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一种ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法及应用
技术领域
本发明属于荧光传感技术领域，具体涉及一种ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法和应用。
背景技术
硫化物是一种重要的化工原料，广泛应用于橡胶、化肥、烟花、造纸、印染、皮革制造等化工行业。然而硫离子是一种对生物体有毒害作用的阴离子，硫会与人体中的氧化酶和细胞色素发生反应，从而影响生物细胞的氧化过程，暴露于高浓度的硫离子环境中会导致生物体组织处于缺氧状态，最终威胁到生物的生命。因此，开发一种快速测定硫离子浓度的检测方法具有非常重要的意义。
荧光光谱检测法由于高灵敏度、简便和低成本的优势，成为传统检测方法如原子吸收光谱法(AAS)，原子发射光谱法(AES)，冷原子荧光光谱法(CV-AFS)，电感耦合等离子体-质谱(ICPMS)和质谱(MS)等金属离子检测的替代方法。近年来，半导体纳米晶体(也称为量子点，量子点)由于拥有高量子产率、宽且可调的激发和发射光谱、高水溶性和生物相容性以及简单的合成方法而广泛地应用于离子和生物小分子的检测。在已有的关于量子点检测重金属的报道中，广泛地采用荧光猝灭(turn-off)的检测模式。然而可引发荧光猝灭的因素是多方面的，所以“turn-off”检测模式的特异性差，甚至会造成假阳性。针对以上问题，本发明利用Pb2+可以引发ZnCdSe QDs荧光猝灭的现象，并且S2-能够与Pb2+特异性结合，从而使ZnCdSe QDs的荧光得到恢复，从而形成“turn-off-on”模式检测，实现对S2-的定量检测。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法，具体步骤如下：
1)NaHSe前体的制备：称取1mol硒粉和2～6mol NaBH4并溶于水中(浓度可以为任意浓度，保证溶解即可)，将溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌30min，在此过程中持续通入氮气。然后将产物转移到2mL的EP管中，密封并置于4℃的冰箱中冷藏保存以待后续使用。
2)ZnCdSe QDs的制备：称取1mol ZnCl2和1～3mol NAC并溶于水中(浓度可以为任意浓度，保证溶解即可)，将混合溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌20min。然后用Tris-HCl缓冲液将混合物的pH调节到9～10，然后向溶液中注入适量的0.04mol CdCl2·2.5H2O，之后混合溶液在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌20min。向反应物中注入0.1mol步骤1)中制备的NaHSe前体，然后继续在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌15min。最后将混合溶液转移到高压釜中，然后置于180℃～220℃的烘箱中反应40～60min。将所得产物用粒径为0.22μm的滤膜过滤，用规格为3500D的透析袋透析24h后稀释40倍作为储备液置于冰箱中冷藏保存，以待后续使用。
进一步地，步骤1)中所述的[Se]:[NaBH4]＝1:3～5。
本发明还涉及上述方法制备得到的ZnCdSe QDs荧光探针在荧光检测中的应用，该应用基于“turn-off-on”检测方法，具体为：向ZnCdSe QDs荧光探针溶液中加入猝灭剂，使其猝灭，然后加入待测液，在340nm激发波长下，使用荧光分光光度计的fluorescence模式进行检测，记录400～550nm范围内的荧光发射光谱，得到荧光强度，根据荧光强度获得待测液中检测离子的浓度。
所述待测液中待测离子为S2-，对应的，猝灭剂中有效离子为Pb2+。
本发明还涉及一种基于ZnCdSe QDs荧光探针的S2-的检测体系，所述检测体系采用上述方法制备得到的ZnCdSe QDs荧光探针，并加入Pb2+，使得量子点的荧光猝灭。
进一步地，所述ZnCdSe QDs荧光探针的浓度为3.6g/L，所述Pb2+的浓度为3～7μM。
本发明还涉及一种基于ZnCdSe QDs荧光探针的S2-的检测方法，该方法为，向上述检测体系中加入已知S2-浓度的检测液，在340nm激发波长下，使用荧光分光光度计的fluorescence模式进行检测，记录400～550nm范围内的荧光发射光谱，得到荧光强度，以此构建基于ZnCdSe QDs荧光强度的S2-检测模型。测试时，向上述检测体系中加入S2-待测液，在340nm激发波长下，使用荧光分光光度计的fluorescence模式进行检测，记录400～550nm范围内的荧光发射光谱，得到荧光强度，根据荧光强度获得S2-待测液中S2-的浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)利用简单的荧光纳米材料ZnCdSe QDs以及Pb2+构建“turn-off-on”检测平台，显著提高了检测体系对S2-的特异性。
(2)该检测方法对S2-的响应范围在0～20μM之间，线性相关方程为(F0-F1)/F0＝0.05868C-0.02394，线性测定系数为0.99503，经计算得到其检测限为58.6nM。
附图说明
图1为本发明构建的检测平台检测S2-的机理图。
图2为本发明制备的ZnCdSe QDs荧光探针的透射电镜图。
图3为检测体系的傅立叶变换中红外光谱图。
图4为本发明制备的ZnCdSe QDs中加入Pb2+后的紫外表征图。
图5为检测体系的荧光寿命表征图。
图6为多种常见金属对本发明制备的ZnCdSe QDs荧光探针的荧光淬灭效果图。
图7为Pb2+对S2-的特异性图。
图8为检测体系中不同的Pb2+添加量对荧光恢复率的影响图；
图9为基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系检测不同浓度S2-(0～20mM)的荧光光谱图。
图10为基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系检测不同浓度S2-(0～20mM)的线性拟合图。
图11为本发明构建的检测体系对S2-的特异性检测结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，运用F-7000荧光分光光度计测定样品荧光强度，测定条件为：在最佳激发波长340nm下记录400nm-550nm范围内的荧光强度，测定样品溶液体系的体积为1mL。
此检测体系的猝灭机制通过紫外光谱(UV-1800PC紫外可见光谱仪(上海美谱达仪器有限公司)和稳态-瞬态荧光光谱仪(Edinburgh)进行测试。
实施例1
本实施例提供了ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法，具体步骤包括：
1)NaHSe前体的制备：称取0.06g硒粉和0.1135g NaBH4溶于7.5mL超纯水中，将溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌30min，在此过程中持续通入氮气以避免反应物氧化。然后将产物转移到2mL的EP管中，密封并置于4℃的冰箱中冷藏保存以待后续使用。
2)ZnCdSe QDs的制备：称取0.1363g ZnCl2和0.3264g NAC溶于40mL超纯水中，将混合溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌20min。然后用浓度为10mM的Tris-HCl缓冲液将混合物的pH调节到9.7，然后向溶液中注入(100μL,0.4M)的CdCl2·2.5H2O，之后混合溶液在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌20min。快速向反应物中注入1mLNaHSe前体溶液，然后继续在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌15min。最后将混合溶液转移到高压釜中，然后置于200℃的烘箱中反应50min。将所得产物用粒径为0.22μm的滤膜过滤，用规格为3500D的透析袋透析24h后稀释40倍作为储备液置于冰箱中冷藏保存，以待后续使用。
对所制备的ZnCdSe QDs荧光探针及检测体系进行表征分析：
1、ZnCdSe QDs的TEM表征
ZnCdSe QDs的TEM表征结果如图2所示，该量子点的平均粒径大约为3～4nm，在水溶液中均匀分散，具有良好的水溶性。
2、中红外表征
对ZnCdSe QDs、ZnCdSe QDs+Pb2+检测体系和ZnCdSe QDs+Pb2++S2-检测体系做了FTIR表征，以探究其表面富含的官能团。如图3所示，图中的a、b和c分别代表ZnCdSe QDs、ZnCdSe QDs+Pb2+和ZnCdSe QDs+Pb2++S2-检测体系，从图中可以看出三种检测体系均在3418cm-1、1582cm-1、1402cm-1和1357cm-1处出现明显的吸收带，分别归属于O-H/N-H、C＝C、C-N和COO-官能团。由于ZnCdSe QDs+Pb2+和ZnCdSe QDs+Pb2++S2-体系中所包含的官能团与ZnCdSe QDs表面的官能团基本完全相同，表明Pb2+、S2-都未与ZnCdSe QDs表面的官能团结合形成配合物。
3、基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系的紫外表征
ZnCdSe QDs中加入不同浓度Pb2+后紫外光谱基本保持不变(图4)也可以说明ZnCdSe QDs的表面基团并未与Pb2+结合形成新的配合物。
4、荧光寿命表征
ZnCdSe QDs、ZnCdSe QDs+Pb2+和ZnCdSe QDs+Pb2++S2-检测体系的荧光寿命表征图5显示，加入Pb2+后ZnCdSe QDs的荧光寿命从30.47ns降到4.57ns，表明加入Pb2+后引发了ZnCdSe QDs的动态猝灭。
综上可以推测Pb2+与ZnCdSe QDs之间发生了电子转移从而导致了量子点的荧光猝灭。而ZnCdSe QDs+Pb2++S2-的荧光寿命为26.37ns，与ZnCdSe QDs的荧光寿命非常接近。另外，在可见光下可以清晰地观察到Pb2+和S2-混合在一起后立即生成一种黑色的沉淀，推断是一种难溶物质PbS，机理示意图如图1所示。
实施例2
本实施例提供了ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法，具体步骤包括：
1)NaHSe前体的制备：称取0.06g硒粉和0.09g NaBH4溶于7.5mL超纯水中，将溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌30min，在此过程中持续通入氮气以避免反应物氧化。然后将产物转移到2mL的EP管中，密封并置于4℃的冰箱中冷藏保存以待后续使用。
2)ZnCdSe QDs的制备：称取0.1363g ZnCl2和0.1632g NAC溶于40mL超纯水中，将混合溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌20min。然后用浓度为10Mm的Tris-HCl缓冲液将混合物的pH调节到9，然后向溶液中注入(100μL,0.4M)的CdCl2·2.5H2O，之后混合溶液在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌20min。快速向反应物中注入1mL NaHSe前体溶液，然后继续在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌15min。最后将混合溶液转移到高压釜中，然后置于180℃的烘箱中反应60min。将所得产物用粒径为0.22μm的滤膜过滤，用规格为3500D的透析袋透析24h后稀释40倍作为储备液置于冰箱中冷藏保存，以待后续使用。
实施例3
本实施例提供了ZnCdSe QDs荧光探针的制备方法，具体步骤包括：
1)NaHSe前体的制备：称取0.06g硒粉和0.1419g NaBH4溶于7.5mL超纯水中，将溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌30min，在此过程中持续通入氮气以避免反应物氧化。然后将产物转移到2mL的EP管中，密封并置于4℃的冰箱中冷藏保存以待后续使用。
2)ZnCdSe QDs的制备：称取0.1363g ZnCl2和0.4896g NAC溶于40mL超纯水中，将混合溶液置于圆底烧瓶中，在冰浴条件下搅拌20min。然后用浓度为10Mm的Tris-HCl缓冲液将混合物的pH调节到10，然后向溶液中注入(100μL,0.4M)的CdCl2·2.5H2O，之后混合溶液在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌20min。快速向反应物中注入1mL NaHSe前体溶液，然后继续在冰浴条件下持续通入氮气并搅拌15min。最后将混合溶液转移到高压釜中，然后置于220℃的烘箱中反应40min。将所得产物用粒径为0.22μm的滤膜过滤，用规格为3500D的透析袋透析24h后稀释40倍作为储备液置于冰箱中冷藏保存，以待后续使用。
实施例4
本实施例提供了S2-检测体系中猝灭剂的选择，具体检测方法如下：
为了选择出合适的猝灭剂，探究了多种常见金属对本发明制备的ZnCdSe QDs荧光探针的荧光淬灭效果，依次取100μL实施例2制备的ZnCdSe QDs储备液和400μL浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液加入石英皿中，然后分别向石英皿中加入100μL浓度为10-4M的Zn2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、K+、Mg2+、Fe2+、Na+、Cr6+、Cd2+、Ca2+、Fe3+、Cr3+、Co2+、Ni2+溶液及浓度为5×10-5M的Pb2+、Hg2+、Ag+、Cu2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1mL，将溶液混匀反应20min后，用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度，所有实验均重复三次。绘制以F1/F0(F1为检测体系反应完全后的荧光强度值，F0是ZnCdSe QDs的初始荧光强度值)为纵坐标，各种类金属离子为横坐标的柱状图，得到了多种常见金属对本发明制备的ZnCdSe QDs荧光探针的荧光淬灭效果(图6)。由图6可知Hg2+、Ag+、Cu2+和Pb2+均能导致ZnCdSe QDs荧光猝灭。本发明进一步探究了Hg2+、Ag+、Cu2+和Pb2+对S2-的结合能力。
依次取100μL实施例2制备的ZnCdSe QDs储备液和400μL浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液加入石英皿中，然后分别向石英皿中加入100μL浓度为5×10-5M的Pb2+、Hg2+、Ag+和Cu2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1mL，将溶液混匀反应20min使量子点的荧光猝灭完全后，用荧光分光光度计分别检测对应体系的荧光强度。第二步，分别取50μL浓度为10-4M的Pb2+、Hg2+、Ag+、Cu2+水溶液，分别向这4个样品中加入S2-(200μL，10-4M)，再加入400μLTris-HCl缓冲溶液和100μL ZnCdSe QDs储备液，最后用超纯水定容至1mL，20min后用荧光分光光度计进行检测，所有实验均重复三次。如图7所示，在ZnCdSe QDs+Mn+(Mn+代表重金属离子)的猝灭体系中加入S2-后，只有Pb2+存在的体系中荧光强度能够恢复到原始荧光的90％，而在Hg2+、Ag+和Cu2+存在的体系中，荧光强度几乎没有恢复。综上，本发明选择Pb2+作为S2-检测体系中的猝灭剂。
实施例6
本实施例提供了S2-检测体系中最佳Pb2+添加量的选择
由于S2-和Pb2+之间有强结合能力，通过竞争作用，能够将Pb2+从ZnCdSe QDs上移除，从而使得ZnCdSe QDs的荧光强度得到恢复。然而如果检测体系中Pb2+的浓度过低，那么此检测体系对S2-的灵敏度会降低，达不到检测的要求；如果测体系中Pb2+的浓度过高，ZnCdSe QDs的荧光强度将难以恢复。为了使基于ZnCdSe QDs和Pb2+检测体系的荧光强度得到最大程度的恢复，需要探究检测体系中Pb2+的最佳添加量。如图8所示，Pb2+浓度小于5μM时，量子点荧光强度恢复率逐渐升高，当Pb2+浓度大于5μM时，量子点荧光强度的恢复率逐渐降低，因此，优选最佳的Pb2+浓度为5μM。
实施例7
本实施例提供了基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系在S2-检测方面的应用，具体方法如下：
分别向比色皿中加入20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，120μL，140μL，160μL，180μL，200μL浓度为10-4M的S2-溶液，然后向每个样品中加入Pb2+(50μL，10-4M)，再向每个样品中分别加入(10mM,400μL)Tris-HCl缓冲溶液和100μL实施例2制备的ZnCdSe QDs储备液，最后用超纯水定容至1mL，待测液混合均匀充分反应20min，然后用荧光分光光度计在340nm激发波长的检测条件下用荧光分光光度计进行检定，实验重复三次。绘制反应体系的荧光光谱和线性拟合结果，分别如图9和图10所示。然后根据检测限的计算公式LOD＝3σ/S(σ为线性斜率，S重复测量后空白的标准偏差)得出该检测体系的检测限为58.6nM。
实施例8
本实施例提供基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系在S2-检测方面的特异性，具体检测方法如下：
第一步，依次取100μL实施例2制备的ZnCdSe QDs储备液和400μL浓度为10mM的Tris-HCl缓冲溶液加入石英皿中，再向石英皿中加入100μL浓度为5×10-5M的Pb2+水溶液，然后向石英皿中加入超纯水定容至1mL，将溶液混匀反应20min，用荧光分光光度计检测对应体系的荧光强度。第二步，将Pb2+(50μL，10-4M)分别与200μL S2-、Cl-、I-、SO42-、SO32-、HPO4-、NO3-、NO2-、F-、Br-、CO32-、C2O42-、ClO-、HCO3-、CH3COO-水溶液混合(其中S2-的浓度为10-4M，其他阴离子的浓度均为10-3M)，再分别加入400μLTris-HCl缓冲溶液和100μL ZnCdSeQDs储备液，最后用超纯水定容至1mL，20min后用荧光分光光度计进行检测，所有实验均重复三次。结果如图11所示，除了S2-，其他阴离子与Pb2+的亲和力的竞争力小，不能使ZnCdSeQDs的荧光强度恢复，所以基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系对S2-的特异性强。
实施例9
本实施例为基于ZnCdSe QDs和Pb2+的检测体系在实际样品中检测S2-的应用，具体方法如下：
使用标准加入法，在不同复杂基质(矿泉水、绿茶和黄连)中加入不同浓度的S2-，探究了复杂基质中不同浓度的S2-(2μM、4μM、6μM)在实际样品中的回收率效果。结果如表1所示，在不同的实际样品中S2-的回收率在97.0-104.1％的范围内，相对标准偏差(RSD)均不超过10％(n＝3)，说明本发明在实际应用中具有巨大的潜力。
表1矿泉水、绿茶和黄连样品中S2-的回收结果
