一种植物线虫侧线标本制备和观察方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地说，是涉及一种植物线虫侧线标本制备和观察方法。
背景技术
植物线虫属于无脊椎动物中的线虫门，能寄生于植物根、茎、叶、果实、种子等部位，目前在线虫分类鉴定领域使用的线虫鉴定方法主要有形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法。
在植物线虫检测鉴定研究中，线虫侧线数量是线虫种类鉴定的重要特征之一。但在显微镜下侧线数量难以看清。通常的解决办法一是尽量观察较多数量的线虫，搜寻个别侧线较清晰的进行观察拍照，二是用手指轻压线虫临时标本，使线虫扭曲，以更好地展示其侧线所在区域，但该方法对操作者技能要求较高。
因此需要一种能有效解决上述问题的一种植物线虫侧线标本制备和观察方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物线虫侧线标本制备和观察方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明包括以下步骤：
A在剩余包含有线虫的液体中加入线虫固定液；
B将所述线虫固定液进一步离心后共加入甘油水溶液(甘油：蒸馏水＝1:20)，置于35℃～40℃恒温放置40h～50h完成脱水；
C在解剖镜下，选择脱水后的成虫，对所述线虫进行切段处理，片段长度为5-10μm；
D将切割好的线虫片段转移到甘油中，放置于设置有甘油凝胶涂层的载玻片上后，盖上盖玻片。
进一步地，所述甘油凝胶的制备方法包括取明胶3g，在25mL蒸馏水中浸泡2h，加22mL甘油，60℃水浴1h。
进一步地，所述甘油水溶液按照甘油：蒸馏水体积比1:20混合。
一种植物线虫侧线标本观察方法，其特征在于，所述在低倍显微镜(5倍物镜)下观察线虫片段标本，并用手指轻轻推动盖标本带动切割的线虫片段转动，直至所述线虫片段呈圆盘形，切口朝向观察者，在高倍显微镜(100倍物镜)下，即可观察到线虫侧线。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的制作方法简便、安全，植物线虫标本清晰，完整，着色均匀，其制作方法简便，保存期长，适用于植物线虫的标本侧线观察。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
在本实施例中，本发明包括以下步骤：
a、线虫的杀死与固定：将线虫液转移到500μL塑料管中，2000r/min离心3min，使线虫沉降到塑料管底部。用移液器慢慢将塑料管上层的水吸出，使管中仅留少量的线虫液(约10μL)，然后向管中加入95℃的线虫固定液(40％甲醛：甘油：蒸馏水＝10:2:88)，同时杀死和固定线虫(必须固定24h以上)。
b、将塑料管2000r/min离心3min，使线虫沉于管底，吸去上层线虫固定液后，用移液器将线虫移至24孔细胞培养皿中，共加入甘油水溶液(甘油：蒸馏水＝1:20)2mL，再将皿置于35℃～40℃恒温培养箱中放置40h～50h。此时皿中蒸馏水已全部蒸发，线虫已完成脱水过程，浸泡于甘油中。
c、在解剖镜下，用线虫挑针上述已完全脱水成虫1条或数条，轻轻放在一干净塑料培养皿盖子(正面朝上)的中间。
d、在解剖镜下，将剃须刀片的一个尖端固定，然后像切香肠一样，将该线虫切割成数个小段(每个片段长度最好不超过10μm)。
e、用昆虫针取少量甘油凝胶(取明胶3g，在25mL蒸馏水中浸泡2h，加22mL甘油，60℃水浴1h)，在酒精灯下融化，等待1min后，甘油凝胶变冷固化。
g、在低倍显微镜(5倍物镜)下观察线虫片段，并用手指轻轻推动盖标本，已切割的线虫片段会随之转动。直至片段呈圆盘形，切口朝向观察者。在高倍显微镜(100倍物镜)下，即可观察到线虫侧线。
发明的制作方法简便、安全，植物线虫标本标本清晰，完整，着色均匀，其制作方法简便，保存期长，适用于植物线虫的标本标本制作。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
