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一种筛选香水莲花花香优良品种的方法

2021-03-17 03:17:16

一种筛选香水莲花花香优良品种的方法

　　技术领域

　　本发明属于植物采摘技术领域，尤其涉及一种筛选香水莲花花香优良品种的方法。

　　背景技术

　　香水莲花(Nymphaea hybrid)为多年生大型观赏水生花卉，其花色和花香丰富，不同色系花香存在差异，深受人们喜爱，民间称之为“九品香莲”。香水莲花花期长，花朵硕大，花型优美，可作鲜切花，也可用于美化水景，具有极高的观赏价值；同时，由于其富含各类生物活性物质，在医药、食品和化妆品等领域具有很大的开发利用价值，是天然香精香料植物。虽然香水莲花具有多方面的使用价值，但不同品种的功能存在差异。目前，香水莲花的加工产品主要有花茶和纯露、精油等化妆品，但由于缺乏统一的花香优良品种筛选标准，在花茶制作或提取精油时，所使用的香水莲花品种、品质不一，导致加工所得产品的质量参差不齐，给商业生产带来很大的困扰。因此，在众多品种中，筛选出不仅适合美化、香化环境，且花香特别突出的香水莲花品种对于茶饮等商业生产将具有重要价值。

　　发明内容

　　本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种简单、快捷、可靠的筛选香水莲花花香优良品种的方法。

　　为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种筛选香水莲花花香优良品种的方法，包括以下步骤：

　　1)采摘不同品种香水莲花的盛花期S3花朵；

　　2)将不同品种香水莲花的盛花期S3花朵用清水冲洗干净，切去花萼，然后将20～25g 花朵放入透明玻璃容器中用1000mL 100℃沸水冲泡3～5min，如茶香浓郁，茶色金黄透亮，且冲泡30min后，茶色和花朵颜色不变，确定该品种香水莲花为香水莲花中花香优良品种。

　　优化地，还包括确定香水莲花花香优良品种的4项辅助筛选手段，分别为：

　　3.1)测定不同品种香水莲花盛花期S3花朵的花香物质成分：对不同品种香水莲花盛花期S3鲜花的花香物质成分进行检测和分析，统计所测得的挥发性香气物质种类Vi，挥发性香气物质总相对含量Ti，主要香气物质相对含量Mi，香水莲花花香优良品种Vi≥110，Ti≥99％， Mi≥75％，所述主要香气物质包括十五烷、乙酸苯基甲基酯、苯甲醇、6,9-十七碳二烯(6E,9E)、 8-十七烷烯、顺式-α金合欢烯和反式-α香柑油烯；

　　3.2)观察不同品种香水莲花盛花期S3花朵的花瓣香气分泌结构：通过扫描电镜观察花瓣的表皮结构，香水莲花花香优良品种的花瓣表面乳突状凸起的密度ρ≥18个/mm2，凸起边缘清晰饱满；透射电镜观察花瓣的超微结构，香水莲花花香优良品种的花瓣细胞内质体直径 d≥1.85μm；

　　3.3)测定花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK的表达水平：收集生长于同一环境下不同花期，包括花蕾期S1、初花期S2、盛花期S3和末花期S4的不同品种香水莲花的花朵，然后测定不同品种香水莲花的4个花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK在不同花期的表达量，香水莲花花香优良品种的DXR基因在盛花期S3的相对表达量≥11.2、LIS基因在花蕾期 S1的相对表达量≥174.5、LOX基因在花蕾期S1的相对表达量≥1.33、PMK基因在盛花期S3 的相对表达量≥3.85；

　　3.4)测定花茶的挥发性香气物质：对步骤1)中收集的不同品种香水莲花制备干花，然后干花泡水，制得花茶，对花茶的挥发性香气物质进行检测和比较，统计所测得的挥发性香气物质种类为TVi，挥发性香气物质总相对含量TTi，香水莲花花香优良品种TVi≥70，TTi≥88％；

　　进一步地，当上述4项辅助筛选手段同时达标，则步骤2)确定的香水莲花花香优良品种的判定结果更精确。

　　进一步地，香水莲花的花期划分标准为：花蕾期S1，花瓣完全被萼片包裹，花蕾紧实，花瓣未展开；初花期S2，苞片开裂，露出花被片，雄蕊群未开裂散粉，仅少量或半数花瓣可见；盛花期S3，花朵完全开放，花瓣和雄蕊完全可见且未发黑，雄蕊群自外向内开裂散出大量的花粉，花萼向四周开展；末花期S4，花瓣边缘皱缩，花药完全脱落，雄蕊发黑，花朵收缩即将凋谢。

　　进一步地，步骤3.1)中，采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术检测香水莲花盛花期S3鲜花的花香物质，其中，顶空固相微萃取对香水莲花鲜花挥发性香气物质吸附的条件为：采用PDMS/DVB-65μm型号的萃取头，吸附温度为45℃，吸附时间为50min，香水莲花新鲜花瓣2g，解吸时间为3min。

　　进一步地，步骤3.3)中，通过实时荧光定量PCR(QT-PCR)技术测定花香相关基因DXR、 LIS、LOX和PMK的表达量，且内参基因选用AP47。

　　进一步地，DXR基因的定量引物为SEQ ID NO.1所示的DXR–F和SEQ ID NO.2所示的DXR–R，LIS基因的定量引物为SEQ ID NO.3所示的LIS–F和SEQ ID NO.4所示的LIS–R， LOX基因的定量引物为SEQ ID NO.5所示的LOX–F和SEQ ID NO.6所示的LOX–R，PMK基因的定量引物为SEQ ID NO.7所示的PMK–F和SEQ ID NO.8所示的PMK–R，AP47基因的定量引物为SEQID NO.9所示的AP47–F和SEQ ID NO.10所示的AP47–R。

　　进一步地，步骤3.4)中，香水莲花干花的制作流程为：采摘盛花期S3的香水莲花鲜花，清水冲洗吹干后进行干燥，干燥条件为70℃下保持30min，然后在55～60℃下烘8h，干燥结束后室温下冷却降温，制得香水莲花干花。

　　进一步地，步骤3.4)中，取0.5g香水莲花干花用l00mL 100℃热水冲泡l0min，制得花茶，采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术对花茶水溶液进行挥发性香气物质检测。

　　本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种筛选香水莲花花香优良品种的方法，该筛选方法以直观形态和气味观察结合4项辅助筛选手段，从香水莲花的花香物质种类及含量、花瓣解剖结构、花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK表达水平和花茶风味等层面进行精确筛选，筛选结果可靠，为选择合适的香水莲花花香优良品种提供了科学依据；而且该方法筛选周期短，为芳香植物园、芳香园艺疗法及香水莲花花茶的制作、芳香精油提取等领域筛选花香优良种质资源提供了技术支撑，具有良好的应用价值。

　　附图说明

　　图1为本发明的香水莲花不同时期花型示意图，其中，S1为花蕾期，S2为初花期，S3为盛花期，S4为末花期；

　　图2为本发明实施例2的‘白花型’香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

　　图3为本发明实施例2的‘黄花型’香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

　　图4为本发明实施例2的‘紫花型’香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

　　图5为本发明实施例2的‘粉花型’香水莲花挥发性成分总离子流色谱图；

　　图6为本发明实施例2的不同品种香水莲花主要香气物质检测结果图；

　　图7为本发明实施例2的不同品种香水莲花的花瓣扫描电镜图，其中A为‘紫花型’香水莲花，B为‘粉花型’香水莲花，C为‘黄花型’香水莲花，D为‘白花型’香水莲花；

　　图8为本发明实施例2的不同品种香水莲花的花瓣透射电镜图，其中A为‘紫花型’香水莲花，B为‘粉花型’香水莲花，C为‘黄花型’香水莲花，D为‘白花型’香水莲花，V-液泡，CW- 细胞壁，P-质体，S-淀粉粒，MG-嗜锇酸基质颗粒；

　　图9为本发明实施例2的花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK在四个品种香水莲花不同花期的花瓣中表达量检测结果，其中A为DXR基因在四种香水莲花四个花期的花瓣中表达量，B为LIS基因在四种香水莲花四个花期的花瓣中表达量，C为LOX基因在四种香水莲花四个花期的花瓣中表达量，D为PMK基因四种香水莲花四个花期的花瓣中表达量，S1为花蕾期，S2为初花期，S3为盛花期，S4为末花期。

　　图10为本发明实施例2的‘紫花型’香水莲花花茶中挥发性成分总离子流色谱图；

　　图11为本发明实施例2的‘粉花型’香水莲花花茶中挥发性成分总离子流色谱图；

　　图12为本发明实施例2的‘黄花型’香水莲花花茶中挥发性成分总离子流色谱图；

　　图13为本发明实施例2的‘白花型’香水莲花花茶中挥发性成分总离子流色谱图。

　　具体实施方式

　　以下结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。

　　下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

　　实施例1

　　一种筛选香水莲花花香优良品种的方法，包括以下步骤：

　　1)采摘不同品种香水莲花的盛花期S3花朵

　　材料来源：材料包括香水莲花白色品系中的‘白花型’香水莲花、黄色品系中的‘黄花型’香水莲花、紫色品系中的‘紫花型’香水莲花和粉色品系中的‘粉花型’香水莲花，均采自相同栽植条件(同一规格种植池条件、香水莲花相同栽培条件)的厦门香水莲花种植基地；

　　采摘时间：于晴天上午8：00，温度为26℃左右，露水刚干时，采集上述四个品种香水莲花盛花期S3的花朵；如图1所示，盛花期S3香水莲花的花型为花朵完全开放，花瓣和雄蕊完全可见且未发黑，雄蕊群自外向内开裂散出大量的花粉，花萼向四周开展；

　　2)不同品种香水莲花花茶茶色、茶香、花瓣花色比对

　　对采摘的‘白花型’、‘黄花型’、‘紫花型’和‘粉花型’香水莲花的盛花期S3花朵用清水冲洗干净，切去花萼，然后将20～25g鲜花花朵放入透明玻璃容器中用1000mL 100℃沸水冲泡3～ 5min，嗅闻四种香水莲花花茶的茶香，冲泡30min后，再观察茶色和花朵颜色；四种香水莲花花茶茶色、茶香及花色检测结果如表1所示；

　　表1‘白花型’、‘黄花型’、‘紫花型’和‘粉花型’香水莲花的茶色、茶香和花香检测结果

　　由表1可知，‘黄花型’香水莲花茶香浓郁，茶色金黄透亮，且30min后，茶色和花朵颜色不变，仍为金黄色，而‘白花型’香水莲花茶色近于无色，‘紫花型’香水莲花和‘粉花型’香水莲花30min后茶色变为浅棕色，由此判定，‘黄花型’香水莲花所含花香物质最多且香气稳定持久，为上述四个品种香水莲花中花香优良品种。

　　在步骤1)的基础上，结合‘黄花型’香水莲花花茶的茶色、茶香和花朵颜色变化特点，确定香水莲花花香优良品种的筛选标准为：茶香浓郁，茶色金黄透亮，且冲泡30min后，茶色和花朵颜色不变。

　　实施例2

　　本实施例与实施例1的区别在于，还包括4项辅助筛选手段，分别为：3.1)测定不同品种香水莲花盛花期S3花朵的花香物质成分；3.2)观察不同品种香水莲花盛花期S3花朵的花瓣香气分泌结构；3.3)测定花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK的表达水平；3.4)测定花茶的挥发性香气物质；具体操作步骤如下：

　　一、材料来源：与实施例1一致；

　　二、采摘时间：与实施例1同批采集，除了四个品种香水莲花盛花期S3的花朵外，还采集了该四个品种香水莲花在不同开花期(花蕾期S1、初花期S2、盛花期S3和末花期S4)的花朵，用于测定生理指标及定量检测。

　　如图1所示，不同花期香水莲花的表观特征为：花蕾期S1，花瓣完全被萼片包裹，花蕾紧实，花瓣未展开；初花期S2，苞片开裂，露出花被片，雄蕊群未开裂散粉，仅少量或半数花瓣可见；盛花期S3，花朵完全开放，花瓣和雄蕊完全可见且未发黑，雄蕊群自外向内开裂散出大量的花粉，花萼向四周开展；末花期S4，花瓣边缘皱缩，花药完全脱落，雄蕊发黑，花朵收缩即将凋谢，渐渐沉入水中。

　　三、辅助筛选操作

　　3.1)测定不同品种香水莲花盛花期S3花朵的花香物质成分

　　检测方法：采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术测定‘白花型’香水莲花、‘黄花型’香水莲花、‘紫花型’香水莲花和‘粉花型’香水莲花的盛花期S3花朵中花香物质成分，具体为：顶空固相微萃取(HS-SPME)对香水莲花花瓣挥发性香气物质吸附的最优化条件为：PDMS/DVB-65μm型号的萃取头，吸附温度为45℃，吸附时间为50min，香水莲花新鲜花瓣用量为2g，解吸时间为3min；采用Trace 1300ISO-LT GC1300气象色谱质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific,USA)对4种香水莲花鲜花的花香物质成分进行GC-MS分析。

　　数据处理与分析：根据离子流峰面积归一化法来计算各组分在总挥发物中的相对含量。对采集到的物质质谱图用Xcalibur及NIST 2014进行分析，并将各主要峰的质谱数据与相关文献进行比对，来确定香水莲花花香物质的化学成分；统计所测得的挥发性香气物质种类为 Vi，挥发性香气物质总相对含量为Ti，主要香气物质相对含量为Mi。

　　实验检测结果见图2～6和表2所示；

　　表2香水莲花挥发性香气物质种类及含量

　　研究结果表明，不同品种香水莲花挥发性香气物质的种类、总相对含量和主要香气物质相对含量均表现为‘黄花型’香水莲花＞‘白花型’香水莲花＞‘紫花型’香水莲花＞‘粉花型’香水莲花；具体地，‘黄花型’香水莲花的挥发性香气物质种类达到110种，总相对含量达到99.28％，主要香气物质(十五烷、乙酸苯基甲基酯、苯甲醇、6,9-十七碳二烯(6E,9E)、8-十七烷烯、顺式-α金合欢烯和反式-α香柑油烯)含量达75.59％，均明显高于其他品种，说明‘黄花型’香水莲花是四种香水莲花中花香优良品种。

　　众所周知，赋香物质含量越高则花香越浓，因此，当检测到盛花期S3香水莲花的挥发性香气物质种类、总相对含量以及主要香气物质含量均不低于上述测定值，即香水莲花的挥发性香气物质种类不低于110种，挥发性香气物质的总相对含量不低于99％，主要香气物质相对含量不低于75％，则该品种香水莲花的挥发性花香物质释放量最多，更适宜作为花香优良种质资源。

　　3.2)观察四个品种香水莲花盛花期S3花朵的花瓣香气分泌结构

　　3.2.1)扫描电镜观测花瓣表皮结构

　　扫描电镜样品处理盛花期S3的四种香水莲花(‘黄花型’香水莲花、‘白花型’香水莲花、‘紫花型’香水莲花、‘粉花型’)花瓣，观察花瓣表皮结构，比较花瓣表面乳突状凸起数量和凸起程度；

　　由图7所示扫描电镜结果可见，花瓣表面乳突状凸起数量和凸起程度最大的品种为‘黄花型’香水莲花，其花瓣表面乳突状凸起的密度不低于18个/mm2，凸起边缘清晰饱满；

　　3.2.2)透视电镜观测花瓣超微结构和细胞内含物

　　透射电镜样品处理盛花期S3的四种香水莲花(‘黄花型’香水莲花、‘白花型’香水莲花、‘紫花型’香水莲花、‘粉花型’)花瓣，观察花瓣的超微结构和细胞内含物，比较不同品种花瓣细胞内质体的大小及数量；

　　结果见图8，可知花瓣细胞内质体大小和数量最高的香水莲花品种为‘黄花型’香水莲花，其花瓣细胞内质体直径≥1.85μm；

　　花瓣表面的乳突状凸起与香水莲花的香味散失有关，其密度越大，凸起程度越高，挥发性物质的释放量越大，而且花瓣内细胞内含物与其香气的形成存在一定关系，是香水莲花释放香气的物质基础，内含物越多，香气物质更为丰富。因此，当检测到盛花期S3香水莲花花瓣表面乳突状凸起的密度不低于18个/mm2，凸起边缘清晰饱满，花瓣细胞内质体直径≥1.85μm，则该品种香水莲花的挥发性花香物质释放量最多，香气物质更为丰富，更适宜作为花香优良种质资源。

　　3.3)测定花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK的表达水平

　　根据香水莲花转录组数据库，筛选与香水莲花花香物质合成相关的基因，总共筛选出4 个花香候选相关基因，分别为DXR(1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸还原异构酶基因)、LIS(芳樟醇合酶基因)、LOX(脂肪氧合酶基因)和PMK(甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因)；以AP47基因作为内参基因，采用实时荧光定量PCR(QT-PCR)技术测定四种花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK在四种香水莲花四个花期的花瓣中表达水平，根据DXR、LIS、LOX、PMK及AP47 基因的核苷酸序列设计定量引物，引物序列信息见表3，采用植物快速提取试剂盒(南京钟鼎生物技术有限公司，RK14-50T)提取花瓣中总RNA，然后采用TRUEscript 1st Strand cDNASynthesis Kit(第一链反转录试剂盒)(北京艾德莱生物科技有限公司，Code No:PC18)进行 cDNA反转录，采用2x Sybr Green qPCR Mix(北京艾德莱生物科技有限公司，Code No:PC33) 进行RT-qPCR扩增。

　　其中，植物RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒及实时荧光定量试剂盒均不限于上述特定试剂盒，只要能实现香水莲花花瓣总RNA提取，cDNA反转录和RT-qPCR即可。

　　表3荧光定量PCR引物信息

　　结果如图9所示，可知在不同花期，香水莲花4个花香基因均在‘黄花型’香水莲花中高丰度表达，显著高于其他品系(p<0.05)，其中DXR在‘黄花型’香水莲花盛花期S3相对表达量为11.2、LIS在‘黄花型’香水莲花花蕾期S1相对表达量为174.5、LOX在‘黄花型’香水莲花花蕾期S1相对表达量为1.33、PMK在‘黄花型’香水莲花盛花期S3相对表达量为3.85。

　　DXR的高表达促进了香水莲花中萜类物质的积累，在香水莲花花香物质的生物合成中起着关键的作用；LIS基因和LOX基因可以通过调控酶活性来调控香水莲花花香物质的合成和释放；PMK基因能够促进挥发性倍半萜物质的生成。因此，当检测到不同花期香水莲花花瓣中与花香物质合成相关的基因DXR在盛花期S3相对表达量≥11.2、LIS在花蕾期S1相对表达量≥174.5、LOX在花蕾期S1相对表达量≥1.33、PMK在盛花期S3相对表达量≥3.85，则该品种香水莲花的花香物质合成过程中基因的表达量较高，更适宜作为花香优良种质资源。

　　3.4)测定花茶的挥发性香气物质

　　3.4.1)制备香水莲花干花

　　将采摘的不同品种香水莲花盛花期S3鲜花经清水冲洗吹干后，进行干燥，干燥条件为 70℃下保持30min，然后在55～60℃下烘8h，干燥结束后进行自然冷却降温，制得香水莲花干花；

　　3.4.2)香水莲花花茶中挥发性香气物质种类及含量检测分析

　　取0.5g香水莲花干花用l00mL 100℃热水冲泡l0min，制得花茶，采用顶空固相微萃取- 气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术检测分析花茶水溶液中挥发性香气物质，统计所测得的挥发性香气物质种类为TVi，挥发性香气物质总相对含量TTi，结果见表4、图10～13所示。

　　表4不同品种香水莲花茶挥发性香气物质种类及含量

　　可见，‘黄花型’香水莲花花茶中挥发性香气物质的种类和总相对含量均要高于其他品种，其挥发性香气物质的种类达到70种，相对含量达到88.16％。因此，当检测到香水莲花花茶的挥发物质种类和总相对含量均不低于上述测定值，即香水莲花花茶的挥发性香气物质种类不低于70种，挥发性香气物质的总相对含量不低于88％，则该品种香水莲花茶的茶香更为丰富，更适宜作为花香优良种质资源。

　　本实施例通过步骤1)和步骤2)所述的表观检测(花型、花茶茶色、茶香、花色)初步筛选茶香优良的香水莲花品种，然后在初筛基础上，结合4项辅助筛选手段从香水莲花香水莲花盛花期S3花朵的花香物质成分、花瓣香气分泌结构、四个花期(花蕾期S1、初花期S2、盛花期S3和末花期S4)花香相关基因DXR、LIS、LOX和PMK的表达水平，香水莲花花茶风味等层面进行精确筛选，4项辅助筛选手段筛选结果与初筛结果一致，此筛选方法确定的香水莲花花香优良品种更加准确，为选择合适的香水莲花花香优良品种提供了科学依据；而且该筛选方法筛选周期短、为芳香植物园、芳香园艺疗法及香水莲花花茶的制作、芳香精油提取等领域筛选花香优良香水莲花种质资源提供了技术支撑，具有良好的应用价值。

　　以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

　　序列表

　　<110> 江苏开放大学（江苏城市职业学院）南京林业大学

　　<120> 一种筛选香水莲花花香优良品种的方法

　　<160> 10

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 18

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

　　<400> 1

　　agcgaggtca gcaggcaa 18