一种长臂活化生物素分子标记抗原及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其是涉及一种长臂活化生物素分子标记抗原及其制备方法、应用。
背景技术
近年来，利用生物素(biotin)与亲和素(avidin)之间的亲和作用，以及他们之间既可偶联抗原、抗体等大分子生物活性物质，又可被酶等多种材料所标记的特性，研制一种新型生物反应放大系统，即生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin%20Systerm)，并建立了多种高灵敏度，高特异性，高稳定性，方便、经济和快速的生物反应监测和分离纯化。
而现有的生物素标记抗原，在抗体检测的时候，存在灵敏度不足，阳性率低的缺点，存在漏检或误检等风险，均无法达到要求。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种长臂活化生物素分子标记抗原及其制备方法、应用，以克服现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种长臂活化生物素分子标记抗原，所述长臂活化生物素为以下结构式中的一种，
或
或
优选的，抗原为HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原)重组抗原。
一种制备如上所述的长臂活化生物素分子标记抗原的方法，取0.5mg-1mg HBsAg重组抗原，用0.01M-0.05M pH＝8.5-10.5硼酸盐溶液在2～8℃下进行透析1～3h，将透析后的抗原加入25-40μg长臂活化生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5～10％，缓慢振荡，避光反应3-6h，在上述溶液中加入250-400μL 1-5M氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01-0.05M PBS溶液在2～8℃下透析12-24h，期间换液3～5次。
本发明还提供如上所述的长臂活化生物素分子标记抗原，或如上所述制备方法制备的长臂活化生物素分子标记抗原在制备乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂中的应用。
本发明提供一种乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒，包括如权利要1或2所述的长臂活化生物素分子标记抗原、链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液以及辣根过氧化酶标记的重组抗原。
优选的，所述链霉亲和素偶联磁微粒悬浮液的制备包括如下步骤，取100-200ml0.1-0.5M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，加入10-30mg表面偶联有羧基和氨基的磁微粒，室温搅拌40-60min，之后加入3.5-6.0mg链酶亲和素，然后加入8-15mg/ml碳二亚胺溶液(EDC)，2～8℃反应1-4h后，用0.01-0.05M PBS溶液在2～8℃透析12～24h，期间换液3-5次。
优选的，辣根过氧化酶标记重组抗原的制备步骤如下，
1)将待标记的原料0.5mg-1mg HBsAg重组抗原放入透析袋中，用0.01-0.05M pH＝8.5-10.5的硼酸盐缓冲液中透析1-3h；
2)将上述透析过的HBsAg重组抗原与活化的辣根过氧化酶按质量比为1:(1-3)进行标记，即1mg抗原用1-3mg酶标记；将上述溶液充分混合后进行透析，透析换缓冲液使用pH＝9.5±0.5的碳酸盐缓冲液，置于2-8℃避光透析12-24h，期间更换2-3次透析缓冲液；
3)取出透析好的原料，配制浓度为1-5mg/ml的NaBH4，按照1mg原料中加入100-400ul NaBH4比例进行混合，2-8℃避光反应2-4h；
4)将上述完成的标记原料用0.01-0.05M PBS置于2-8℃透析12-24h，并加入等体积甘油，保存备用。
优选的，所述活化的辣根过氧化酶的制备方法如下，
1)配制5-10mg/ml的辣根过氧化酶溶液；
2)配制10-21mg/ml的高碘酸钠溶液
3)将上述两种溶液按照10:1体积比混合，混匀后置于2-8℃，避光孵育15-30min，活化完成，-20℃保存备用。
优选的，长臂活化生物素分子标记抗原、链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液以及辣根过氧化酶标记的重组抗原的工作浓度是0.5-4μg/ml。
优选的，还包括化学发光底物，化学发光底物包括A液和B液；
A液为0.5-1.5g/L鲁米诺，0.05-0.2g/L对碘酚，缓冲液为pH 7.5-9的2-10mmol/LTris-HCl，避光保存；
B液为0.5-1g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合；
优选的，还包括稀释液，稀释液组分如下：Tris 4-6g/L；甲基纤维素2-4g/L；0.5-2.5mL/L；HCI 5.5-6.5mL/L；ProClinTM 300 0.5-2.0mL/L
相对于现有技术，本发明所述的长臂活化生物素分子标记抗原及其制备方法、应用，具有以下优势：
使用长臂活化生物素标记抗原能使检测灵敏度和特异性有很大程度的提高；蛋白质分子之间的较长的直链距离才可避免蛋白分子之间产生位阻，因此将生物素接上交联臂，与抗原和酶连接后，再与亲和素结合可使亲和素与抗原、酶之间位阻减小，提高亲和素与长臂生物素化蛋白的结合稳定性，增加了亲和素与标记蛋白大分子上生物素的有效结合率。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒，如下所述，
原料试剂：
生物素标记的重组抗原
链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液
辣根过氧化酶标记的重组抗原
制备过程：
生物素标记的抗原的制备(臂长29)
取0.5mg HBsAg重组抗原，用0.01M pH＝8.5硼酸盐溶液在4℃下进行透析2h，将透析后的抗原加入25μg长臂活化生物素，同时加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜最终质量浓度为5％，缓慢振荡，避光反应4h，在上述溶液中加入250μL 5M氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.02M PBS溶液在4℃下透析24h，期间换液3次。
链霉亲和素偶联磁微粒悬浮液的制备
取100ml 0.1M 2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，加入10mg表面偶联有羧基和氨基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入3.5mg链酶亲和素，然后加入8mg/ml碳二亚胺溶液(EDC)，4℃反应1h后，用0.02M PBS溶液在4℃透析24h，期间换液3次。
辣根过氧化酶标记重组抗原的制备：
1、将待标记的原料HBsAg重组抗原放入透析袋中，用0.01M PH＝8.5的硼酸盐缓冲液中透析1h。
2、将上述透析过的HBsAg重组抗原与活化的辣根过氧化酶按质量比为1:2进行标记，即1mg抗原用2mg酶标记。将上述溶液充分混合后进行透析，透析换缓冲液使用PH＝9.5的碳酸盐缓冲液，置于4℃避光透析24h，期间更换3次透析缓冲液。
3、取出透析好的原料，配制浓度为1mg/ml的NaBH4，按照1mg原料中加入100ulNaBH4比例进行混合，4℃避光反应4h。
4、将上述完成的标记原料用0.02M PBS置于4℃透析24h，并加入等体积甘油，保存备用。
活化的辣根过氧化酶的制备
1、配制10mg/ml的辣根过氧化酶溶液；
2、配制21mg/ml的高碘酸钠溶液；
3、将上述两种溶液按照10:1体积比混合，混匀后置于2-8℃，避光孵育15min，活化完成，-20℃保存备用。
还包括稀释液，稀释液组分如下：Tris 4.3g/L；甲基纤维素2g/L；0.5mL/L；HCI5.2mL/L；ProClinTM 300 0.5mL/L
20倍浓缩洗液包括：
58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和质量浓度2％Proclin300。
检测步骤：
1、将待测样本和生物素标记的HBsAg及辣根过氧化酶标记的HBsAg进行反应，形成含有抗体-抗原-抗体夹心复合体的反应液；
2、在上述反应液中加入偶联链霉亲和素的磁微粒，与上述反应液中的复合体在生物素亲和素的作用下，形成磁性复合物悬浮液。
3、将磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤上述所述复合物。
4、向洗涤后的磁性复合物中注入化学发光激发液，检测信号值。
具体实施：
1)将试剂盒各组分置于室温(18-25℃)平衡30min；
2)用纯化水将20倍弄浓缩洗液按照1:40的体积比进行稀释，制备洗涤液。
3)将生物素标记的HBsAg重组抗原与辣根过氧化酶标记的HBsAg重组抗原分别用稀释液稀释至工作浓度1μg/mL和5μg/mL；
4)取50μL生物素标记的HBsAg重组抗原1μg/mL，25μL血清样本及50μL辣根过氧化酶标记的HBsAg重组抗原5μg/mL，在37℃条件下孵育20min，然后加入50μL偶联链酶亲和素的磁微粒1mg/mL，37℃孵育10min，磁分离后，洗涤液清洗三次，每孔加入各发光底A和B 50μL，测定信号值。
性能评估
1、与传统生物素标记的重组抗原进行对比检测
试验方法：随机抽取30例样本，每个样本设置两个平行检测，分别采用传统生物素标记的重组抗原与长臂活化生物素标记的重组抗原进行原料的评估，并将企业内部校准品作为参考，试验结果如下：
以上结果显示，与传统应用的生物素相比较，长臂活化生物素标记重组抗原后，发光值普遍升高，可有效提高试剂盒的检测特异性。
2、对试剂盒使用国家参考品进行检测，其最低检测限不高于10mIU/mL。
试验方法：用校准品稀释液分别稀释国家参考品灵敏度参考品160mIU/mL稀释至10mIU/mL、5mIU/mL、2mIU/mL，每个浓度检测10次，分别计算其精密度。
试验结果：
以上数据显示：三种灵敏度参考品2mIU/mL，5mIU/mL，10mIU/mL分别测试10孔，其精密度(CV)均小于15％，均能检出，远优于乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品最低检出限不高于10.0mIU/mL的标准，该长臂化生物素标记的原料可达到灵敏度的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
