PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用。
背景技术
膜性肾病(Membranous Nephropatoy,MN)是成人肾病综合征最常见的病理类型，当今各医疗中心病理诊断技术不断成熟，MN的发病率、诊断率也逐年升高，并已成为肾病综合征最常见的病因。其病理特征为致病靶抗原与抗体结合沉积于肾小球足细胞，导致肾小球基底膜增厚和足细胞足突消失、再激活补体引起损害。MN根据发病原因和病理特点分为3种，包括特发性膜性肾病(Idiopathic Membranous Nephropatoy，IMN)、继发性膜性肾病(Secondary Membranous Nephropathy，SMN)、不典型膜性肾病(Undetered AtypicalMembranous Nephropathy，UAMN)。
PLA2R是磷脂酶A2(PLA2)的受体之一，属于脂溶性水解酶超家族，有N型和M型两种亚型，M型PLA2R是一种相对分子质量为180kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于甘露醇受体及C型外源性凝集素超家族的一员，主要由细胞内C内端、细胞外C末端和一个跨膜域组成。胞外结构包含10个结构域，其中包括半胱氨酸富含域、C型凝集素样结构域1-8和纤维链接蛋白样Ⅱ型结构域。实验表明循环中的Anti-PLA2R与足细胞膜PLA2R结合形成免疫复合物，这种免疫复合物沉积于肾小球上皮细胞下，同时激活补体系统，最终导致基底膜、足细胞损伤，肾功能紊乱，从而出现蛋白尿。
2014年Tomas等在部分IMN患者发现另一非PLA2R免疫复合物沿基底膜沉积，最终测定抗原成分为I型血小板反应蛋白7A结构域(Thrombospondin-Type 1DomainContaining7A，THSD7A)。THSD7A是一种分子量约为250KD的单次跨膜糖蛋白，定位于足细胞基底面，其分子结构由胞外部份、跨膜域和胞内尾部构成其中胞外部份为主要结构，由11个血小板反应蛋白1域、14个糖基化位点和1个精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸组成。针对THSD7A产生的特异性抗体亚型以IgG4为主，在IMN中其阳性率约3％～5％。
THSD7A和PLA2R致病机制类似，结构也类似，均为跨膜糖蛋白，其抗体亚型均为IgG4，此外两者致病过程中均由补体系统激活，最后均是形成免疫复合物沉积于肾小球上皮下导致疾病发生。
虽然采用THSD7A蛋白、PLA2R蛋白检测血清、尿PLA2R抗体以及THSD7A抗体，可以对IMN进行诊断，但是单一的蛋白的检测灵敏度和特异性较差，导致漏检和错检。
发明内容
本发明目的在于提供PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白，该融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。
此外，本发明还提供上述PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的构建方法、应用。
本发明通过下述技术方案实现：
PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
C1q沉积常见于继发性膜性肾病，以系统性红斑狼疮性肾病和乙肝相关性肾病多见。但近年发现在部分IMN患者肾组织中也可见C1q的沉积，提示IMN的发生不仅仅有补体旁路途径和甘露聚糖结合凝集素途径激活的参与，可能也有经典途径补体激活的参与。在Ⅰ期的IMN患者中以IgG1沉积为主，Ⅱ期之后的IMN以IgG4沉积为主，C1q沉积与IgG4沉积负相关，据此推测经典途径可能参与了IMN发病早期，提示C1q沉积可能多存在于早期IMN患者肾组织中。
因此，PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。
一种编码PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
一种含有上述基因的重组质粒。
一种含有上述重组质粒的哺乳细胞。
一种含有PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的试剂盒。
PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的构建方法，包括以下步骤：
S1、依次连接PLA2R、THSD7A、C1q核苷酸序列获得目的基因，C1q重复三次，其中，PLA2R、THSD7A之间加入Linker序列(5个氨基酸残基的柔性肽基因序列)，THSD7A、C1q之间加入Linker序列，相邻C1q之间加入Linker序列；
S2、在目的基因前加入真核KOZAK序列，在上游加入限制性核酸内切酶位点BamⅠ，在下游加入NotⅠ酶切位点，C端加入6*His标签序列，并根据哺乳细胞偏好性设计(不同表达体系对密码子有偏好性)全序列基因；
S3、将步骤S2获得的全序列基因与质粒进行双酶切，并使用试剂盒回收酶切产物；
S4、将步骤S3获得的酶切产物通过T4连接酶连接，得到连接产物即重组质粒；
S5、将重组质粒在哺乳细胞中表达获得PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白：
得到的重组质粒转化感受态细胞并使用质粒提取试剂盒提取质粒，瞬时转染哺乳细胞(HEK293)进行表达，初步鉴定目的蛋白。
本发明通过将PLA2R、THSD7A和C1q基因连接后连接到pcDNA3.1(+/-)载体中，制备一种能表达PLA2R蛋白、THSD7A蛋白和C1q蛋白的重组质粒，将该重组质粒导入哺乳细胞中表达一种PLA2R蛋白、THSD7A蛋白和C1q蛋白的融合蛋白，采用本发明所述方法只需要一次表达就能制备得到PLA2R蛋白、THSD7A蛋白和C1q蛋白的融合蛋白(PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白)。
C1q连接三次，提高蛋白的表达效果，避免短肽在表达过程中被折叠覆盖，进一步提高试剂盒检测灵敏度和特异性，减少漏检和错检。
采用哺乳细胞表达的蛋白能正确折叠翻译、得到的蛋白活性高。
进一步地，还包括对PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的筛选、纯化。
采用上述构建方法所制备的融合蛋白。
PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白或包括PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的试剂盒在制备免疫学诊断试剂中的应用。
PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白或包括PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的试剂盒在制备膜性肾病免疫诊断试剂中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明只需要一次表达就能制备得到一种PLA2R蛋白、THSD7A蛋白、C1q蛋白的融合蛋白，降低成本与时间。
2、使用本发明所述PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白制备检测试剂盒能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，减少漏检和错检。
3、用本发明所述PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白制备检测试剂盒能够降低反复检测成本，有利于病人节省成本；可作为辅助检查手段，IMN大部分检测为肾活检，能减少病人痛苦。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为转染细胞表达鉴定结果图；
图2为纯化蛋白电泳图；
图3为纯化蛋白鉴定结果图；
图4为涂板后挑取阳性克隆鉴定图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
融合基因(目的基因)的合成：
PLA2R蛋白(GeneID:22925)序列选择如下：
MLLSPSLLLLLLLGAPRGCAEGVAAALTPERLLEWQDKGIFVIQSESLKKCIQAGKSVLTLENCKQANKHMLWKWVSNHGLFNIGGSGCLGLNFSAPEQPLSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKWISYGSGGGDICEYLHKDLHTIKGNTHGMPCMFPFQYNHQWHHECTREGREDDLLWCATTSRYERDEKWGFCPDPTSAEVGCDTIWEKDLNSHICYQFNLLSSLSWSEAHSSCQMQGGTLLSITDETEENFIREHMSSKTVEVWMGLNQLDEHAGWQWSDGTPLNYLNWSPEVNFEPFVEDHCGTFSSFMPSAWRSRDCESTLPYICKKYLNHIDHEIVE。
THSD7A蛋白(GeneID:221981)序列选择如下：
AAQGEAEAPTLYLWKTGPWGRCMGDECGPGGIQTRAVWCAHVEGWTTLHTNCKQAERPNNQQNCFKVCDWHKELYDWRLGPWNQCQPVISKSLEKPLECIKGEEGIQVREIACIQKDKDIPAEDIICEYFEPKPLLEQACLIPCQ。
C1q蛋白序列(GeneID:712)选择如下：
GRPGRRGRPGLKG。
S1、依次连接PLA2R、THSD7A、C1q核苷酸序列获得目的基因，C1q重复三次，其中，PLA2R、THSD7A之间加入Linker序列，THSD7A、C1q之间加入Linker序列，相邻C1q之间加入Linker序列：根据GenBank所公开的序列信息，在连接两个基因片段之间去掉终止密码子和起始密码子，并加入5个氨基酸残基(GGGGS)的柔性肽基因序列(Linker序列)，并在C端加入6*His标签序列；在序列上游加入限制性核酸内切酶位点BamH I，在其下游则加入Not I酶切位点，并根据哺乳动物密码子偏好性设计全序，全基因合成。全基因合成时各序列之间的排列顺序为：
真核KOZAK-PLA2R-Linker-THSD7A-Linker-C1q-Linker-C1q-Linker-C1q-6*His，目的基因(融合基因)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2：
含有融合基因的重组质粒构建：
2.1将实施例1中获得的PCR片段与经过限制性内切酶BamH I和Not I双酶切的载体pcDNA3.1(+/-)A(质粒)进行连接获得重组质粒；
2.2连接产物(重组质粒)转化于感受态大肠杆菌DH5α中，体积不应超过感受态细胞的10％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟，将管放入42℃水浴，定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却，每管加入400μL LB培养基,37℃缓摇60分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因,低速离心2分钟，去上清，留约100μL培养基在离心管内，重悬菌体，用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀；
2.3将平板倒置于37℃恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行鉴定如图4所示。
实施例3：
融合蛋白的表达
3.1将实施例2中获得的重组质粒转化至DH10 Bac E.coli感受态细胞中，体积不应该超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物；
3.2冰浴30分钟；将管放入42℃水浴，定时90秒热休克；快速将管转移到冰浴120秒，使细胞冷却；每管加入800μL LB培养基，37℃，缓摇4小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；用玻璃铺菌器将30μL菌液在抗性琼脂板上铺匀；将平板倒置于37℃恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落；
3.3挑取阳性白斑单菌落接入5mL抗性LB，缓摇12-16h，取菌液进行PCR鉴定，结果显示重组目的基因正确，将重组质粒经转染试剂转染到哺乳细胞(HEK293细胞)中，3-5天后收取细胞及上清液鉴定结果如图1所示，PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
实施例4：
融合蛋白鉴定：
4.1分别将实施例3中的上清与细胞进行非还原性SDS-PAGE电泳，使用12％分离胶浓度，电泳约90分钟；
4.2将SDS-PAGE电泳凝胶进行转膜(PVDF)，湿转90V，100分钟；收集PVDF，使用5％脱脂奶粉封闭；
4.3将1.2封闭后的PVDF膜加入anti-His mAb，再洗净后加入鼠二抗，ECL显色；确定蛋白表达于细胞上清中结果如图2所示。
实施例5：
融合蛋白的筛选与表达：
5.1提前摸索G418(G418为一种抗生素药物，质粒在真核细胞的抗性基团neo筛选药物)在HEK293细胞中合适的浓度，最终选择800μg/mL为筛选培养基；
5.2转染前24h选择1*105/mL接种HEK293细胞至6孔板，二氧化碳培养箱37℃，5％CO2培养；
5.3用无血清培养基洗涤细胞两次，加入1mL无血清培养基；将Lipofectamine2000、Opti-MEMTM培养基、质粒按照一定比例混合后加入，加入细胞中成蝴蝶状混合均匀后，放入二氧化碳培养箱37℃，5％CO2培养24h-48h后，更换含800μg/mL G418的完全DMEM培养基，3-5天后，将活细胞克隆转移至24孔板，筛选能高效表达蛋白的单克隆细胞；
5.4将筛选后的细胞进行大规模培养表达。
实施例6：
融合蛋白纯化
6.1收集培养表达的上清约1L，用5000mL预冷的上样缓冲液(20mM Tris-HclpH8.0；500mM NaCl)透析，换液3次，每次不少于4小时；
6.2收集上清，12000rpm/min，离心后收集上清弃掉沉淀，上清与50mL用平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA RESIN一起孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里；
6.3依次用冲洗缓冲液1(20mM Tris-Hcl pH8.0；500mM NaCl)洗10个柱体积；
6.4冲洗缓冲液2(20mM Tris-Hcl pH8.0；500mM NaCl；20mM咪唑)洗10个柱体积；
6.5冲洗缓冲液3(20mM Tris-Hcl pH8.0；500mM NaCl；60mM咪唑)洗5个柱体积；
6.6冲洗缓冲液4(20mM Tris-Hcl pH8.0；500mM NaCl；300mM咪唑)洗5个柱体积；
6.7冲液洗脱目的蛋白，1×PBS透析纯化后得到的目的蛋白保存在-80℃；
6.8SDS-PAGE电泳检测表达蛋白纯度及浓度。
实施例7：
WB鉴定所得融合蛋白的效价结果如图3所示：
7.1分别将6.7中蛋白进行不同梯度蛋白进行非还原性SDS-PAGE电泳，使用12％分离胶浓度，电泳约90分钟；
7.2将SDS-PAGE电泳凝胶进行转膜(PVDF)，湿转90V，100分钟；收集PVDF，使用5％脱脂奶粉封闭；
7.3将2封闭后的PVDF膜加入anti-His mAb，再洗净后加入鼠二抗，ECL显色。
实施例8：
试剂盒制备
8.1将得到的融合蛋白与生物素偶联，偶联完成后再偶联到链酶亲和素磁珠上；
8.2采用免疫反应间接法，R1为0.01M PBS的缓冲液；R2为h含0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的抗人IgG的溶液；M为含0.1μg/mL融合蛋白的溶液；化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2二氧环乙烷二钠盐；
8.3选取51例肾活检确诊为膜性肾病的患者血清及113例随机健康人体检样本进行测定；
8.4样本检测的操作流程如下：将20uL样本、50uL R1试剂和50uL磁微粒试剂混匀孵育10分钟、清洗3次；然后加入100uL R2试剂，孵育10分钟、清洗3次；而后加入200uL底物反应5分钟，进行检测；
8.5对检测结果的分析具体如下：
本发明试剂盒对51例临床诊断为膜性肾病的样本进行检测。结果表明，本发明试剂盒阳性符合率94.0％(表1)。
本发明试剂盒对113例随机健康人体检样本进行检测。结果表明，本发明试剂盒阴性符合率100.0％(表2)。
表1：试剂盒临床比对
表2：阴性符合率
8.6灵敏度检测：将8.5中的51例临床诊断为膜性肾病的样本进行检测，使用三种市售试剂盒与本试剂盒分别检测，结果显示单独检测的阳性率分别为78％、8％、6％(表3)，本试剂盒的阳性率为94％，通过对比结果显示本试剂盒检测的阳性率均高于单一检测项的试剂盒。
表3：灵敏度对比
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川携光生物技术有限公司
<120> PLA2R、C1q、THSD7A融合蛋白及其构建方法、应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Arg Gly Cys Ala Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu
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Leu Arg Trp Arg Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr
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