一种五倍子来源鞣花酸的鉴定方法
技术领域
本发明属于鞣花酸鉴定技术领域，具体涉及一种五倍子来源鞣花酸的鉴定方法。
背景技术
鞣花酸具有抗氧化、抗突变、抗病毒、降压、镇静等多种生物活性功能，鞣花酸的提取、制备及保健功能越来越受到人们重视。目前鞣花酸的生产原料主要有两种，一种是五倍子或五倍子单宁，另一种是石榴皮，欧、美市场多数以石榴皮提取物的形式销售鞣花酸。研究表明，从石榴皮中提取的鞣花酸可以食用，但从五倍子提取的鞣花酸，由于是动物的虫瘿，虽然属于中药但仅限于外用，不可食用。市场上，从五倍子中提取的鞣花酸成本低，常通过添加石榴皮提取物冒充石榴皮来源的鞣花酸，从而引进了市场混乱，并存在一定的安全陷患。五倍子来源鞣花酸的鉴别难度很大，至今尚没有有效的方法。为了区分鞣花酸保健品原料来源于五倍子还是石榴皮，急需寻找一个标志性物质来进行判别。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本发明的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种五倍子来源鞣花酸的鉴定方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种五倍子来源鞣花酸的鉴定方法，包括以下步骤：
检测含鞣花酸的待测品中是否存在五倍子的特征成分漆树酸；若是，则待测品含有五倍子来源鞣花酸。
作为优选方案，采用液相色谱高分辨质谱联用技术对含鞣花酸的待测品进行检测。
作为优选方案，所述液相色谱高分辨质谱联用技术的液相色谱条件为：色谱柱为Waters Acquity BEH C18柱、柱温为35℃、样品盘温度为4℃、流动相为水和甲醇、梯度洗脱、流速为0.2mL/min、进样体积为1μL。
作为优选方案，所述色谱柱的参数为1.7μm、2.1mm×100mm。
作为优选方案，所述液相色谱高分辨质谱联用技术的质谱条件为：电喷雾ESI离子源参数设定如下：负离子扫描模式，加热器温度为300℃，毛细管温度为350℃，毛细管电压为35V，喷雾电压为-3.5KV，鞘气流速为35arb，辅助气流速为10arb；一级质谱在负离子进行全扫描，二级质谱采用数据依赖性扫描。
作为优选方案，所述样品一级质谱在负离子进行全扫描的参数包括：分辨率R为30000，m/z扫描范围为100-1500Da。
作为优选方案，所述采用液相色谱高分辨质谱联用技术对含鞣花酸的待测品进行检测，包括：将待测品溶于甲醇中超声，然后冷冻干燥，接着复溶后过0.22μm聚四氟乙烯针头过滤器上机检测。
作为优选方案，若所述待测品的总离子流色谱曲线在目标保留时间的出峰与标准漆树酸的特征峰匹配，则待测品存在漆树酸。
作为优选方案，所述目标保留时间为34-38min。
作为优选方案，所述目标保留时间的出峰对应的物质与标准漆树酸的一级及二级高分辨质谱数据均匹配，则待测品存在漆树酸。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
本发明将漆树酸作为区别鞣花酸来源是五倍子还是石榴皮的标志性物质，便捷地鉴定鞣花酸为五倍子来源鞣花酸或石榴来源鞣花酸，防止鞣花酸的掺假。
附图说明
图1是本发明实施例的石榴皮提取鞣花酸和五倍子提取鞣花酸在负离子检测模式下的总离子流曲线图；
图2是本发明实施例的化合物1对应的一级质谱图；
图3是本发明实施例的化合物1对应的二级质谱图；
图4是漆树酸标准品和各厂家五倍子提取鞣花酸中的化合物1提取的离子流曲线对比图；
图5是不同厂家的五倍子提取鞣花酸的总离子流曲线对比图；
图6是漆树酸标准品与保健品的总离子流曲线对比图；
具体实施方式
以下将通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
本发明实施例构建了液相色谱高分辨质谱联用(LC-HR MS)的分析方法，鉴定了石榴皮及五倍子来源的鞣花酸中的差异性组分，用于区分鞣花酸的来源。基于高分辨及多级质谱数据，推断差异性未知化合物是漆树酸。该结果进一步使用漆树酸标准品进行了对比，色谱保留时间、一级及二级高分辨质谱数据完全一致，进一步确认了差异性未知化合物是漆树酸的结论。
结果表明，漆树酸可以作为标志物，判断鞣花酸是五倍子还是石榴皮提取的，本发明为鞣花酸保健品市场提供了一种新的鉴定手段。
具体的鉴定方法通过以下实验进行详细说明：
一、实验部分
1.1、实验材料及仪器
HPLC级甲醇从Thermo Fisher Scientific公司购买；标准品漆树酸购买于北京百灵威科技有限公司；超高效液相色谱仪含自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机、低压四元梯度泵、PDA检测器和LTQ Orbitrap velos pro质谱仪(高分辨静电场轨道阱质谱，ESI源)购自Thermo Fisher公司；离心机购买自SIGMA实验室。
1.2、仪器条件
液相色谱条件：优化了不同的流动相梯度以获得最优的液相色谱条件，优化后的色谱条件如下：色谱柱为BEH C18柱(1.7μm,2.1mm ID×100mm,Waters)；柱温为35℃；样品盘温度为4℃；流动相为A水和B甲醇，梯度洗脱条件为0-3min，3％B；3-30min，3％-97％B；30-40min，97％B；40-60min，97％-5％B；60-62min，3％B；流速为0.2mL/min；进样体积为1μL。
质谱条件：对于高分辨质谱LTQ Orbitrap质谱仪，电喷雾(ESI)离子源参数设定如下：负离子扫描模式，加热器温度为300℃，毛细管温度为350℃，毛细管电压为35V，喷雾电压为-3.5KV(负离子检测模式)，鞘气(N2)流速为35arb，辅助气(N2)流速为10arb；样品一级质谱在负离子进行全扫描(分辨率R为30000，m/z扫描范围为100-1500Da)，二级质谱采用数据依赖性扫描，数据采集和分析采用Xcalibur，Mass Frontier 7.0软件。
1.3、样品制备方法
样品分别是纯度90﹪的石榴皮和五倍子提取的鞣花酸原料，各取原料1g，加入10mL的甲醇超声半小时，高速离心取上清液，过0.22μm的聚四氟乙烯针头过滤器上机。
二、实验数据及讨论
在分析过程中，首先进行了液相和质谱参数的优化，然后对比了样品在正离子模式和负离子模式下物质的质谱信号响应程度，发现在负离子模式下具有很好的响应信号，因此主要分析了负离子采集模式下的数据。
如图1所示，石榴皮来源鞣花酸和五倍子来源鞣花酸在负离子检测模式下的总离子流曲线表明：石榴皮来源鞣花酸在t＝36min之后没有很明显的特征峰，而五倍子来源鞣花酸在t＝38.09min有很明显差异性杂质峰化合物1，找到差异性物质后，下面利用质谱解析思路推导未知化合物的结构。
从图2可以看到化合物1，其[M-H]-离子m/z为347.25845，根据高分辨数据利用Xcalibur 3.0软件计算出最可能分子式是C22H35O3，误差是1.090ppm。
如图3所示，在二级质谱图中，由一级[M-H]-离子m/z为346.92801丢失CO2得到[M-H-44]-得到m/z为303.03778，推测该化合物1结构中可能含有羧基，然后利用ChemSpider网上检索，并结合可能的官能团结构和碎片找到可能的候选化学结构。首先，根据化合物1分子组成C22H36O3，在ChemSpider中检索到了468个可能结构，根据二级碎片推测可能含有羧基官能团，进一步筛选，在468个化合物中筛查含羧基化合物29个，然后查阅五倍子相关文献，发现漆树科盐肤木作为生产五倍子的寄主植物，含有酚酸类化合物，结构如下：
发现漆树酸与五倍子寄生植物中酚酸类结构一致，进一步推测未知化合物的结构最有可能是Anacardic acid(6-十五烷基水杨酸)漆树酸。
接着采用漆树酸标准品，找到不同厂家西安和华药生产的五倍子来源鞣花酸原料，经过与漆树酸标准品对比，其结果如图4所示，可以看到在t＝36min时出峰的物质与标准品漆树酸的保留时间一致。
漆树酸标准品的[M-H]-离子m/z为347.26099，其二级碎片[M-H-44]-离子m/z为303.41553，华药五倍子原料中差异性物质[M-H]-离子m/z为347.26096，其二级碎片[M-H-44]-离子m/z为303.38586，西安五倍子原料中差异性物质[M-H]-离子m/z为347.26099，其二级碎片[M-H-44]-离子m/z为303.37616，与漆树酸标准品对比保留时间，一级及二级高分辨质谱数据，完全一致，进一步确认化合物是漆树酸，所以漆树酸可以作为区别鞣花酸来源是五倍子还是石榴皮的标志性物质。
另外，还对不同厂家的五倍子提取的鞣花酸进行检测对比，如图5所示，都检测到标志性物质漆树酸，方法简单快速，进一步验证本发明鉴定方法的可行性。
进一步用保健品验证本发明鉴定方法的可行性，保健品中每个胶囊1000mg，鞣花酸含量百分之七十，取10个胶囊5.3g，溶于11mL的甲醇中超声30min，然后冷冻干燥，复溶后溶度提高一倍，经计算保健品鞣花酸的浓度是675mg/mL，过0.22μm的聚四氟乙烯针头过滤器上机，LC-MS-MS测试结果如图6所示，在t＝34.61min检测到了漆树酸，说明该保健品原料中含有五倍子提取的鞣花酸，验证了本发明鉴定方法的可行性。本发明的鉴定方法为保健品市场提供了一种新的鉴定手段，能快速鉴定原料的来源，防止鞣花酸的掺假。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。
