一种基于分光谱技术的荧光寿命成像方法和装置
技术领域
本发明属于荧光寿命成像领域，特别涉及一种基于分光谱技术的荧光寿命成像方法和装置。
背景技术
在生物医学成像领域，超分辨荧光成像一直是生物医学研究的重点，通过对生物分子的特殊标记，荧光光学显微镜在观察亚细胞结构中扮演着重要的角色。对于荧光信息而言，主要具有四个基本的物理维度，包括强度信息，波长信息(吸收光谱和发射光谱)，寿命信息和偏振信息。由于荧光标记的特异性，仅通过对强度信息的获取即可得到标记结构的高对比度的结果，因此目前的大部分成像技术都针对的是强度信息。除了强度信息外，波长信息也广泛应用在有关超分辨成像领域当中，比如受激辐射损耗超分辨显微术(STED)、单分子定位超分辨显微术(SMS，包括PALM和STORM)，利用荧光的吸收与发射谱的不同，实现强度上的“开关”调制。而对偏振方面，目前也有相关偏振调制来实现超分辨显微成像的方法。而除了这些信息之外，寿命信息同样是荧光分子非常重要的物理维度，由于荧光寿命信息是荧光分子的本征信息，它不受其本身荧光分子的密度或者激发光强的影响，而只对成像的微环境做出响应，比如pH值、钙离子浓度、温度、氧浓度、折射率、黏性等等，因此在需要对环境参数进行定量分析时，对荧光分子进行寿命成像比普通的强度成像更具有研究意义。
在目前的成像领域，荧光寿命成像的应用主要包括两个方面，一个方面是利用寿命信息去观测分子量级的运动，比如对荧光分子对的荧光共振能量转移(FRET)的探测，能够应用于研究蛋白质与细胞的相互作用；另一个方面，荧光寿命也可以与共聚焦成像、STED成像的相关超分辨成像技术相结合，为普通强度信息增加一个新的信息维度，同时也可以利用寿命信息来提高相关成像技术的成像分辨率。因此寿命成像对于现代多信息维度成像技术具有很重要的潜力。
目前的荧光寿命测量主要包括两类，一类是时域寿命测量成像，另一类是频域寿命测量成像，两类方法的本质是相同的。对于频域寿命成像，目前更多的应用在宽场成像当中，虽然速度快，但是受到分辨率的限制；对于时域寿命成像，主要应用与点扫描成像系统当中，适用于更为灵活、大的动态范围和长寿命的样品，目前应用最广泛的时域寿命系统是基于共聚焦成像系统和TCSPC计数装置的寿命测量系统，如图1所示，公开号为CN108120702A提供的超分辨荧光寿命成像装置，它能够提供较好的寿命成像分辨率，同时能够灵活的测量各种动态范围的长短寿命样品。然而这种基于共聚焦和TCSPC计数器的寿命系统同样存在着限制，最关键的是成像速度的限制。由于探测器和TCSPC的死程时间的影响，为了避免光子堆积对寿命产生的影响，必须将光强调弱，同时又为了获得足够多的光子数来得到寿命信息，因此必须延长单点探测时长，因此导致成像速度受到限制，从而很难运用在实时寿命成像当中。
发明内容
本发明提供了一种基于分光谱技术的荧光寿命成像方法和装置。本装置结构紧凑简单，基于普通共聚焦系统即可进行改装；实现了寿命的快速准确计算，极大的抑制了光子堆积效应对寿命的影响；通过和并行探测结合，还可以进一步提升寿命的成像分辨率和成像速度。
本发明在传统的共聚焦系统(图1)的基础上，提出了利用分光谱技术将荧光进一步细分到不同的光谱段，对不同光谱的光子利用不同的探测器或者计数器接收，由于荧光发射谱具有一定的波段范围，并且分布较为均匀(如图4所示)，可以通过分光谱技术将荧光分子分开到不同的通道，从而能够缓解和抑制单通道计数器或者探测器的死程时间造成的光子堆积效应，从而提高了分子的探测效率，进而实现寿命成像的速度提升。
本发明采用的具体技术方案如下：
一种基于分光谱技术的荧光寿命成像装置，包括光源，会聚所述光源发出的激发光并激发样品发出荧光的显微物镜，设置有：
分光谱模块，用于将所述显微物镜收集的荧光进行分光谱；
探测模块，用于接收分光谱后不同波段的荧光分子；
计数模块，用于对荧光分子进行光子计数，并计算荧光寿命信息。
进一步的，所述的光源与显微物镜之间依次设有：
用于保证激发光出射偏振方向不变的保偏光纤；
用于将经保偏光纤单模输出的激发光准直扩束的准直镜；
用于将激发光调整为圆偏振光的1/2波片和1/4波片；
用于实现对样品扫描的振镜系统；
用于实现对光束扩束和点扫描的4f系统。
本申请的装置中，还设置有：
用于反射激发光、透射荧光的二色镜；
用于滤去背景噪声、提高成像信噪比的窄带滤光片；
用于实现对荧光进行分光谱的分光谱模块；
用于对荧光进行收集并探测的探测模块，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；
用于对光子进行计数、由荧光寿命计算的时间相关单光子计数器(TCSPC)组成的计数模块；
并设有用于控制激光光源、振镜系统、分光模块、探测模块和计数模块的控制系统。
可选的，所述的分光谱模块为分光谱仪、分光棱镜或分光光栅。
可选的，收集的荧光经多模光纤后进入所述的分光谱模块。
可选的，所述的探测模块为包含多个探测器的探测器阵列，探测器为光电倍增管或雪崩光电二极管。
可选的，所述的计数模块为时间相关单光子计数器或时间相关单光子计数器阵列；
所述时间相关单光子计数器阵列内的每个时间相关单光子计数器分别连接一探测器。
可选的，收集的荧光经多模光纤束后进入所述的分光谱模块，所述的多模光纤束包括一中心光纤和多根边缘光纤，中心光纤收集到的荧光信号送至分光谱模块中，边缘光纤收集到的荧光直接送至探测模块内。
本申请的装置中，具体步骤过程如下：
1)对激光器发出的激光光束在经过保偏光纤后进行准直；
2)光束通过1/2波片和1/4波片，变成圆偏振光；
3)光束经过二色镜反射后进入振镜系统，实现光束最终在物面的扫描；
4)光束从振镜系统出来后在经过扫描镜和场镜组成的4f系统扩束后，经过大数值孔径的浸油物镜后会聚在样品表面激发荧光样品产生荧光；
5)激发出来的荧光沿原光路返回后，透过二色镜，经过窄带滤波片滤光，然后进入分光谱模块，将荧光进一步细分到不同的波段通道；分光谱模块可以直接使用相关公司的分光谱仪，可以采用分光棱镜将荧光按光谱分开，也可以利用光栅实现分光谱；细分到不同波段的荧光分子被相对应探测器接收，并将不同光谱通道的光子送到计数模块TCSPC记录时间信息(可由一个TCSPC接收或者多个TCSPC接收)，实现寿命信息的收集。
6)将多波段的荧光时间信息进行整合，得到整体的荧光寿命信息，由此缓解了单通道由于死程时间带来的光子堆积效应，实现荧光寿命成像速度的提升。进一步将荧光信息与并行探测结合，可以进一步提升寿命成像速度和分辨率。
另外，本发明还提供一种基于分光谱技术的荧光寿命成像方法，包括步骤：
1)将光源发出的激发光会聚在样品表面激发荧光样品产生荧光；
2)收集所述的荧光并按波段分光谱；
3)利用探测器接收不同波段的荧光分子，并计算各波段的寿命信息；
4)将多波段的荧光时间信息进行整合，得到整体的荧光寿命信息。
可选的，光源发出的激发光通过准直，转换为圆偏振光，并经扩束后会聚在样品表面。
本发明的原理如下：
在传统的基于共聚焦系统和TCSPC的时域寿命测量成像系统(图1)中，荧光分子在经过会聚透镜会聚后直接被探测器接收，然后由探测器将光子信息送到TCSPC中，TCSPC记录光子相对于激发光原始的同步脉冲的时间信息，构建了光子到达时间的分布曲线，通过拟合曲线得到最终的荧光寿命信息。在单探测器、单TCSPC的情况下，在不考虑光子堆积效应的理想情况下，荧光寿命曲线可以表达为光子数I相对于光子到达时间(光子相对于同步脉冲被探测器识别的时间)的衰减函数：
I(t)＝I0e-t/τ，
其中I0为t＝0时的光子数，τ即为荧光寿命，IRF为寿命测量系统的时间相应函数(Instrument Respond Function，IRF)。如前文所说，由于探测器(APD或者PMT)和计数器(TCSPC)存在死程时间，即探测器或计数器在处理了第一个光子后会有一段时间无法处理下一个光子，因此在死程时间范围内到达探测器或者计数器的光子会被丢失，造成光子堆积效应，使得光子探测效率下降，会使得寿命曲线发生畸变，由于衰减函数本身的特性，光子到达时间更短的光子更多，因此这类光子丢失的也会更多，导致荧光寿命向着更短寿命的趋势发生畸变(如图5所示)，可表达为：
其中μ为平均光子率，而多出的
α＝1-e-u/μ
由此可见，在光子率较高的情况下，有效光子探测计数效率会下降，从而使得荧光寿命曲线发生畸变。因而在传统的荧光寿命测量系统中，为了避免光子堆积效应带来的畸变，会将光强开的较低(光子率在光脉冲频率的1％左右，即大约100个脉冲得到一个光子)并且延长光子接收时间，这样造成的结果则是寿命测量时间长，很难应用在高速实时寿命成像中。
而本申请则利用荧光光谱分布将荧光进一步分开至不同通道当中，从而缓解单通道情况下的光子堆积效应。在共聚焦系统中，激发出来的荧光并非单色光而是存在一定光谱范围的宽波段荧光，以荧光染料Alexa Fluor488为例，如图4所示，其荧光谱涵盖了480-650nm的波段范围，而经过探测器前的窄带滤波片(以激发光波长为488nm为例，滤波片的范围一般为500-550nm)之后，荧光依然为500-550nm的宽波段光并且分布较为均匀。在传统共聚焦荧光寿命测量系统中，荧光的波长信息并没有被利用，而本专利则充分利用宽波段带来的波长信息，利用分光谱技术将这一部分荧光进一步细分至不同波段对应的探测通道中，到达探测器的光子波长与其荧光光谱各细分波段的相对概率大小有关，因此通过细分波段可以极大的缓解但探测器情况下的光子堆积效应，提升有效光子探测计数率：
pi＝Si/S,
其中pi为荧光信号经过分光谱后分到不同通道的概率，S和Si分别表示滤波片之后光谱曲线的面积和某单通道对应的光谱波段的光谱曲线面积，α'为本申请利用分光谱技术后的有效光子探测计数率。如图5所示，在经过分光谱技术将光子分到多通道后，使用同一个计数器TCSPC(即多个探测器接收的光子的时间信息由同一个TCSPC处理)进行计数，荧光寿命曲线在光子率较大的情况下畸变得到了很好的缓解；尽管在某些情况下有效光子探测计数率并没有那么大的提升，但是由于荧光光谱的分布相对平均，在概率的角度上光子在各个波段的分布比较均匀，因此多通道的使用率非常高，对探测器的死程时间带来的堆积效应有着很显著的缓解。而在目前的寿命测量系统中，往往探测器的死程时间比TCSPC的死程时间长，因此对探测器的堆积效应的抑制对寿命成像速度的提升效果非常显著。
在本专利的更多实施例中，还将多通道的光子分别接到不同的计数器TCSPC中，此时进一步缓解TCSPC的堆积效应，能够更进一步提升寿命成像速度。
而将多通道分光谱技术与并行探测成像技术相结合，可以同时提升寿命成像速度和成像分辨率。利用并行探测，即探测器阵列和TCSPC阵列对光子进行接收和时间计数，可以提升成像分辨率和寿命成像速度，但此时仍然存在一个限制，光子由于满足泊松分布，在探测端面的空间分布与其系统的点扩散函数成相关关系，因此实际上中间探测器(位于光轴上的探测器)接收光子的数量要远多于其他探测器，无法像光谱对光子实现较为均匀的分布，因此中心探测器产生的堆积效应会限制寿命成像速度的提升。而本专利的实施例中将要进入中心探测器的荧光信号进一步利用分光谱技术分成多通道，在利用并行探测实现分辨率提升的同时，可以相对于并行探测更进一步的缓解光子堆积效应，实现寿命成像速度的进一步提升。
相对于现有的技术，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)在传统的共聚焦基础上进行了简单的改进，系统较为简单，且适用于一切荧光寿命成像系统；
(2)利用分光谱技术缓解了光子堆积效应，实现了寿命成像速度的提升；
(3)与并行探测相结合，在实现寿命成像分辨率提升的同时，更进一步提升了寿命成像速度。
附图说明
图1为传统的基于共聚焦点扫描系统和TCSPC的时域寿命测量成像系统装置示意图；
图2为本发明中基于分光谱探测模块的时域寿命测量成像系统装置实例图，系统同样基于共聚焦点扫描系统，采用一个TCSPC进行计数；
图3为本发明中两种不同的分光谱探测模块系统装置图，其中(a)为基于分光棱镜的分光谱探测模块，(b)为基于光栅的分光谱探测模块；
图4为本发明实施例中分光谱示意图，(a)为实施例所用荧光染料(Alexa Fluor488)的荧光光谱分布，(b)为对该染料所产生的荧光信号经过8通道分光谱仪分光谱接收示意图；
图5为实施例中分光谱探测寿命系统相比较于传统共聚焦寿命探测系统的寿命测量结果图，(a)为绝对光子数寿命曲线图，(b)为光子数标准化寿命曲线图；
图6为本发明中基于分光谱探测并行计数模块的时域寿命测量成像系统装置实例图，系统基于共聚焦点扫描系统；
图7为本发明中基于分光谱探测模块和并行探测模块的时域寿命测量成像系统装置实例图。系统基于共聚焦点扫描系统，分光谱探测模块采用一个TCSPC进行计数；
图8为实施例中光纤端面分布，其中中心光纤C接入分光光谱探测模块，边缘光纤E接入并行探测模块；
图9为实施例中分光谱探测、并行探测系统相比较于传统共聚焦寿命探测系统和并行探测系统的寿命测量结果图，(a)为绝对光子数寿命曲线图，(b)为光子数标准化寿命曲线图；
图10为本发明中基于分光谱探测并行计数模块和并行探测模块的时域寿命测量成像系统装置实例图，系统基于共聚焦系统点扫描系统。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
如图2所示为一种基于分光谱探测模块的时域寿命测量成像系统装置示意图，包括：488nm激光器1，单模保偏光纤2，准直透镜3，1/2波片4，1/4波片5，二色镜6，振镜扫描系统7，扫描镜8，场镜9，高数值孔径物镜10，样品台12，反射镜13，窄带滤波片14，会聚透镜15，小孔16，多模光纤17，分光谱模块18，探测器阵列19，时间相关单光子计数器(TCSPC)20和控制系统21。
其中，1/2波片4、1/4波片5可以将激发光的偏振状态调整至圆偏振光，从而提高样品的激发效率；扫描镜8和场镜9组成了4f系统，使得入射激发光的光束大小匹配物镜的数值孔径，并且保证在物镜入瞳位置为平行光，同时确保振镜扫描系统7的振镜反射面与高数值孔径物镜10的入瞳面共轭，从而确保在扫描成像过程中光线偏转所带来的畸变最小。
其中，在由反射镜13、窄带滤波片14、会聚透镜15、小孔16和多模光纤组成的探测光路中，窄带滤波片的通光波段需要匹配分光谱模块的有效光波段，小孔大小的大小为系统对应艾里光斑的0.8倍左右，确保系统的成像分辨率和信噪比。
其中，分光谱模块18和探测器阵列19组成的分光谱探测模块的示意图如图3所示，可以为(a)、(b)两种方式实现分光谱。图3(a)的分光谱模块由透镜22、分光棱镜23和凹面反射镜24构成，荧光从多模光纤17出来后经过透镜22准直成平行光，经过分光棱镜23后，由于光的色散特性，分光棱镜的折射率对于不同入射波长的荧光不同，从而将宽波段荧光分解成单色光带，在经过凹面反射镜反射会聚后，将不同波段的荧光会聚到探测器阵列19中的不同的探测器中，从而实现将荧光信号按照光谱分散到不同的探测器中(图4(b))。右图的原理与左图类似，图3(b)的分光谱模块由透镜25、分光光栅26和凹面反射镜27构成，荧光从多模光纤17出来后经过透镜25准直后成为平行光，然后打在光栅26上，光栅通过多缝衍射原理是光发生色散现象，从而宽波段荧光分解成单色光带，在经过凹面反射镜反射会聚后，不同波段的荧光会聚到探测器阵列19中的不同的探测器被收集(图4(b))。需要注意的是，为便于描述，图3中仅表达了四通道分光谱，而本发明实施例中采用的是8通道分光谱模块实现兑现荧光波段的细分(如图4(b)所示)。
其中，TCSPC 20在控制器21的控制下，与激光器1同步，从而能够计算出光子到达计数器时相对于激光脉冲的时间差，从而得到荧光的时间信息，得到荧光的寿命曲线(图5)。
本实施例中，显微物镜10的数值孔径NA＝1.4；采用的荧光样品为Alex Fluor488，其荧光光谱分布如图4(a)中所示；窄带滤波片14用的是通过500-550nm的窄带滤波片；分光谱模块可以将500-550nm波段的荧光分成从短到长8个通道，其每个通道相对应的光谱密度如图4(b)所示。
采用图2所示装置实现超分辨荧光成像的过程如下：
激光器发出的激发光经过单模保偏光纤5通过准直透镜6平行出射，经过1/2波片4和1/4波片5后偏振被调制为圆偏振光，而圆偏振激发光可以提高样品的激发效率。激发光在经过二色镜6反射后进入振镜扫描系统7实现在最终样品面的二维扫描。激发光从振镜系统7出来后经过扫描镜8和场镜9后被高数值孔径物镜10会聚成衍射极限限制的激发光斑，会聚光斑激发固定在样品台12上的荧光样品11，产生的荧光再次被高数值孔径物镜10收集，按照原光路返回再次经过场镜9、扫描镜8和振镜系统7，透过二色镜6后被反射镜13反射，经过窄带滤波片后被会聚透镜15会聚到多模光纤17中被收集，同时小孔16的存在确保了共聚焦成像的分辨率保障。荧光信号被多模光纤17收集后进入分光谱模块18然后被按照光谱分配到不同的通道被探测器阵列19接收，接收的光子以电信号方式进入TCSPC 20被计数，最终得到寿命成像图。
分光谱模块采用的是8通道分光谱实现对500-550nm波段的荧光(图4(a))的分离，8个通道对应的荧光波段宽度基本相同，荧光光子进入不同通道的概率由实施例所用染料Alexa Fluor 488的荧光光谱密度决定，如图4(b)所示。通过图4(b)可知，由于荧光光谱密度曲线较为平缓，事实上荧光可以较为均匀的分不到各个通道或者探测器中，因此在光子率较高的情况下，分光谱并行探测可以极大的缓解单探测器的光子堆积效应，从而使得寿命测量更为准确，如图5所示，在不考虑计数器TCSPC死程时间影响的前提下(目前市场上许多TCSPC的死程时间要远小于探测器，因此在大部分时间情况下可以忽略)，相比较于单探测器寿命曲线已经发生了畸变，本发明实施例采用分光谱并行探测可以显著的提高光子的探测效率，更为显著的是能够得到几乎理想的荧光寿命曲线，提高了高光子率的情况下荧光寿命测量的准确性。在图5的仿真中，(a)为绝对光子数寿命曲线图，(b)为光子数标准化寿命曲线图；光子率为800MHz，每个探测器的死程时间为40ns，TCSPC的死程时间忽略不计。由此，不难得到采用分光谱并行探测模块测量寿命，可以通过提高激发光强实现寿命成像的速度。
实施例2
如图6为一种基于分光谱探测并行计数模块的时域寿命测量成像系统装置示意图，包括：488nm激光器1，单模保偏光纤2，准直透镜3，1/2波片4，1/4波片5，二色镜6，振镜扫描系统7，扫描镜8，场镜9，高数值孔径物镜10，样品台12，反射镜13，窄带滤波片14，会聚透镜15，小孔16，多模光纤17，分光谱模块18，探测器阵列19，时间相关单光子计数器阵列(TCSPC阵列)20和控制系统21。
其中，1/2波片4、1/4波片5可以将激发光的偏振状态调整至圆偏振光，从而提高样品的激发效率；扫描镜8和场镜9组成了4f系统，使得入射激发光的光束大小匹配物镜的数值孔径，并且保证在物镜入瞳位置为平行光，同时确保振镜扫描系统7的振镜反射面与高数值孔径物镜10的入瞳面共轭，从而确保在扫描成像过程中光线偏转所带来的畸变最小。
其中，在由反射镜13、窄带滤波片14、会聚透镜15、小孔16和多模光纤17组成的探测光路中，窄带滤波片的通光波段需要匹配分光谱模块的有效光波段，小孔大小的大小为系统对应艾里光斑的0.8倍左右，确保系统的成像分辨率和信噪比。
其中，分光谱模块18和探测器阵列19组成的分光谱探测模块的示意图如图3所示。需要注意的是，为便于描述，图3中仅表达了四通道分光谱，而本发明实施例中采用的是8通道分光谱模块实现兑现荧光波段的细分(如图4(b)所示)。而每个探测器与TCSPC阵列20中的每个TCSPC相连构成并行计数模块，在控制器21的控制下，与激光器1同步，从而能够计算出光子到达计数器时相对于激光脉冲的时间差，从而得到荧光的时间信息，得到荧光的寿命曲线。
本实施例中，显微物镜10的数值孔径NA＝1.4；分光谱模块可以将荧光分成从短到长8个相同波段长度的通道。
采用图6所示装置实现超分辨荧光成像的过程如下：
激光器发出的激发光经过单模保偏光纤5通过准直透镜6平行出射，经过1/2波片4和1/4波片5后偏振被调制为圆偏振光，而圆偏振激发光可以提高样品的激发效率。激发光在经过二色镜6反射后进入振镜扫描系统7实现在最终样品面的二维扫描。激发光从振镜系统7出来后经过扫描镜8和场镜9后被高数值孔径物镜10会聚成衍射极限限制的激发光斑，会聚光斑激发固定在样品台12上的荧光样品11，产生的荧光再次被高数值孔径物镜10收集，按照原光路返回再次经过场镜9、扫描镜8和振镜系统7，透过二色镜6后被反射镜13反射，经过窄带滤波片后被会聚透镜15会聚到多模光纤17中被收集，同时小孔16的存在确保了共聚焦成像的分辨率保障。荧光信号被多模光纤17收集后进入分光谱模块18然后被按照光谱分配到不同的通道被探测器阵列19接收，探测器阵列19中每个探测器接收的光子以电信号方式分别进入TCSPC阵列20中的每个TCSPC被计数，最终得到寿命成像结果。
本实施例针对的是当TCSPC本身存在较大的光子堆积效应(即TCSPC的死程时间相较于探测器的死程时间无法忽略)时，此时如果分光谱模块并行探测后光子依然进入同一个TCSPC中，TCSPC的光子堆积效应会大大限制分光谱并行探测模块带来的堆积效应抑制效果，成像速度依然会受到光子堆积效应的影响而受到限制。而在本实施例中，探测器阵列19中的每个探测器都与TCSPC阵列20中的每个TCSPC相连，相较于实施例1中多个探测器连接同一个TCSPC，本实施例可以更进一步提升经过分光谱后每个探测器和TCSPC的计数效率，进一步缓解系统的光子堆积效应，提高光子探测效率，进一步提升寿命成像速度。
实施例3
如图7所示为一种基于分光谱探测模块和并行探测模块的时域寿命测量成像系统装置示意图，包括：488nm激光器1，单模保偏光纤2，准直透镜3，1/2波片4，1/4波片5，二色镜6，振镜扫描系统7，扫描镜8，场镜9，高数值孔径物镜10，样品台12，反射镜13，窄带滤波片14，会聚透镜15，多模光纤束17，分光谱模块18，探测器阵列19，时间相关单光子计数器(TCSPC)阵列20和控制系统21。
其中，1/2波片4、1/4波片5可以将激发光的偏振状态调整至圆偏振光，从而提高样品的激发效率；扫描镜8和场镜9组成了4f系统，使得入射激发光的光束大小匹配物镜的数值孔径，并且保证在物镜入瞳位置为平行光，同时确保振镜扫描系统7的振镜反射面与高数值孔径物镜10的入瞳面共轭，从而确保在扫描成像过程中光线偏转所带来的畸变最小。
其中，在由反射镜13、窄带滤波片14、会聚透镜15和多模光纤束17组成的探测光路中，窄带滤波片的通光波段需要匹配分光谱模块的有效光波段，多模光纤束17的端面如图8所示，其中中心光纤C将收集到的荧光信号送至分光谱模块18中，边缘光纤E将收集到的荧光直接送至探测器阵列19中的对应探测器中，每个光纤的大小等效为系统对应艾里光斑的0.3倍左右，多模光纤束17中的边缘光纤E和探测器阵列19组成的并行探测模块实现了荧光强度成像的分辨率、信噪比的提升。
其中，多模光纤束17的中心光纤C连接至的分光谱模块18和探测器阵列19中的相关探测器组成的分光谱探测模块的示意图如图3所示。需要注意的是，为便于描述，图3中仅表达了四通道分光谱，而本发明实施例中采用的是8通道分光谱模块实现兑现荧光波段的细分(如图4(b)所示)。在该分光谱模块中的探测器与TCSPC阵列20中的单个TCSPC相连，探测器阵列19中其他探测器分别收集多模多模光纤束17边缘光纤E中的荧光信号，并且分别连接TCSPC阵列20中的其他TCSPC，在控制器21的控制下，与激光器1同步，从而能够计算出光子到达计数器时相对于激光脉冲的时间差，从而得到荧光的时间信息，得到荧光的寿命曲线，如图9所示，(a)为绝对光子数寿命曲线图，(b)为光子数标准化寿命曲线图。
本实施例中，显微物镜10的数值孔径NA＝1.4；采用的荧光样品为Alex Fluor488，其荧光光谱分布如图4(a)中所示；窄带滤波片14用的是通过500-550nm的窄带滤波片；分光谱模块可以将500-550nm波段的荧光分成从短到长8个通道，其每个通道相对应的光谱密度如图4(b)所示。
采用图7所示装置实现超分辨荧光成像的过程如下：
激光器发出的激发光经过单模保偏光纤5通过准直透镜6平行出射，经过1/2波片4和1/4波片5后偏振被调制为圆偏振光，而圆偏振激发光可以提高样品的激发效率。激发光在经过二色镜6反射后进入振镜扫描系统7实现在最终样品面的二维扫描。激发光从振镜系统7出来后经过扫描镜8和场镜9后被高数值孔径物镜10会聚成衍射极限限制的激发光斑，会聚光斑激发固定在样品台12上的荧光样品11，产生的荧光再次被高数值孔径物镜10收集，按照原光路返回再次经过场镜9、扫描镜8和振镜系统7，透过二色镜6后被反射镜13反射，经过窄带滤波片后被会聚透镜15会聚到多模光纤束17中被收集，其中多模光纤束的另一端的连接并不相同：如图8所示，多模光纤束17中心光纤C将荧光信号送至分光谱模块18中，分光谱模块将该部分荧光按照光谱分配至8个不同的通道被探测器阵列19中对应的8个探测器接收，8个探测器连接至TCSPC阵列20中的单个TCSPC构成分光谱并行探测寿命测量模块；而多模光纤束17中的其他6根边缘光纤E则将荧光信号送至探测器阵列19中对应的其他6个探测器接收，分别与TCSPC阵列20中的6个TCSPC相连构成并行探测寿命测量模块。将两个模块得到的荧光强度信息和时间信息结合处理，得到超分辨荧光寿命成像结果。
在本实施例中，对目前已有的并行探测寿命测量系统进行进一步升级，引入本发明分光谱技术，实现荧光寿命成像速度的进一步提升。在实施例中的多模光纤束17中，根据艾里光斑光强分布规律中心光纤C将收集到最多的信号(约占总荧光信号的40％)，边缘光纤E则收集到大概10％的荧光信号。因此对于目前已经存在并行探测寿命测量系统，对于光子堆积效应的缓解程度仍然受到了中心探测器的限制，光子更为集中的进入到中心探测器中不利于光子堆积效应的缓解。因此在本实施例中，边缘光纤E收集的荧光信号仍然正常进入到相应的探测器和TCSPC中组成并行探测寿命测量系统，而中心光纤C则与分光谱模块相连，按照光谱分解到8个通道中被8个不同的探测器收集，最后被TCSPC计数，从而构成分光谱探测模块，利用分光谱仪将荧光信号进一步分解到不同的探测器中，另一个方面光谱密度分布比艾里光斑荧光密度分布要更为平缓，因此荧光信号经过分光谱模块分到不同的探测器比空间上的并行探测更为平均，对于光子堆积效应的缓解能力更强。在本实施例中，考虑使用的TCSPC死程时间远小于探测器的死程时间，因此可以忽略，故而分光谱探测模块中的8个探测器连接到同一个TCSPC中。如图9所示，在高光子率的情况下，利用本实施例的系统(并行探测分光谱寿命曲线)得到的寿命曲线明显优于采用单探测器或者单纯采用并行探测得到的寿命曲线。本实施例可以更进一步缓解系统中的光子堆积效应，减小死程时间对于寿命测量的影响，提高光子探测效率，从而在高光子率的情况下得到准确的荧光寿命曲线，因此可以显著提升荧光寿命成像的速度。在图9的仿真中，光子率为800MHz，每个探测器的死程时间为40ns，TCSPC的死程时间忽略不计。
综合而言，本实施例中并行探测本身能够带来荧光强度成像分辨率和信噪比的提升，而分光谱技术的引入并与并行探测结合能够更加显著的提升寿命成像的精度和速度，具备实现实时超分辨寿命成像的潜力。
实施例4
如图10所示为一种基于分光谱探测并行计数模块和并行探测模块的时域寿命测量成像系统装置示意图，包括：488nm激光器1，单模保偏光纤2，准直透镜3，1/2波片4，1/4波片5，二色镜6，振镜扫描系统7，扫描镜8，场镜9，高数值孔径物镜10，样品台12，反射镜13，窄带滤波片14，会聚透镜15，多模光纤束17，分光谱模块18，探测器阵列19，时间相关单光子计数器(TCSPC)阵列20和控制系统21。
其中，1/2波片4、1/4波片5可以将激发光的偏振状态调整至圆偏振光，从而提高样品的激发效率；扫描镜8和场镜9组成了4f系统，使得入射激发光的光束大小匹配物镜的数值孔径，并且保证在物镜入瞳位置为平行光，同时确保振镜扫描系统7的振镜反射面与高数值孔径物镜10的入瞳面共轭，从而确保在扫描成像过程中光线偏转所带来的畸变最小。
其中，在由反射镜13、窄带滤波片14、会聚透镜15和多模光纤束17组成的探测光路中，窄带滤波片的通光波段需要匹配分光谱模块的有效光波段，多模光纤束17的端面如图8所示，其中中心光纤C将收集到的荧光信号送至分光谱模块18中，周围的其他光纤E将收集到的荧光直接送至探测器阵列19中的对应探测器中，每个光纤的大小等效为系统对应艾里光斑的0.3倍左右，多模光纤束17中的边缘光纤E和探测器阵列19组成的并行探测模块实现了荧光强度成像的分辨率、信噪比的提升。
其中，多模光纤束17的中心光纤C连接至的分光谱模块18和探测器阵列19中的相关探测器组成的分光谱探测模块的示意图如图3所示。需要注意的是，为便于描述，图3中仅表达了四通道分光谱，而本发明实施例中采用的是8通道分光谱模块实现兑现荧光波段的细分(如图4(b)所示)。在该分光谱探测模块中探测器阵列19中的相应的8个探测器与TCSPC阵列20中的相应的8个TCSPC相连，构成分光谱探测并行计数模块，探测器阵列19中其他探测器分别收集多模光纤束17边缘光纤E中的荧光信号，并且分别连接TCSPC阵列20中的其他TCSPC，在控制器21的控制下，与激光器1同步，从而能够计算出光子到达计数器时相对于激光脉冲的时间差，从而得到荧光的时间信息，得到荧光的寿命信息。
本实施例中，显微物镜10的数值孔径NA＝1.4；分光谱模块可以将荧光分成从短到长8个相同波段长度的通道。
采用图10所示装置实现超分辨荧光成像的过程如下：
激光器发出的激发光经过单模保偏光纤5通过准直透镜6平行出射，经过1/2波片4和1/4波片5后偏振被调制为圆偏振光，而圆偏振激发光可以提高样品的激发效率。激发光在经过二色镜6反射后进入振镜扫描系统7实现在最终样品面的二维扫描。激发光从振镜系统7出来后经过扫描镜8和场镜9后被高数值孔径物镜10会聚成衍射极限限制的激发光斑，会聚光斑激发固定在样品台12上的荧光样品11，产生的荧光再次被高数值孔径物镜10收集，按照原光路返回再次经过场镜9、扫描镜8和振镜系统7，透过二色镜6后被反射镜13反射，经过窄带滤波片后被会聚透镜15会聚到多模光纤束17中被收集，其中多模光纤束的另一端的连接并不相同：如图8所示，多模光纤束17中心光纤C将荧光信号送至分光谱模块18中，分光谱模块将该部分荧光按照光谱分配至8个不同的通道被探测器阵列19中对应的8个探测器接收，8个探测器连接至TCSPC阵列20中的对应的8个TCSPC构成分光谱探测并行计数模块；而多模光纤束17中的其他6根边缘光纤E则将荧光信号送至探测器阵列19中对应的其他6个探测器接收，分别与TCSPC阵列20中的6个TCSPC相连构成并行探测寿命测量模块。将两个模块得到的荧光强度信息和时间信息结合处理，得到超分辨荧光寿命成像结果。
本实施例针对的是当TCSPC本身存在较大的光子堆积效应(即TCSPC的死程时间相较于探测器的死程时间无法忽略)时，此时如果分光谱探测模块得到光子依然进入同一个TCSPC中，TCSPC的光子堆积效应会大大限制分光谱并行探测模块带来的堆积效应抑制效果，成像速度依然会受到光子堆积效应的影响而受到限制。而在本实施例中，探测器阵列19中的每个探测器都与TCSPC阵列20中的每个TCSPC相连，相较于实施例3中多个探测器连接同一个TCSPC，本实施例可以更进一步提升经过分光谱后每个探测器和TCSPC的计数效率，进一步缓解系统的光子堆积效应，提高光子探测效率，进一步提升寿命成像速度。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
