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用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原和间接ELISA检测试剂盒

2021-02-02 12:48:39

用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原和间接ELISA检测试剂盒

　　技术领域

　　本发明涉及疫苗领域，具体而言，涉及一种用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原和间接ELISA检测试剂盒。

　　背景技术

　　牛支原体是一种重要的致病性支原体，能够导致牛乳腺炎、牛肺炎、关节炎、生殖道炎症、不孕不育等疾病，牛在感染支原体后会伴随其他病原的感染，影响牛的生产能力，严重危害畜牧养殖业的健康发展，目前已经成为危害养牛业的重要的病原之一。

　　牛支原体引起的牛支原体肺炎是以坏死性肺炎为主要特征的牛呼吸道传染病。病牛体温升高至42℃，精神沉郁、食欲减退、气喘、剧烈咳嗽，有的继发腹泻，有的继发关节炎、关节肿大等，严重者会出现死亡，一般来讲，犊牛病情较重，病死率可达50％。治疗牛支原体的药物多为抗生素，但难以有效降低支原体肺炎引起的犊牛死亡率，以及支原体在牛场的扩散及污染。

　　疫苗是控制牛支原体感染的有效措施，目前国内在研的项目中多以弱毒疫苗为主，虽然具有良好的免疫原性，但由于其属于活毒，很难完成牛场净化的目标。灭活疫苗由于采用化学方法使疫苗株灭活，使用后无论从保护效果，还是从安全性来讲，都是一个优先的选择。但针对其使用后与野毒的鉴别诊断，尚无准确的方法。

　　有鉴于此，特提出本发明。

　　发明内容

　　本发明的第一目的在于提供一组用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原。

　　本发明的第二目的在于提供上述抗原的应用。

　　本发明的第三目的在于提供一种鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒。

　　为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

　　一组用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原，所述抗原包括膜蛋白片段和亮氨酰氨基肽酶片段。

　　进一步地，编码所述膜蛋白片段序列如SEQ ID NO.1所示。

　　进一步地，编码所述亮氨酰氨基肽酶片段序列如SEQ ID NO.2所示。

　　上述抗原在制备鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的检测试剂中的应用。

　　一种鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，包括包被有上述抗原的ELISA酶标板；

　　所述检测试剂盒利用所述抗原分别对待测样本中膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量进行检测，如果膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量比值不小于阈值，则判断牛支原体疫苗株感染。

　　进一步地，阈值为1.8。

　　进一步地，膜蛋白片段的包被浓度为40-60μg/ml。

　　进一步地，亮氨酰氨基肽酶片段的包被浓度为70-90μg/ml。

　　进一步地，还包括阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、显色液、洗涤液、终止液中的至少一种。

　　进一步地，所述疫苗株为灭活疫苗；

　　优选地，所述待测样本为牛血清。

　　与现有技术相比，本发明的有益效果为：

　　本发明提供一组用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原，包括膜蛋白片段和亮氨酰氨基肽酶片段。发明人经过研究发现，在牛感染不同的病原(疫苗株和野毒株)后，只有膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的变化呈现一定的规律性，通过利用膜蛋白抗原和亮氨酰氨基肽酶抗原检测牛体内膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量，从而可以实现牛支原体疫苗株或野毒株感染的鉴别诊断，为疫苗株使用后与野毒株的鉴别提供了新的思路和技术手段。

　　附图说明

　　为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

　　图1为实施例1中目标片段的PCR扩增结果，其中，M:marker； 1:CONTROL；2:P275；3:pepA。

　　具体实施方式

　　下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

　　除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

　　发明人经过研究发现，在牛感染不同的病原(疫苗株和野毒株)后，只有膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的变化呈现一定的规律性，通过利用膜蛋白抗原和亮氨酰氨基肽酶抗原检测牛体内膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量，从而可以实现牛支原体疫苗株或野毒株感染的鉴别诊断，为疫苗株使用后与野毒株的鉴别提供了新的思路和技术手段。

　　为了实现膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体含量的准确检测，发明人分别对膜蛋白抗原和亮氨酰氨基肽酶抗原位点进行了分析、筛选和优化，提供了SEQ ID NO.1所示的优化后的膜蛋白(p275)基因序列，以及SEQ ID NO.2所示的优化后的亮氨酰氨基肽酶(pepA)基因序列。分别利用二者可以实现膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体含量的准确检测。

　　GGAATATTAGCGCCCGTCTTAGCTATTCCTTTAGTAGCTGCTAGTT GCAATAATGAATCTAAACTCAAAGATTTACAAACAAAGTATGAAAACA ACAGAAAATCAGTTATAGATTTTTTAAATTCAGAAGAAAAATATAGCTTTTTAAAAACATATGTTGATATTAAAAATGCTCTAAATGCTAAAGTTGAT ATTAAAAGTAGCAAAGAAATCAATAATTGAATAAAAAACACAAATGAT GCAATTTCTTCATATAAATCATTTAAAAATAGCATTGTTACAGTTAATGA AGATAAAGAAAAAAATACATTTTCTGCTTTTGATAACTTACTAGTTTTA TCATCTAAAGTATCTGAAAAGGGAAAAGGCTTTTTCCCTAAAACTATT ATAAATCAGCTTAAAAGTAAAAATTCATTTGCAGAACAAGTTAAATTA CTAAATTCCTTTTTAGAATCAAGCTTATTAAAAGTTAATGAAGAATCAT TGAAAGATATTTCAATAGATTTTGAAAACTCTGTCCCAAATGATTTTAT TAATTCAGTCAATGATGGGTTAACACTAACTTTTGTAATGAACAAAAA TGGAACTAAGCATTATGCACCCATAACATGAAAAAATATTGGTTTAAAT AATGTTGAAAAAGCTGATGATGTTCACAGCGATGAAATTGATTTATCA AAAGTAACTGAAAATGATAAAAATCATTATCTAGATGATAGCTTTATTA TTGGAAAAATATTTAAAAATGCAGCTTTTGGCACAGAACAAACTGCTG ATAAAATCTTTGAAAAAATAAATTCTATCGTTTCCCAAAGTAACGGTAA ATTAGACACAAATGAATTTAAGAAGAAAGCTGAAGAATTGAATAAAC TTTTTGCATTTGAAACAAATCTTGAAAATAACCCTAGTGTTTCATATTC ATTAATTGGCTCACATGCGCATTCAACTAAGGAATACCATTTTTACTTA ACAAAATATGTAAATAACGCTAAGGATTCAAAAATCAGTTTCATTGTTC ACAATCAAAAAAACAAT(SEQ ID NO.1)。

　　TTTGCTGATGAAACTAAATGCAATTTTTTAATTAAAAAAGACAAC AGCATAACTGAATATCATGAAAAGAATGAAGCATTAGTATATTTTAGTA AGAAAGAATCATTATCATTTTCTGACTTAGAAGGCTTTTTTAAAGGCTTAGCAGTAAATGCCAACAGAAATTATCAAGTTGATTTAGCTTCGTTTGC AACTGAAAAAGTTGAAATAGTTAAAGTTATTGATGCATTTGTTAGAGC AGTTTATTTTGCAAAGGGCGAAATATTTTCAGCTAGAAAAAAAGATGA AAAGGAAGAAATTGAATTAGTTCCATTTATTGAAACTATTTCTGAACA AGCTAACGCACAATTTAATAAATCGCTTATCTTAGCCAAAGCAACAAA TTTTGCTCGTGATTTACAAATTATGCCCCCAAATATTTGCAACTCTGAA TTTTTAGCTCAAAAAGTTGCTGAAGATTTAGAACAATACAAAAACTTG AAAGTTACTGTTTTAAAGAAAAAAGAAATCGAAGAGTTGAAGATGGG TCTTTTACTTTCAGTAAACAAAGGAAGTGTTTATGAACCTAGAGTTGT TGTTATTGAATACAATGGGGACAAAGATTCAAGTGAAAAGACTGTAAT GATTGGTAAAGGTATTACTTTTGATTCAGGTGGATACTCATTAAAACCT TCTAGATCAATGGTTTCAATGAAATTTGATATGTCTGGTTCAGCTATTG TTGCTGCTACAATGAAAGCTATTGCACAATTAAAACCAAAGAAAAATG TTTCTGCAATAATGTGCATTACTGATAACAGAGTTAACGGTGATGCTTC ACTTCCTGATTCAGTATGGGTAGCTATGAATGGCAAAAGTGTTGAAAT TAATAATACTGATGCTGAAGGAAGATTGGTTATGGCTGATGGCTTAGTT TACGGAGCAAAAGTGTTGAATGCCACTAGATTAATTGACGTTGCAACTTTAACTGGTGCTATGGTTGTTGCACTTGGACAGACATACACAGGCACA TGGGCAACTAGTGATAAAGCTTGAGAAGACATAAAGAAAGCTGCTGA AAATGCTAACGAATTAGTTTGAAGAATGCCGCTTGATAAAGCATTTGC AAAAAACATAAAATCTTCAAAAGTAGCCGATTTAAAGAATACTGACTT TTCAGGAAATGCAGGCTCATGTTCAGCAGCAATGTTTTTAGAAGAATT TACAGAAGGTGTTGAACATATTCATCTTGATGTAGCTGGAACTGCTGA AATCAGTGAAGTGCCACAAGGAATTATGGTTAAAACTTTAACTGAATT AAGTTTACTT(SEQ ID NO.2)。

　　在一些实施方式中，SEQ ID NO.1编码的膜蛋白片段的获得方式为：利用SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4为引物，牛支原体菌株基因组DNA为模板PCR扩增得到目标基因片段，与质粒pET-30a(+)双酶切连接，得到重组质粒P275-pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21中诱导表达纯化得到膜蛋白片段。

　　P275-F:5’-GG GGTACC GGAATATTAGCGCCCGTCTTAG-3’(SEQ ID NO.3)。

　　P275-R:5’-CCGC GGATCC ATTGTTTTTTTTGATTGTGAAC-3’ (SEQ ID NO.4)。

　　在一些实施方式中，SEQ ID NO.2编码的亮氨酰氨基肽酶片段的获得方式为：利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物，牛支原体菌株基因组 DNA为模板PCR扩增得到目标基因片段，与质粒pET-30a(+)双酶切连接，得到重组质粒pepA-pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21中诱导表达纯化得到亮氨酰氨基肽酶片段。

　　pepA-F:5’-GG GGTACC TTTGCTGATGAAACTAAATGC-3’(SEQ ID NO.5)。

　　pepA-R:5’-CCGC GGATCCAAGTAAACTTAATTCAGTT-3’(SEQ ID NO.6)。

　　上述的抗原优选应用间接ELISA检测方式检测待测样本中膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量。本发明从而提供一种鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的间接ELISA检测试剂盒，其中，含有包被本发明提供抗原的ELISA酶标板，该试剂盒利用所述抗原分别对待测样本中膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量进行检测，如果膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量比值不小于阈值，则判断牛支原体疫苗株感染。需要说明的是，膜蛋白抗原和亮氨酰氨基肽酶抗原分别包被在酶标板的不同孔中，并不是混合包被。

　　发明人研究过程中发现，牛支原体疫苗株和野毒株感染后牛体内的膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体的含量均存在一定的规律，但是二者的规律并不相同，所以可以通过比较二者的差别从而判断牛的感染类型。例如利用间接ELISA检测方式检测牛血清中的膜蛋白(P275)抗体OD450nm值和亮氨酰氨基肽酶(pepA)抗体OD450nm值，二者比值大于或等于1.8时，判断为牛接种支原体灭活疫苗；二者比值小于1.8时，判断为牛感染支原体野毒株。可以理解的是，由于显色底物的不同，含量检测的吸收光波长也会有所改变，从而可能得到不同或相近的阈值，然而这些诊断标准均在本申请的保护范围内。

　　在一些实施方式中，膜蛋白片段的包被浓度为40-60μg/ml，优选为50μg /ml。亮氨酰氨基肽酶片段的包被浓度为70-90μg/ml，优选为80μg/ml。除了包被有抗原的酶标板，试剂盒中还可以含有阳性对照、阴性对照、酶标二抗、稀释液、显色液、洗涤液、终止液中的至少一种。其中：

　　包被稀释液可以为pH7.0的PBS溶液；

　　封闭液可以选取5％鱼精蛋白；

　　洗涤液可为PBST(pH 7.4)：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.9g，KCl0.2g，Tween20 0.5ml，加去离子水至1000ml，调至pH 7.4；

　　样本稀释液：1×PBS1000mL，Tween20 5mL，(pH 10.8)；

　　酶标二抗可以为兔抗牛IgG辣根过氧化物酶；

　　底物显色液：1ml柠檬酸液加入20μL TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺) 溶液和1.2μL H2O2，TMB水溶液15mg/ml；柠檬酸为0.1mol/L pH 4.0；

　　终止液为：2mol/L H2SO4溶液。

　　利用本发明提供的上述间接ELISA检测试剂盒对牛血清样本中的膜蛋白抗体和亮氨酰氨基肽酶抗体含量进行检测，通过判断膜蛋白(P275)抗体OD450nm值与亮氨酰氨基肽酶(pepA)抗体OD450nm值的比值变化，来判断感染原为支原体灭活疫苗株，还是野毒株。具体地，二者比值大于或等于 1.8时，判断为牛接种支原体灭活疫苗；二者比值小于1.8时，判断为牛感染支原体野毒。具体的检测流程优选为如下：

　　1、牛颈部采血5ml，37℃2h，1000g离心20min，取上清4℃保存；

　　2、包被：用包被稀释液(PBS pH7.0)分别稀释P275表达蛋白浓度为 50μg/ml、pepA蛋白浓度为80μg/ml，分别加入ELISA板不同的微孔中，每孔100μl，4℃24h；

　　3、封闭：弃去包被液，每孔加入5％鱼精蛋白250μl，37℃1h；

　　4、洗板：弃去封闭液，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　5、加样：血清样品稀释1：100，每孔加100μl，37℃1h；

　　6、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　7、加酶标二抗：稀释兔抗牛IgG辣根过氧化物酶1：5000，每孔加100μl， 37℃1h；

　　8、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　9、加底物(现配)：每孔加底物显色溶液100μl，37℃避光放置20min；

　　10、终止反应：加入50μl终止液，检测OD450nm值。

　　下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

　　实施例中的膜蛋白片段和亮氨酰氨基肽酶片段的获得分别通过SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列表达得到，PCR扩增得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2片段所用的引物分别为SEQ ID NO.3-6所示的引物。

　　实施例1膜蛋白(P275)基因、亮氨酰氨基肽酶(pepA)基因片段PCR 扩增

　　1、牛支原体菌株培养：取本公司从病牛中分离的支原体菌株接种PPLO 液体培养基中，37℃、5％CO2培养箱中培养；

　　2、基因组DNA提取：按照支原体基因组DNA提取试剂盒提供方法提取基因组；

　　3、目的基因扩增：扩增体系为50μL体系：Taq酶(1000u/mL)2μL， 10×BUFFER 5μL，dNTP(10mM)2μL，上游引物(10μM)2μL，下游引物 (10μM)2μL，模板10μL，ddH2O 27μL。PCR反应条件：95℃预变性5min； 95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸15min； 4℃保存。

　　4、目的基因纯化：PCR产物凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察目的条带，割取目的条带，用凝胶纯化试剂盒纯化目的基因，结果如图1所示。

　　实施例2连接与转化

　　1、质粒pET-30a(+)、膜蛋白(P275)基因、亮氨酰氨基肽酶(pepA)基因进行KpnI、BamHI双酶切；

　　1.1酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收目的条带并纯化；

　　1.2按照T4连接方剂盒提供方法步骤，连接质粒和p275、pepA基因；

　　1.3卡那霉素(100ml/L)固体培养基筛选P275-pET-30a(+)、 pepA-pET-30a(+)转化至大肠杆菌BL21阳性株；

　　1.4双酶切鉴定P275-pET-30a(+)、pepA-pET-30a(+)重组原核表达载体。

　　2、P275-pET-30a(+)、pepA-pET-30a(+)蛋白的原核表达及纯化

　　2.1挑取含有P275-pET-30a(+)、pepA-pET-30a(+)表达载体的大肠杆菌 BL21在LB固体培养基(含100mg/L卡那霉素)单个菌落于20mL的LB 液体培养基(含100mg/L卡那霉素)过夜培养；

　　2.2取5ml培养菌液接种至500ml的LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)，培养至OD600到0.6，加入IPTG(0.4mmol/L)溶液，28℃，150rpm诱导4h；

　　2.3 6000rpm，15min离心，沉淀菌体；

　　2.4加入10mL裂解液重悬菌体；

　　2.5超声破碎：300W，10S/10S，20min；

　　2.6按照Ni柱纯化说明书提供步骤纯化表达蛋白；

　　2.7按照SDS-PAGE方法步骤检测蛋白纯度，按照Bradford法提供步骤检测表达蛋白浓度。

　　实施例3ELISA检测牛血清

　　随机选取支原体阴性牛场、灭活疫苗免疫实验牛场、支原体检测阳性牛场各20头牛。按照间接ELISA方法步骤检测血清中P275蛋白、pepA蛋白抗体OD450nm值(结果见表1)。

　　1、牛颈部采血5ml，37℃2h，1000g离心20min，取上清4℃保存；

　　2、包被：用包被稀释液(PBS pH7.0)分别稀释P275表达蛋白浓度为 50μg/ml、pepA蛋白浓度为80μg/ml，分别加入ELISA板不同的微孔中，每孔100μl，4℃24h；

　　3、封闭：弃去包被液，每孔加入5％鱼精蛋白250μl，37℃1h；

　　4、洗板：弃去封闭液，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　5、加样：血清样品稀释1：100，每孔加100μl，37℃1h；

　　6、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　7、加酶标二抗：稀释兔抗牛IgG辣根过氧化物酶1：5000，每孔加100μl， 37℃1h；

　　8、洗板：弃去样品，加入洗涤液满孔，微振5S，弃去洗涤液，洗3 遍，拍干；

　　9、加底物(现配)：每孔加底物显色溶液100μl，37℃避光放置20min；

　　10、终止反应：加入50μl终止液，检测OD450nm值。

　　表1阴性牛场、免疫实验牛场、阳性牛场血清ELISA检测结果

　　通过对上述表格中的数据进行统计学分析，得到判断牛支原体疫苗株和野毒株感染的标准：膜蛋白(P275)抗体OD450nm值和亮氨酰氨基肽酶 (pepA)抗体OD450nm值，二者比值大于或等于1.8时，判断为牛接种支原体灭活疫苗；二者比值小于1.8时，判断为牛感染支原体野毒株。

　　尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

　　SEQUENCE LISTING

　　<110> 天康生物股份有限公司

　　<120> 用于鉴定牛支原体疫苗株或野毒株感染的抗原和间接ELISA检测试剂盒

　　<160> 6

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 1035

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 1

　　ggaatattag cgcccgtctt agctattcct ttagtagctg ctagttgcaa taatgaatct 60

　　aaactcaaag atttacaaac aaagtatgaa aacaacagaa aatcagttat agatttttta 120

　　aattcagaag aaaaatatag ctttttaaaa acatatgttg atattaaaaa tgctctaaat 180

　　gctaaagttg atattaaaag tagcaaagaa atcaataatt gaataaaaaa cacaaatgat 240

　　gcaatttctt catataaatc atttaaaaat agcattgtta cagttaatga agataaagaa 300

　　aaaaatacat tttctgcttt tgataactta ctagttttat catctaaagt atctgaaaag 360

　　ggaaaaggct ttttccctaa aactattata aatcagctta aaagtaaaaa ttcatttgca 420

　　gaacaagtta aattactaaa ttccttttta gaatcaagct tattaaaagt taatgaagaa 480

　　tcattgaaag atatttcaat agattttgaa aactctgtcc caaatgattt tattaattca 540

　　gtcaatgatg ggttaacact aacttttgta atgaacaaaa atggaactaa gcattatgca 600

　　cccataacat gaaaaaatat tggtttaaat aatgttgaaa aagctgatga tgttcacagc 660

　　gatgaaattg atttatcaaa agtaactgaa aatgataaaa atcattatct agatgatagc 720

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　　atctttgaaa aaataaattc tatcgtttcc caaagtaacg gtaaattaga cacaaatgaa 840

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　　aatcaaaaaa acaat 1035

　　<210> 2

　　<211> 1035

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<400> 2