一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法
技术领域
本发明涉及一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法。
背景技术
小肠作为人体最大的营养物质吸收器官，肠道层面的营养物质感受、吸收、转运日益受到关注。目前用于小肠营养物感受、转运、吸收功能评价体外模型主要分为两类：一类是以肠道组织为基础的模型，主要以尤斯灌流系统为主；一类是以肿瘤细胞系为基础的模型，主要以Caco-2或Caco-2与HT29联合培养结合跨膜分析技术(Transwell)可以产生极化上皮层，用于体外上皮细胞反应研究。但是上述肠道功能体外研究模型均存在一定缺陷，基于肿瘤细胞系的模型细胞种类单一，无法真实再现肠道多细胞组成特征，缺乏细胞与细胞之间相互作用，容易造成吸收评价的过度评估；而以肠道组织基础上的模型，存在技术要求高、动物使用量大、实验重复性和稳定性相对较差、体外测试时间有限问题。肠道干细胞的发现及体外3D培养技术的建立为上述问题的解决提供了新的思路，但是现有的以肠道干细胞为基础体外培养的肠道类器官，细胞顶端位于3D结构内测，上述特点大大限制了该模型在营养物质吸收、转运评价层面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法。该方法区别于现有技术，将含有肠道干细胞的肠道隐窝与其滋养细胞肌成纤维细胞接种于Transwell嵌套不同表面共培养快速形成了体外肠道单层培养模型，进一步地，此方法获得的肠道单层培养模型具有体内肠道上皮相似结构特征、细胞组成和渗透性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养，包括以下几个步骤：
步骤一、肠道隐窝结构分离：收集8周大ICR小鼠小肠7-8cm，使用含冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的10ml注射器清洗至清洗液中无肉眼可见残渣；将肠道沿纵轴剖开放入冰上放置的含无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的100mm培养皿1中，使用眼科剪将肠道剪成0.5-1cm的肠段，将剪好肠段转移至含有10ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的15ml离心管1中，将离心管1上下颠倒10-20次，随后静置至肠段沉于离心管1底部后去除上清，按照上述方法反复清洗3次去除上清；将清洗的组织转移至含有20ml浓度为5mM的乙二胺四乙酸溶液的50ml离心管2中；将50ml离心管2置于37℃气浴摇床250rpm转速振荡10分钟进行消化；消化结束后将离心管2中乙二胺四乙酸溶液去除，加入冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液清洗肠道组织一次后去除溶液，向离心管2中加入10ml新的磷酸盐缓冲液手动上下振荡离心管2，静置至肠段沉于离心管2底部后去除离心管2中上清，再向离心管2中加入20ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液，手动用力振荡离心管2 40-50次，同样静置后将上清通过100微米孔径细胞筛转移至新的50ml离心管3中；离心管3以20g转速在4摄氏度下离心10分钟，离心结束后去除离心管3中上清，向离心管3中加入1ml培养基1，随后置于冰上备用；
步骤二、复合凝胶处理Transwell嵌套：按照体积比1:30的比例将复合凝胶和冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液稀释到1.5ml离心管4中，置于冰上备用；向含有Transwell的嵌套的24培养板1中嵌套的上表面加入100微升离心管4中稀释液，随后将培养板1放入37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h，孵育结束后去除培养板1嵌套上表面溶液备用；
步骤三、肌成纤维细胞细胞接种：将复合凝胶处理好的Transwell嵌套从培养板1转移至6孔培养板2中，Transwell嵌套翻转倒置，嵌套下表面朝上，随后将100微升浓度为每毫升105个细胞的细胞悬液接种于培养板2中的嵌套下表面，将培养板2置于37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h；孵育结束后将Transwell嵌套重新正置转移至新的24孔培养板3中，然后向嵌套下室加入500毫升培养基2，备用；
步骤四、肠道上皮体外单培养：取步骤一中获得的含有肠道隐窝的离心管3中溶液200微升，接种于步骤三中接种过肌成纤维细胞的培养板3中的嵌套的上室中，随后将培养板3置于37℃二氧化碳培养箱中培养，培养过程中每天更换一次Transwell嵌套上、下室的培养基1和2。
其中，步骤一、四中培养基1由50％体积比例的Wint3a条件培养基、5％体积比例的R-spondin条件培养基、DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、表皮生长因子、神经元细胞培养补充剂N2和B27、烟酰胺、Rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂Y27632组成。
步骤二中复合凝胶由粘连蛋白和胶原蛋白I组成。
步骤三、四中所述培养基2由DMEM高糖培养基、非必须氨基酸溶液、青霉素、链霉素组成。
本发明还提供了一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层表征方法，包括以下几个步骤：
步骤一、肠道上皮体外单层培养物跨膜电阻测定：使用电阻仪每天定时记录权利要求1中步骤4中培养板3中Transwell嵌套上、下室之间跨膜电阻值，跨膜电阻值计算公式为：
跨膜电阻值＝(含肠道单层培养物电阻仪数值-无肠道单层培养物对照电阻仪数值)×膜有效面积；
步骤二、肠道上皮体外单层培养物免疫组化：权利要求1步骤四中培养板3中Transwell嵌套上培养到第4天肠道上皮，将嵌套聚碳酸脂膜用解剖刀从Transwell嵌套上分离，并在膜的左上角做好标记，用于区分聚碳酸脂膜上下表面，随后将膜迅速放入含有2ml浓度为4％的多聚甲醛溶液的15毫升离心管5中固定15分钟；去除离心管5中多聚甲醛溶液，随后免疫组化专用磷酸盐缓冲液清洗膜三次，每次5分钟；清洗结束后向离心管5中加入1ml含待检测一抗的封闭液，4℃冰箱静置放置12小时；随后磷酸盐缓冲液重复清洗3次，每次5分钟，清洗完毕后加入与一抗来源相对应二抗，室温24℃条件下静置孵育30分钟；孵育后磷酸盐缓冲液重复清洗4次，每次5分钟；清洗后加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐溶液室温静置5分钟，超纯水重复清洗两次，每次5分钟；最后将嵌套聚碳酸脂膜转移至载玻片上，膜上表面在上，加入封片液后盖玻片封片获得肠道上皮单层培养无封片；使用激光共聚焦显微镜对封片进行观察，获取免疫组化图像；
步骤三、肠道上皮体外单层培养物电镜分析：将权利要求1步骤四中培养板3中含有培养到第4-5天肠道上皮单层培养物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜，用解剖刀从Transwell嵌套上分离后平均分成两份，并在膜的左上角标记用于区分上、下表面；将分离的嵌套膜分别放于含有1ml戊二醛的1.5毫升离心管6和7中，4℃条件下过夜；去除固定液，使用浓度为0.1M(pH7.0)磷酸盐缓冲液清洗样品3次，每次15分钟，清洗结束后加入1％锇酸溶液固定样品1-2h；再次清洗样品3次，后用30％，50％，70％，80％，90％和95％六种浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理一次，20min，最后，再换新的100％乙醇，样品放置在100％乙醇备用；随后离心管6中样品经过干燥、镀膜处理后使用扫面电镜观察肠道单层培养物表面特征；离心管7中样品经过Spurr包埋剂和丙酮混合液及纯包埋剂70℃条件下过夜处理后，使用切片机获得厚度70-90纳米肠道上皮单层切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10后，透射电镜观察获得图像；
步骤四、肠道上皮体外单层培养通透性分析：异硫氰酸酯标记分子量为4.4kDa葡聚糖作为示踪剂检测肠道单层培养通透性，使用不含粉红的DMEM培养基清洗权利要求1步骤四培养板3中含有培养到第4-5天肠道上皮单层培养物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜；然后转移至新的多孔培养板4中，向嵌套的上室中加入200微升浓度为5毫克每毫升的葡聚糖溶液，下室中加入600微升不含粉红DMEM溶液，培养板4整个过程中置于37℃条件下，并且分别于固定时间点从下室中使用移液枪采集100微升分析样品至新的离心管8中，并用相应体积不含酚红DMEM培养基补全溶液；随后使用酶标仪在495nm激发和520nm发射波长下测量离心管8样品中的荧光，并通过预先建立的已知浓度的校准曲线进行定量计算，计算公式为：
葡聚糖的跨膜转运量＝嵌套下室葡聚糖量/嵌套上层初始葡聚糖量×100％。
本发明具有以下优点及有益效果：
相比于现有的技术方法，本发明提供的方法具有以下几个显著的优点和进步：
1.本发明的技术方法，改进了现有肠道隐窝分离方法，缩短了肠道隐窝消化溶液暴露时间，有助于提高肠道干细胞活性，能够保证体外小肠单层培养顺利完成。
2.本发明的技术方法通过将含肠道干细胞肠道隐窝与肌成纤维细胞共培养，通过肌成纤维细胞与肠道上皮细胞相互作用，克服了现有技术中肠道上皮单层形成速度慢、肠上皮跨膜电阻低问题。
3.本发明的技术方法，还优化了肠道体外单层培养模型的体外鉴定方法，能够明确肠道体外单层培养模型体外应用的可靠性。
附图说明
图1是肠道体外单层培养模型的跨膜电阻(A)、通透性(B)、免疫组化(C)及电镜鉴定图(D和E)。
具体实施例
本发明公开了一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
为更好地阐述本发明，下面通过实施例来说明。
实施例1：
步骤一、肠道隐窝结构分离：收集8周大ICR小鼠小肠7-8cm，使用含冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的10ml注射器清洗至清洗液中无肉眼可见残渣；将肠道沿纵轴剖开放入冰上放置的含无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的100mm培养皿1中，使用眼科剪将肠道剪成0.5-1cm的肠段，将剪好肠段转移至含有10ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的15ml离心管1中，将离心管1上下颠倒10-20次，随后静置至肠段沉于离心管1底部后去除上清，按照上述方法反复清洗3次去除上清；将清洗的组织转移至含有20ml浓度为5mM的乙二胺四乙酸溶液的50ml离心管2中；将50ml离心管2置于37℃气浴摇床250rpm转速振荡10分钟进行消化；消化结束后将离心管2中乙二胺四乙酸溶液去除，加入冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液清洗肠道组织一次后去除溶液，向离心管2中加入10ml新的磷酸盐缓冲液手动上下振荡离心管2，静置至肠段沉于离心管2底部后去除离心管2中上清，再向离心管2中加入20ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液，手动用力振荡离心管2 40-50次，同样静置后将上清通过100微米孔径细胞筛转移至新的50ml离心管3中；离心管3以20g转速在4摄氏度下离心10分钟，离心结束后去除离心管3中上清，向离心管3中加入1ml培养基1，随后置于冰上备用。
步骤二、复合凝胶处理Transwell嵌套：按照体积比1:30的比例将复合凝胶和冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液稀释到1.5ml离心管4中，置于冰上备用；向含有Transwell的嵌套的24培养板1中嵌套的上表面加入100微升离心管4中稀释液，随后将培养板1放入37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h，孵育结束后去除培养板1嵌套上表面溶液备用。
步骤三、肌成纤维细胞细胞接种：将复合凝胶处理好的Transwell嵌套从培养板1转移至6孔培养板2中，Transwell嵌套翻转倒置，嵌套下表面朝上，随后将100微升浓度为每毫升105个细胞的细胞悬液接种于培养板2中的嵌套下表面，将培养板2置于37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h；孵育结束后将Transwell嵌套重新正置转移至新的24孔培养板3中，然后向嵌套下室加入500毫升培养基2，备用。
步骤四、肠道上皮体外单培养：取步骤一中获得的含有肠道隐窝的离心管3中溶液200微升，接种于步骤三中接种过肌成纤维细胞的培养板3中的嵌套的上室中；随后将培养板3置于37℃二氧化碳培养箱中培养。培养过程中每天更换一次Transwell嵌套上、下室培养基1和2。
步骤五、肠道上皮体外单层培养物跨膜电阻测定：使用电阻仪每天定时记录权利要求步骤4中培养板3中Transwell嵌套上、下室之间跨膜电阻值。跨膜电阻值计算公式为：
跨膜电阻值＝(含肠道单层培养物电阻仪数值-无肠道单层培养物对照电阻仪数值)×膜有效面积。
图1A是，以空肠隐窝和皮下肌成纤维细胞为基础体外共培养过程中跨膜电阻测定结果，从图中可以看出随着培养时间的增加，肠道上皮体外单层培养跨膜电阻逐渐增加，培养第三天跨膜电阻基本达到体内小鼠肠道上皮跨膜电阻值范围40-100Ωcm2，随后培养第四天电阻值继续上升进入电阻值稳定期，结果证明培养第四天后组成肠道体外培养物的细胞之间形成稳定的紧密连接，功能成熟可以用后续功能分析。
步骤六、权利要求1步骤四中培养板3中Transwell嵌套上培养到第4天肠道上皮，将嵌套聚碳酸脂膜用解剖刀从Transwell嵌套上分离，并在膜的左上角做好标记，用于区分聚碳酸脂膜上下表面，随后将膜迅速放入含有2ml浓度为4％的多聚甲醛溶液的15毫升离心管5中固定15分钟；去除离心管5中多聚甲醛溶液，随后免疫组化专用磷酸盐缓冲液清洗膜三次，每次5分钟；清洗结束后向离心管5中加入1ml含待检测一抗的封闭液，4℃冰箱静置放置12小时；随后磷酸盐缓冲液重复清洗3次，每次5分钟，清洗完毕后加入与一抗来源相对应二抗，室温24℃条件下静置孵育30分钟；孵育后磷酸盐缓冲液重复清洗4次，每次5分钟；清洗后加入2-(4-脒基苯基)-6-吲哚脒二盐酸盐溶液室温静置5分钟，超纯水重复清洗两次，每次5分钟；最后将嵌套聚碳酸脂膜转移至载玻片上，膜上表面在上，加入封片液后盖玻片封片获得肠道上皮单层培养无封片；使用激光共聚焦显微镜对封片进行观察，获取免疫组化图像。
图1C是肠道上皮单层培养物免疫组化结果，使用ZO-1作为肠道上皮细胞之间形成紧密连接标志蛋白，图中细胞与细胞之间的白色明亮线状结构(如图中各剪头所指)为紧密连接蛋白ZO-1阳性信号，表明培养四天体外肠道单层培养形成维持肠道粘膜上皮机械屏障和通透性的结构基础。
步骤七、肠道上皮体外单层培养物电镜分析：将步骤四中培养板3中含有培养到第4-5天肠道上皮单层培养物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜，用解剖刀从Transwell嵌套上分离后平均分成两份，并在膜的左上角标记用于区分上、下表面；将分离的嵌套膜分别放于含有1ml戊二醛的1.5毫升离心管6和7中，4℃条件下过夜；去除固定液，使用浓度为0.1M(pH7.0)磷酸盐缓冲液清洗样品3次，每次15分钟，清洗结束后加入1％锇酸溶液固定样品1-2h；再次清洗样品3次，后用30％，50％，70％，80％，90％和95％六种浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理一次，20min，最后，再换新的100％乙醇，样品放置在100％乙醇备用；随后离心管6中样品经过干燥、镀膜处理后使用扫面电镜观察肠道单层培养物表面特征；离心管7中样品经过Spurr包埋剂和丙酮混合液及纯包埋剂70℃条件下过夜处理后，使用切片机获得厚度70-90纳米肠道上皮单层切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10后，透射电镜观察获得图像。
图1D和E分别是肠道上皮单层培养扫描电镜和透射电镜结果，结果证实肠道上皮体外培养表面形成与体内肠道上皮相同的微绒毛结构，形成极化的上皮细胞，可以作为体内肠道上皮的代替物用于功能分析。
步骤八、肠道上皮体外单层培养通透性分析：异硫氰酸酯标记分子量为4.4kDa葡聚糖作为示踪剂检测肠道单层培养通透性，使用不含粉红的DMEM培养基清洗权利要求1步骤四培养板3中含有培养到第4-5天肠道上皮单层培养物的Transwell嵌套聚碳酸脂膜；然后转移至新的多孔培养板4中，向嵌套的上室中加入200微升浓度为5毫克每毫升的葡聚糖溶液，下室中加入600微升不含粉红DMEM溶液，培养板4整个过程中置于37℃条件下，并且分别于固定时间点从下室中使用移液枪采集100微升分析样品至新的离心管8中，并用相应体积不含酚红DMEM培养基补全溶液；随后使用酶标仪在495nm激发和520nm发射波长下测量离心管8样品中的荧光，并通过预先建立的已知浓度的校准曲线进行定量计算，计算公式为：
葡聚糖的跨膜转运量＝嵌套下室葡聚糖量/嵌套上层初始葡聚糖量×100％。
图1B是肠道上皮体外单层培养通透性分析结果，与无细胞接种及单纯几种肌成纤维细胞对照组相比，肠道体外单层培养我具有显著更低的通透性，表明培养4-5天后肠道体外单层形成了完整的屏障功能和通透性。
因此,从上述步骤和结果可以看出,本发明提供的利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法是稳定,可靠,有效的。
以上所述仅是本发明的特定实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
