met Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
354045
Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Asn Leu
505560
Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Gln Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn
65707580
Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn
859095
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Phe Asp Ser Pro Gly Phe Pro Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 13
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 1015
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
202530
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
354045
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
505560
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65707580
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
859095
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 1015
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Arg Ser Ser Gln Asn Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 1015
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 1015
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 1015
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
202530
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
354045
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
505560
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser
65707580
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
859095
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys
130
<210> 27
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 1015
Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
202530
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Leu
354045
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
505560
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65707580
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
859095
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Met Lys
130
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 1015
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala
202530
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
354045
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
505560
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65707580
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
859095
Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr
100 105 110
Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 29
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 1015
Val His Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val
202530
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val
354045
Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
505560
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly
65707580
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
859095
Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys
130
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 1015
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
202530
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
354045
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
505560
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65707580
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
859095
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 31
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtgag 60
gttcagctgc agcagtctgg ggctgaggtt gtgatgcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgcaagactt ctggctacac attcactgac tacttgatac actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgtatggat cggagcgatt gatacttctg atagttatgc tagctacaat 240
caaaagttca agggcaaggc cacattgact ttagacgaat cctccaggac agcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtacagg agagggtctg 360
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctca 399
<210> 32
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtcag 60
gtccagatac agcagtctgg ggctgagctt gtgatgcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggctacac attcactgac cacttgatgc actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat cggagcgatt gatacttctg atagttatgc tagctacaat 240
cgaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacgagt cctccaggac agcctacatg 300
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcagg agagggtctg 360
gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctca 399
<210> 33
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtgag 60
attcagttgg tgcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gagcttcaat gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaccatga actgggtgaa gcagagccat 180
ggacagaacc ttgagtggat tggacttatt aatcctcaga ctggaggcac ttcctacaac 240
cagaatttca ggggcaaggc cacattaact gtagacaagt catccaacac agcctacatg 300
gagctcctca gtctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agaaaggggg 360
tttgattcac ccgggtttcc ttactggggc caaggaactc tggtcactgt ctctgca 417
<210> 34
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtcag 60
gttcagctgc aacagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gagcttcaat gaagatgtcc 120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaccatga actgggtgaa gcagagccat 180
ggacagaacc ttgagtggat tggacttatt aatcctcaga ctggaggcac ttcctacaac 240
cagaatttca ggggcaaggc cacattaact gtagacaagt catccaacac agcctacatg 300
gagctcctca gtctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agaaaggggg 360
tttgattcac ccgggtttcc ttactggggc caaggaactc tggtcactgt ctctgca 417
<210> 35
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aataa 975
<210> 36
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60
atccagatga ctcaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt aaattggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccta ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttcctccg 360
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396
<210> 37
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60
gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
tcttgcagat ctagtcagaa ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgctc 360
acgttcggtg ctggcaccaa gctggaaatg aaa 393
<210> 38
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60
atccagatga ctcagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 120
agttgcaggg caagtcagga cattagcaat tatttaaact ggtatcagca gaaaccagat 180
ggaactgtta aactcctgat ctactacaca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 240
ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 300
gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgctcacgtt cggtgctggg 360
accaagctgg agctgaaa 378
<210> 39
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60
attgtgctaa cccaatctcc agcttctttg gctgtgtctc tagggcagag ggccaccatc 120
tcctgcaagg ccagccaaag tgttgattat gatggtgata gttatatgaa ctggtaccaa 180
cagaaaccag gacagccacc caaactcctc atctatgctg catccaatct agaatctggg 240
atcccagcca ggtttagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 300
gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaaa gtaatgagga tccgtacacg 360
ttcggagggg ggacaaagct ggaaataaaa 390
<210> 40
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttaa 324
