一种检测百草枯的方法
技术领域
本发明涉及一种检测百草枯的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
农药在农业领域中的应用可以在保证农作物产量同时，也会带来农药残留问题。百草枯是一种能够快速杀灭一年生杂草的除草剂除草，但因其对人体可产生不可逆的肺组织性损伤等病理症状，对人体器官伤害大，无特效的解毒药。目前已将百草枯的使用类别变更为禁用农药。为应对农业生产中可能存在违法使用百草枯的风险，建立一种能够快速实现定量-半定量检测的检测方法就显得较为重要。
目前，所开发的农药快速检测方法以酶抑制作用为基础较多。酶抑制法一般为广谱性方法，且存在生物酶稳定性受环境因素影响较大，保存要求高等缺点。直接利用纳米材料实现农药特异性检测的方法具有体系简单、特异性高等优点。其中，针对百草枯农药有基于纳米材料的比色、化学发光、表面拉曼增强、以及荧光检测方法的报道。其中，典型的例子是采用半导体量子点(如碲化镉CdTe)实现荧光检测百草枯的方法，但是材料纳米材料制备相对复杂、且需要应用重金属，然而重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体，造成慢性中毒，对人体有危害。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的主要目的在于建立一种基于金纳米簇的荧光检测百草枯的方法。该发明的检测原理为：通过从金纳米簇到百草枯的静电转移而使得金纳米簇的荧光发生淬灭，同时，由于金纳米簇的双配基修饰具有荧光增强作用和增强抗干扰能力，于实现可靠的定量检测百草枯。
本发明的第一个目的是提供一种检测百草枯的方法，所述检测方法是采用金纳米簇作为百草枯的检测试剂，对待测样品进行荧光检测；所述金纳米簇是采用巯基-β-环糊精SH-β-CDs对谷胱甘肽还原金制备进行修饰制备得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述金纳米簇的制备方法为：将2mL的HAuCl4(10mM)、0.3mL的GSH(100mM)溶液和7.7mL超纯水混合。在温和搅拌下将混合物加热至70℃，反应24小时。向所得到的淡黄色溶液中，以1：1比例加入乙醇；溶液由澄清变为浑浊，将溶液8000rpm下离心15min，分离沉淀并超声溶解，经0.22μM滤膜过滤，得到谷胱甘肽还原金溶液。向所得到的谷胱甘肽还原金溶液中加入SH-β-环糊精(终浓度5mM)，50℃下孵育3h；所得到的溶液经超滤管(10kDa)离心浓缩，制备得到金纳米簇。
在本发明的一种实施方式中，所述检测方法是：将待测样品溶液中加入金纳米簇溶液，混合反应后再采用荧光分光光度计进行检测，通过外标法计算得出待测样品中百草枯的含量。
在本发明的一种实施方式中，所述金纳米溶液需采用缓冲液调节pH为8.5-9.0。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲溶液包括甘氨酸缓冲盐、Tris-HCl或磷酸盐缓冲溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光检测条件为激发宽带为20nm，狭缝宽度为20nm，激发波长为392nm，检测610nm发射峰值处荧光值。
在本发明的一种实施方式中，若待测样品中含有金属离子，须先向待测样品中加入金属离子掩蔽剂，再加入金纳米簇进行检测。
本发明的第二个目的是提供一种上述检测方法在检测食品、河水、湖水或污水中农药含量方面的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测水中百草枯含量的方法，所述方法是先向待测样品中加入金属离子掩蔽剂，再采用上述方法检测待测样品中百草枯含量。
在本发明的一种实施方式中，所选择金纳米簇的浓度为0.02-0.2μM。
在本发明的一种实施方式中，所选择的缓冲盐为Gly-NaOH(5-20mM)。
在本发明的一种实施方式中，所述的掩蔽剂为Na2S和cDCTA的混合液，Na2S浓度为0.1-1.0mM，cDCTA浓度为1-10mM。
在本发明的一种实施方式中，所述方法步骤为：
(1)金纳米簇溶液预备：将制备的金纳米簇由甘氨酸缓冲盐(5-20mM)调整pH为9.0，稀释至适当浓度：
(2)标准曲线的准备：将百草枯标准溶液与纳米簇溶液混合孵育1min，建立金纳米簇的荧光淬灭率信号与百草枯浓度的之间对应关系的标准曲线0.02-0.2μM；
(3)样品的检测：将样品溶液中加入由硫化钠(Na2S)和反式环己二胺四乙酸(cDCTA)配置的掩蔽剂，和金纳米簇溶液混合反应，将计算后的荧光淬灭率信号带入标准曲线，计算得出检测样品中百草枯的浓度。
本发明的有益效果：
本发明所构建的金纳米簇荧光检测百草枯的方法，其检测限为5.0ng/mL，线性范围为5.0-360ng/mL；其它常见有机磷农药在相同检测浓度500ng/mL浓度下，百草枯对于纳米簇的检测淬灭率在80％，其他农药的淬灭率均低于5％，纳米簇加入金属离子屏蔽剂后离子的干扰降低，对5uM已检测的金属离子的淬灭率响应均小于5％。该方法具有高灵敏、高选择性、检测快速等特点。
附图说明
图1是金纳米簇的制备以及百草枯的检测原理图。
图2是修饰HS-β-CDs后纳米簇的荧光变化。
图3是百草枯检测荧光曲线。
图4是百草枯检测标准曲线。
图5是β-CD/GSH-AuNCs对各种农药的选择性响应。
图6是β-CD/GSH-AuNCs对各种金属离子的响应。
图7是GSH-AuNCs对各种金属离子的响应。
图8是A,B,C,D,E,F分别是百草枯在不同浓度Na2HPO4-NaH2PO4,Tris-HCl,柠檬酸-Na2HPO4缓冲盐中对纳米簇淬灭率响应和在不同pH下Na2HPO4-NaH2PO4,Tris-HCl,Gly-NaOH的淬灭率响应。
图9是EDTA对各种离子的屏蔽作用。
图10是cDCTA对各种金属离子的屏蔽作用。
图11是cDCTA和Na2S对各种金属离子的屏蔽作用。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：金纳米簇的制备方法
将2mL的HAuCl4(10mM)、0.3mL的GSH(100mM)溶液和7.7mL超纯水混合。在温和搅拌下将混合物加热至70℃，反应24小时。向所得到的淡黄色溶液中，以1：1比例加入乙醇；溶液由澄清变为浑浊，将溶液8000rpm下离心15min，分离沉淀并超声溶解，经0.22μM滤膜过滤，得到谷胱甘肽还原金溶液GSH-AuNCs。向所得到的谷胱甘肽还原金溶液中加入SH-β-环糊精(终浓度5mM)，50℃下孵育3h；所得到的溶液经超滤管(10kDa)离心浓缩，制备得到金纳米簇β-CD/GSH-AuNCs，收集浓缩液(0.03mM)于4℃下保存，金纳米簇反应原理如图1所示。得到的金纳米簇的粒径为1.0～3.0nm，激发波长在350～400nm之间，发射波长为620nm。修饰前后的金纳米簇的荧光强度见图2，这说明采用巯基-β-环糊精修饰可提高百草枯的结合作用。
实施例2：一种应用金纳米簇检测河水/湖水中百草枯含量的方法
应用实施例1制备得到的金纳米簇检测河水/湖水中百草枯含量，金纳米簇的制备以及百草枯的检测原理图见图1。
1、标准曲线的建立
(1)标准溶液的制备：
900uL Gly-NaOH缓冲液+50uL百草枯农药的标准液或样品液+50uL纳米簇(0.05μM)，混匀后
(2)荧光光谱检测：
采用荧光光度计进行检测，检测条件为：激发波长为390nm，收集620nm处发射信号。
(3)线性关系、检测限的确定：
检测纳米簇荧光强度计为F1，纳米簇不添加农药的荧光强度计为F0，绘制标准曲线如图3和4，该标准曲线为y＝0.0254x+0.0037(5-150ng/mL),R2＝0.9956；y＝0.1367x+0.014,(150-360ng/mL)R2＝0.9837，线性范围为5-360ng/mL，定量限为5ng/mL。
2、检测河水/湖水中百草枯含量的方法
(1)样品预处理：将河水/湖水经过微孔滤膜过滤，同时，以添加掩蔽剂，掩蔽剂含有200uM Na2S和2mM cDCTA，样品与掩蔽剂体积比为1:1。
(2)荧光光谱检测：
采用荧光光度计进行检测，检测条件为：激发波长为390nm，收集620nm处发射信号。
实施例3：方法的准确性和特异性
1、方法的准确性
向湖水样品中加入标准添加百草枯的浓度为160ng/mL，3次平行测定实际测得百草枯平均浓度为155.6ng/mL，测得的回收率为97.2％，相对标准偏差(RSD)＝2.0％。
2、方法的特异性
(1)考察了常见有机磷农药以及金属离子对检测的影响。有机磷农药选取了苯线磷、啶虫脒、毒死蜱、草甘膦、甲基对硫磷、水胺硫磷、灭多威和吡虫啉9种农药在相同浓度下(500ng/mL)，结果显示它们不会影响对于百草枯的检测(如图5所示)。
(2)考察了常见金属离子对检测的影响，如图6和图7所示，结果表明经HS-β-CD修饰后抗金属和S2-能力提高。
实施例4：不同盐浓度对于百草枯淬灭金纳米簇荧光的影响
参照实施例2的方法进行检测，区别仅在于，调整体系缓冲盐和缓冲盐浓度，采用Na2HPO4-NaH2PO4,Tris-HCl,柠檬酸-Na2HPO4将缓冲盐浓度分别调整为5mM,10mM,15mM,20mM,25mM,30mM其它条件相同，结果见图8。
由图8A,8B,8C可知，高浓度的缓冲盐会影响百草枯对于纳米簇的荧光淬灭，因此选取5mM缓冲盐浓度作为最优。
实施例5：pH对于百草枯淬灭金纳米簇荧光的影响
参照实施例2的方法进行检测，区别仅在于，调整体系pH，采用Na2HPO4-NaH2PO4,Tris-HCl,Gly-NaOH将缓冲盐调整体系为不同的pH,其它条件相同，结果见图8。
由图8D,8E,8F可知，当体系pH＝9.0时百草枯对于纳米簇的荧光淬灭达到最大，因此选取pH＝9.0的Tris-HCl,Gly-NaOH缓冲盐作为最优。
实施例6：金属离子屏蔽剂的选择
参照实施例2的方法进行检测，区别仅在于，添加浓度为10uM的金属离子，将掩蔽剂分别更换成EDTA，cDCTA，Na2S和cDCTA体系，其它条件相同，结果分别如图9、10和11。通过筛选，选择了同时加入反式环己乙二胺四乙酸和硫化钠作为金属离子屏蔽剂，加入屏蔽剂后，对等13种常见金属离子屏蔽效果很好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
