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特征肽段、检测方法及试剂盒

2023-03-19 02:29:31

特征肽段、检测方法及试剂盒

　　技术领域

　　本发明涉及蛋白质检测技术领域。更具体地说，本发明涉及载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J定量检测相关的特征肽段、检测方法及试剂盒。

　　背景技术

　　脂蛋白中蛋白部分称为载脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)，载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要生理功能。载脂蛋白的主要功能有：①维持脂蛋白的结构与脂类运输；②调控脂代谢有关酶的活性；③作为细胞表面脂蛋白受体的配体而参与脂蛋白的代谢。载脂蛋白一般分为载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E和载脂蛋白J等，每种又分为若干亚型。载脂蛋白A(Apolipoprotein A，ApoA)是构成血浆高密度脂蛋白的重要组分，具有清除组织脂质和抗动脉粥样硬化的作用。载脂蛋白A-Ⅱ(ApoAⅡ)是载脂蛋白A家族中最重要的组分之一。ApoAⅡ可以水解乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯，其血清浓度与发生冠心病的危险性呈负相关。载脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，与许多眼科疾病发病有关，对ApoE及其基因多态性的研究是目前医学研究的热点之一，探讨两者之间的内在联系，对眼病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用价值。ApoE主要存在于CM、VLDL、中密度脂蛋白(IDL)和部分高密度脂蛋白(HDL)中，Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。载脂蛋白J(Apolipoprotein J，ApoJ)是HDL和VHDL相结合的糖蛋白，它是一种分子量约为70KD的二聚体蛋白质。广泛分布于人体各种组织，除了负责运输脂质外，还参与补体功能调节、精子成熟、膜再循环等生理过程以及与某些疾病的发病有关。

　　传统的大分子蛋白类化合物定量研究多采用等电聚焦电泳、双向凝胶电泳、免疫印迹等方法进行测定，对于含量较低的蛋白类化合物酶联免疫吸附方法(enzyme-linkedimmunosorbent assays，ELISA)和放射性免疫标记方法(radioimmunoassay,RIA)具有其独特优势。其中ELISA因其较高灵敏度和适合批量测定等优点，已成为最为常用的蛋白多肽类化合物生物样品分析方法。但传统的免疫方法存在开发周期长、成本高，存在蛋白交叉反应等缺陷。

　　发明内容

　　本发明的一个目的是提供一种特征肽段、检测方法及试剂盒，利用特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物，实现同时、定量检测血浆或血清中载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

　　为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了特征肽段，至少包括氨基酸序列分别为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段。

　　根据本发明的另一个方面，本发明提供了检测方法，包括在同时检测载脂蛋白A、载脂蛋白E以及载脂蛋白J时，将与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物。

　　进一步地，所述的检测方法，包括：

　　配制同位素标记肽段内标液；

　　利用替代基质配制所述特征肽段的校正标样；

　　取待测样品，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液、胰蛋白酶进行处理，加入同位素标记肽段内标液，上柱，洗脱，氮气吹干或冷冻干噪，复溶，得待测样品溶液；

　　取所述校正标样，加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，建立以峰面积之比和浓度为坐标的标准曲线；

　　将所述待测样品溶液用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

　　进一步地，所述的检测方法，还包括：

　　利用替代基质配制所述特征肽段的质控样品，向质控样品中加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算质控样品回收率值。

　　进一步地，所述的检测方法，所述替代基质的制备方法包括：

　　取牛清白蛋白，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液和胰蛋白酶进行处理，上柱，洗脱，氮气吹干或冷冻干噪，复溶，得替代基质。

　　进一步地，所述的检测方法，液相色谱质谱联用仪器为LC-MS/MS；

　　质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，扫描方式为多重反应监测。

　　进一步地，所述的检测方法，多重反应监测的参数包括：

　　其中，VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK*、TLLSNLEEAK*、LGPLVEQGR*、AATVGSLAGQPLQER*、LQAEAFQAR*、QGLLPVLESFK*、LSPLGEEMR*分别表示特征肽段VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK、TLLSNLEEAK、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR的对应的同位素标记肽段。

　　色谱条件包括：色谱柱为Phenomenex Aeris WIDEPORE 3.6μm XB-C18，150×2.1mm；流动相为0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱；柱温为40℃；进样量为10μL。

　　根据本发明的又一个方面，本发明提供了试剂盒，包括：

　　内标液，其由与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段配制得到；

　　校正标样，其由替代基质和所述特征肽段配制得到；

　　二硫苏糖醇溶液和碘乙酰胺溶液，用于处理待测样品。

　　进一步地，所述的试剂盒，还包括：

　　质控样品，其由替代基质和所述特征肽段配制得到，所述质控样品至少包括高、中、低三种不同浓度。

　　进一步地，所述的试剂盒，还包括：

　　缓冲液1和缓冲液2，缓冲液1由碳酸氢铵、尿素和水配制而成，缓冲液2由碳酸氢铵和水配制而成。

　　本发明至少包括以下有益效果：

　　本发明将氨基酸序列为QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK的肽段作为特征肽段，利用特征肽段配制校正标液，利用特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物，借助液相色谱质谱联用仪器，能够实现同时、定量检测血浆或血清中载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

　　本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

　　附图说明

　　图1为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的检测流程图；

　　图2为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的特征肽段和同位素内标[M+H]+的二级全扫描质谱图；

　　图3为载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J特征肽段和同位素内标的典型提取离子流色谱图；

　　图4为载脂蛋白E、载脂蛋白J特征肽段的典型标准曲线图；

　　图5为载脂蛋白A的一个特征肽段的典型标准曲线图；

　　图6为载脂蛋白A的另一个特征肽段的典型标准曲线图。

　　具体实施方式

　　下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

　　近年来，液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)得到不断完善和发展，LC-MS/MS能够同时获得可靠的定性和定量结果，特别是以多反应监测(MRM，Multiple ReactionMonitoring)技术为代表的质谱手段，由于可通过两次离子的选择，从而能大大降低背景噪声，提高分析方法的灵敏度和重复性，已经成为蛋白定量的重要手段。同传统的免疫学方法相比，LC-MS/MS方法在准确度、选择性、重现性、灵敏度和定量线性范围等各方面均显示出较大优势。

　　本发明基于液相色谱串联质谱技术的蛋白定量分析方法，首先采取shot-gun蛋白质组学手段对蛋白的特异性肽段进行筛选，然后合成肽段标准品，建立肽段质谱定量分析方法。对于生物样品的前处理过程，优化蛋白还原、变性以及胰酶水解等步骤的条件，以保证方法的精密度和可靠性，最终通过肽段水平的定量实现对生物样品中相应蛋白质浓度水平的分析。本发明的试剂盒以替代基质加入特征肽段标准品为校正标样，以对应的稳定同位素标记肽段为内标，分别用二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)处理，通过胰蛋白酶(Trypsin)进行酶解，再经过固相萃取(SPE)柱处理，氮气吹干或冷冻干噪后，复溶上样进行液相色谱质谱检测。记录载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J特征肽段及内标的峰面积。采用内标法，根据待测样品中特征肽段峰面积/内标峰面积比值即可计算出特征肽段浓度。根据摩尔浓度计算载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

　　一、试剂盒的组成和制备方法：

　　1.载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J特征肽段校正标样和质控样品的配制：

　　1)特征肽段标准品合成：载脂蛋白A(ApoA1)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白J(ApoJ)的特征肽段信息见表1和序列表，合成特征肽段标准品。序列表中SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7的氨基酸序列分别为肽段QGLLPVLESFK、LSPLGEEMR、LGPLVEQGR、AATVGSLAGQPLQER、LQAEAFQAR、VTTVASHTSDSDVPSGVTEVVVK以及TLLSNLEEAK。

　　表1蛋白及特征肽段、稳定同位素标记肽段

　　2)配制特征肽段贮备液：精密称取各特征肽段标准品适量，用含0.1％甲酸(FA)的乙腈-水(v/v＝1:4)溶解至1mg/mL各肽段贮备液，贮备液使用前-70℃以下分装冻存。

　　3)校正标样和质控样品的替代基质制备：100μL 20mg/mL牛血清白蛋白(BSA)Buffer1溶液，加入20μL 1M二硫苏糖醇(DTT)水溶液，加入880μL Buffer 1，置于60℃孵育1h；恢复室温后加入7.4mg碘乙酰胺(IAA)，置于25℃避光40min；加入7mL Buffer2，涡流，加入80μL 1mg/mL胰蛋白酶(Trypsin)，37℃酶解15h；加入100μL FA终止酶解；

　　将样品上样于固相萃取(SPE)柱(型号：Oasis PRiME HLB Cartridge 1cc/30mg100bx；或已活化和平衡的同类SPE柱)，用0.1％三氟乙酸(TFA)洗涤3次，每次1mL；更换洁净的样品收集管，用含0.1％TFA的乙腈-水(v/v＝4:1)溶液洗脱2次，每次1mL；洗脱液于45℃氮气吹干，或冷冻干噪；吹干或冻干样品可长期放置-70℃以下冰箱保存；2.67mL0.1％FA复溶，作为校正标样和质控样品的替代基质。

　　4)配制特征肽段母液：分别精密量取步骤2)中特征肽段贮备液ApoA1 pep1 200μL、ApoA1 pep2 200μL、ApoE pep1 10μL、ApoE pep2 10μL、ApoE pep3 10μL、ApoJ pep1 20μL、ApoJ pep2 5μL，置10mL容量瓶中，加入步骤3)中替代基质并稀释至刻度，制成特征肽段混合母液，对应浓度分别为：20、20、1、1、1、2、0.5μg/mL。母液使用前-70℃以下分装冻存。

　　5)特征肽段校正标样配制：分别精密量取步骤4)中特征肽段母液0、10、20、50、100、200、500、1000μL，分别置10mL容量瓶中，加入步骤3)中替代基质并稀释至刻度，所配制特征肽段校正标样STD0～STD7浓度见表2，分装，贴签标记，完成操作。

　　6)特征肽段质控样品配制：分别精密量取步骤4)中特征肽段母液30、150、800μL，分别置10mL容量瓶中，加入步骤3)中替代基质并稀释至刻度，所配制特征肽段质控样品LQC、MQC、HQC浓度见表2，分装，贴签标记，完成操作。

　　表2特征肽段校正标样和质控样品配制浓度(ng/mL)

　　2.特征肽段同位素内标液的配制：ApoA1、ApoE、ApoJ的特征肽段内位素内标信息见表1，合成特征肽段同位素内标标准品。精密称取各特征肽段同位素内标标准品适量，用含0.1％FA的乙腈-水(v/v＝1:4)溶解至1mg/mL各肽段同位素内标贮备液，贮备液使用前-70℃以下分装冻存。精密量取各肽段同位素内标贮备液100μL，置100mL容量瓶中，用含0.1％FA的水溶解稀释至刻度，配制成1μg/mL混合溶液做内标液。分装，贴签标记，完成操作。

　　3.缓冲液1(Buffer 1)的配制：精密称取碳酸氢铵395.3mg、尿素48g，置100mL容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，配制成含50mM碳酸氢铵、8M尿素的溶液。分装，贴签标记，完成操作。

　　4.缓冲液2(Buffer 2)的配制：精密称取碳酸氢铵395.3mg，置100mL容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，配制成含50mM碳酸氢铵的溶液。分装，贴签标记，完成操作。

　　5.处理液A的配制：精密称取DTT 1542.5mg，置10mL容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，配制成含1M DTT的溶液。分装，贴签标记，完成操作。

　　6.处理液B的配制：精密称取IAA 740mg，置5mL容量瓶中，加水溶解稀释至刻度，配制成含148mg/mL IAA的溶液。分装，贴签标记，完成操作。配制及保存注意避光操作。

　　二、试剂盒使用方法如下：

　　1.校正标样和质控样品：精密量取STD0～STD7校正标样200μL，分别加入内标液20μL，涡流混匀，取上清液进样10μL进行LC-MS/MS定量分析。

　　2.实际样品：精密量取人血浆或血清2μL，加入2μL处理液A，加入96μL Buffer 1，置于60℃孵育1h；恢复室温后加入5μL处理液B，置于25℃避光40min；加入700μL Buffer 2，涡流，加入6μL 1mg/mL Trypsin，37℃酶解15h；加入10μL FA终止酶解，加入20μL内标液涡流；将样品上样于SPE柱(型号：Oasis PRiME HLB Cartridge 1cc/30mg100bx；或已活化和平衡的同类SPE柱)，用0.1％TFA洗涤3次，每次1mL；更换洁净的样品收集管，用含0.1％TFA的乙腈-水(v/v＝4:1)溶液1mL洗脱；洗脱液于45℃氮气吹干，或冷冻干噪；吹干或冻干样品可长期放置-70℃以下冰箱待测；200μL 0.1％FA复溶，取上清液进样10μL进行LC-MS/MS定量分析。

　　三、检测方法：

　　1、适用仪器

　　液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。

　　2、样品要求

　　采集静脉全血样品，置于抗凝、促凝管中，离心分离血浆或血清，分离后应尽快测试或放置于-20℃以下冰箱存放备测。

　　3、检验方法

　　血浆或血清样品前处理：

　　精密量取人血浆或血清2μL，加入2μL处理液A，加入96μL Buffer 1，置于60℃孵育1h；恢复室温后加入5μL处理液B，置于25℃避光40min；加入700μL Buffer 2，涡流，加入6μL1mg/mL Trypsin，37℃酶解15h；加入10μL FA终止酶解，加入20μL内标液涡流；将样品上样于SPE柱(型号：Oasis PRiME HLB Cartridge 1cc/30mg 100bx；或已活化和平衡的同类SPE柱)，用0.1％TFA洗涤3次，每次1mL；更换洁净的样品收集管，用含0.1％TFA的乙腈-水(v/v＝4:1)溶液1mL洗脱；洗脱液于45℃氮气吹干，或冷冻干噪；吹干或冻干样品可长期放置-70℃以下冰箱待测；200μL 0.1％FA复溶，取上清液进样10μL进行LC-MS/MS定量分析。

　　质谱条件：

　　离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压：5500V；温度：580℃；源内气体1(GS1，N2)压力：60psi.；气体2(GS2，N2)压力：60psi.；气帘气体(N2)压力：40psi.；扫描方式为多重反应监测(MRM)，参数见表3；碰撞气(N2)压力：Medium；

　　色谱条件：

　　色谱柱：Phenomenex Aeris WIDEPORE 3.6μm XB-C18，150×2.1mm；

　　流动相：0.1％FA水溶液-0.1％FA乙腈，梯度洗脱，见表4；

　　柱温：40℃；进样量：10μL。

　　表3 MRM定量及定性相关离子质谱参数

　　表4梯度洗脱条件

　　吸取处理好的标准曲线样品、质控样品和待测样品溶液各10μL进行液质联用仪检测，记录色谱图。

　　分析批及质控要求：

　　一个分析批包括空白样品和零浓度样品，包括至少6个浓度水平的校正标样，至少3个浓度水平质控样品(低、中、髙浓度双重样品，或至少测试样品总数的5％，两者中取数目更多者)，以及被分析的试验样品。所有样品(校正标样、质控和试验样品)应按照它们将被分析的顺序，在同一样品批中被处理和提取。一个分析批包括的样品在同一时间处理，由同一分析者相继处理，使用相同的试剂，保持一致的条件。质控样品应该分散到整个批中，以此保证整个分析批的准确度和精密度。

　　校正标样测定回收浓度一般应在标示值的±15％范围内，定量下限应在±20％范围内。不少于6个校正标样，至少75％标样应符合这些标准。如果校正标样中有一个不符合标准，则应该拒绝这个标样，重新计算不含该标样的标准曲线，并进行回归分析。质控样品的准确度值应该在标示值的±15％范围内。至少67％质控样品，且每一浓度水平至少50％样品应符合这-标准。在不满足这些标准的情况下，应该拒绝该分析批，相应的试验样品应该重新提取和分析。

　　4、结果计算：

　　标准曲线绘制：以7个标准曲线样品的标示浓度为横坐标(x)，以标准曲线样品的实测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

　　标准曲线方程的拟合：以7个标准曲线样品的实测峰面积与各自内标峰面积的比值(y)对标示浓度(x)加权最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距，并计算相关系数(r)，r应不低于0.9900。

　　回收率的计算：将质控样品测定的目标化合物峰面积和内标峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算质控样品的浓度。质控样品回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在100±15％范围内。

　　样品结果计算：将样品的目标化合物峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算样品的各肽段浓度，根据摩尔浓度折算载脂蛋白A、载脂蛋白E、载脂蛋白J的浓度。

　　这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明特征肽段的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

　　尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。