基于过氧化物模拟酶活性快速检测葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及的是过氧化物模拟酶及其制备和应用方法，具体涉及一种基于过氧化物模拟酶活性快速检测葡萄糖的方法，属于化学检测分析技术领域，可应用于食品安全和临床检验领域。
背景技术
葡萄糖是生命活动的重要能量物质，其浓度水平是糖尿病诊断的一项重要生化指标。糖尿病是由饮食、遗传等因素共同作用而引起的以糖代谢紊乱为主要症状的慢性病，可引起失明、肾脏病、心脏病及神经损伤等。因此，快速准确检测食品和血液中葡萄糖含量对于糖尿病的治疗和控制有重大意义。
目前国内外快速检测葡萄糖方法目前主要有高效液相色谱法、煮沸滴定法、辣根过氧化物酶法、过氧化物模拟酶法、纳米粒子模拟酶法、固定化酶法等。由于天然酶具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性，是目前检测葡萄糖的主要手段，但同时天然酶也具有稳定性差、易失活、不易制备等缺点，使其在实际应用过程中受限。经过长时间实践发现，上述检测方法存在如下缺陷：①检测使用的天然生物酶价格昂贵，导致生产成本增高；②试剂合成工艺复杂，对检测仪器或设备要求高；③检测工序步骤过多，费时费力，难以快速实施。因此，建立一种快速、低成本、灵敏检测葡萄糖方法十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有葡萄糖检测方法存在的成本高、工艺繁琐、费时费力等缺陷，提出一种原料廉价易得、操作简单、快速高效，偶联过氧化物模拟酶和葡萄糖氧化酶快速检测葡萄糖的方法，可应用于食品安全和临床检验等领域。
本发明的技术解决方案：基于过氧化物模拟酶活性快速检测葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)缓冲液的配制：用HCl调节缓冲液Tris的pH值至合理范围，依次添加适当浓度的NaCl、KCl，最后添加Triton X-100表面活性剂；
(2)底物ABTS溶液的制备：用步骤(1)中的缓冲液配制ABTS物质的量浓度为10mmol/L的底物ABTS溶液，在2～6℃下置于棕色玻璃瓶中保存备用；
(3)葡萄糖溶液标准系列的配制：葡萄糖固体先用纯水稀释至物质的量浓度为10mmol/L，再用步骤(1)中的缓冲溶液将其按浓度梯度稀释至所需浓度，临用现配；
(4)葡萄糖氧化酶溶液的配制：用步骤(1)中的缓冲液配制所需浓度的葡萄糖氧化酶溶液，临用现配；
(5)快速筛查葡萄糖：在常温常压下吸取适量待测溶液和葡萄糖氧化酶溶液，置于比色皿、试管、离心管或酶标板微孔中混合，反应10min后，依次加入适量过氧化物模拟酶和底物ABTS溶液，以手摇或仪器涡旋等方式进行反应，反应5min后，通过肉眼观察溶液是否从无色变成绿色，若显色，则快速定性存在葡萄糖；
(6)半定量分析葡萄糖：在常温常压下吸取适量不同浓度梯度的葡萄糖溶液和葡萄糖氧化酶溶液，依次置于比色皿、试管、离心管或酶标板微孔中混合，作为半定量样品，反应10min后，依次加入适量过氧化物模拟酶和底物ABTS溶液，以手摇或仪器涡旋等方式进行反应，反应10min后，筛选颜色变化明显的相应半定量样品，以其溶液颜色制作标准色阶卡，通过比较标准色阶卡颜色的深浅，快速判断样品中葡萄糖含量。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中测定葡萄糖的反应时间为15～20min。
进一步的，所述步骤(4)和(5)中的过氧化物模拟酶由分子内平行型G4-DNA与氯化血红素通过π-π堆积作用自组装形成。该过氧化物模拟酶的制备方法包括以下步骤：
①分子内平行型G4-DNA溶液的配制：将G4-DNA用缓冲液溶解，并在90～100℃下加热5～15min，加热结束后迅速在冰上冷却至室温，在2～6℃下静置过夜得到G4-DNA溶液，备用；
②氯化血红素溶液的配制：取物质的量浓度为10mmol/L的氯化血红素储备液，用二甲基亚砜溶解得氯化血红素工作液，于-15～-25℃保存，将氯化血红素工作液用缓冲液稀释成氯化血红素溶液，备用；
③过氧化物模拟酶的建立：将步骤①中的G4-DNA溶液与步骤②中的氯化血红素溶液等体积混合，在室温下孵育，得过氧化物模拟酶。
进一步的，所述步骤①中最终制备的G4-DNA溶液的物质的量浓度为1～10.0μmol/L，G4-DNA的序列包括5’-(XnG3)4Xn-3’，其核心结构为5’-(XnG3)4-3’，其中X表示A、T、G、C任意核酸碱基，n为1～3的自然数。
进一步的，所述步骤②中最终制备的氯化血红素溶液的物质的量浓度为2～20.0μmol/L。
进一步的，所述步骤①和②中的缓冲液每1L中各组分含量如下：Tris/HCl5～50mmol、NaCl 50～200mmol、KCl 5～50mmol、Triton X-100 50～300μL；其中Tris/HCl的pH值为5.0～9.0。
进一步的，所述步骤③中的孵育时间为1～2h，最终制备的过氧化物模拟酶的物质的量浓度为1～10.0μmol/L。
本发明的优点：
1)构建了一种由G4-DNA与氯化血红素通过π-π堆积作用自组装形成，能与葡萄糖氧化酶偶联，且能应用于葡萄糖快速检测的过氧化物模拟酶，适合大规模食品生产检测和临床检验等环节使用；
2)制备过氧化物模拟酶的原料之一G4-DNA可通过化学合成大量获得，过氧化物模拟酶的构建成本较低，检测结果稳定性和重复性良好；
3)利用过氧化物模拟酶活性测定葡萄糖的方法，在常温常压下即可进行，反应时间仅需15～20min，无需复杂的仪器设备，可肉眼快速定性分析，也可通过比较标准色阶卡半定量分析，可以推广应用到食品安全和临床检验等各种领域中的葡萄糖快速分析，应用前景广阔。
附图说明
附图1是本发明制备的过氧化物模拟酶的结构示意图。
附图2是本发明制备的过氧化物模拟酶半定量分析葡萄糖标准色阶图。
附图3是本发明制备的过氧化物模拟酶快速筛查和半定量分析苹果中葡萄糖的检测结果图。
附图4是本发明制备的过氧化物模拟酶快速筛查和半定量分析人血清中葡萄糖的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的技术方案，以下列举的各项实施例仅用于说明本发明采用的具体技术方法和操作步骤，而不能理解为对本发明的限制。
重复的富含G碱基的结构单元的DNA片段能形成堆积的G-四链体结构(G4)，分子内平行G4结构VEGF片段与氯化血红素自组装成过氧化物模拟酶，将其与葡萄糖氧化酶偶合成双酶体系，葡萄糖氧化酶可催化样品中葡萄糖生成过氧化氢，过氧化物模拟酶可进一步催化生成的过氧化氢与ABTS底物产生颜色变化，即样品中葡萄糖浓度与最终反应后溶液颜色成正比。
以下各实施例中使用的缓冲液及参数如下：20mmol/LpH 7.0Tris/HCl，100mmol/LNaCl，20mmol/L KCl，0.03％Triton X-100。实施例中使用分子内平行结构G4-DNA/氯化血红素构建过氧化物模拟酶，其结构如图1所示。过氧化物模拟酶的具体制备步骤如下：
①取VEGF序列为5’-(G3C)2CG5CG3-3’的G4-DNA，用缓冲液溶解，并在95℃下加热10min，加热结束后迅速在冰上迅速冷却至室温，在4℃下静置过夜得到VEGF溶液；
②取物质的量浓度为10mmol/L的氯化血红素储备液，用二甲基亚砜(DMSO)溶解得氯化血红素工作液，-20℃保存备用，将氯化血红素工作液用缓冲液稀释备用；
③将本实施例步骤①中的VEGF溶液与步骤②中的氯化血红素溶液等体积混合，确保VEGF终浓度为5.0μmol/L，氯化血红素终浓度为10.0μmol/L，室温孵育1h，制备VEGF/氯化血红素过氧化物模拟酶。
实施例1
苹果中葡萄糖的快速检测方法，具体包括如下步骤：
(1)底物ABTS溶液制备：用缓冲液配制得物质的量浓度为10mmol/L的底物ABTS溶液，在2～6℃下置于棕色玻璃瓶中保存备用；
(2)葡萄糖溶液标准配制：先用缓冲液配制物质的量浓度为10mmol/L葡萄糖溶液，再将其依次稀释至0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.5mmol/L的浓度梯度溶液，临用现配。
(3)葡萄糖氧化酶配置：用缓冲液配制浓度为23.8U/mL葡萄糖氧化酶溶液，临用现配；
(4)葡萄糖定性筛查：在常温常压下吸取50μL待测样品溶液和50μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶标板微孔中，反应10min后，依次加入50μL物质的量浓度为5μmol/L的VEGF/氯化血红素过氧化物模拟酶和50μL物质的量浓度为10mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，手轻微平移摇动混匀进行反应，5min后通过肉眼观察溶液的从无色变成绿色，即可快速定性存在葡萄糖。
(5)葡萄糖半定量分析：在常温常压下依次吸取50μL步骤(2)中配制的不同浓度梯度葡萄糖溶液，并分别和50μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶标板微孔中，反应10min后，依次加入50μL物质的量浓度为5μmol/L的VEGF/氯化血红素过氧化物模拟酶和50μL物质的量浓度为10mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，手轻微平移摇动混匀进行反应，10min后将各反应后的溶液按浓度梯度排列，将其溶液颜色和对应的葡萄糖浓度制作标准比色卡的色阶，作为葡萄糖的半定量分析依据，如图2所示；
(6)苹果中葡萄糖的快速检测：称取粉碎均匀的苹果试样1g(精确到0.01g)，加50mL缓冲液充分摇匀，静置5min后，取50μL上清液按照上述步骤(4)和(5)进行定性筛查和半定量分析；其检测结果如图3所示，该苹果中存在一定量的葡萄糖，且溶液葡萄糖浓度大约为2.5mmol/L，经计算得苹果试样中的葡萄糖含量约为2.25％，与文献报道的苹果中葡萄糖含量2.5％～3.5％接近。
实施例2
人血清中葡萄糖的快速检测方法，具体包括如下步骤：
(1)底物ABTS溶液制备：同实施例1。
(2)葡萄糖标准溶液的配制：同实施例1。
(3)葡萄糖氧化酶配制：同实施例1。
(4)葡萄糖定性筛查：同实施例1。
(5)葡萄糖半定量分析：同实施例1。
(6)人血清中葡萄糖的快速检测：在100μL原始血清中加入1.0mL三氯乙酸(0.6mol/L)沉淀蛋白质，在10000rpm下离心后，将上清液移至5mL容量瓶，用缓冲液定容，取50μL上清液按照上述步骤(4)和(5)进行定性筛查和半定量分析；其检测结果如图4所示，该人血清样品中存在一定的葡萄糖，且葡萄糖溶液浓度大约为1.0mmol/L，经计算得原始血清葡萄糖含量约为5.0mmol/L，属于正常血糖浓度范围。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
