复合磷脂脂质体中DOPE和M5两种磷脂含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种mRNA脂质体疫苗的质量控制方法，具体而言，涉及复合磷脂脂质体中同时检测DOPE和M5两种磷脂含量的检测方法。
背景技术
脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊体，常用作抗肿瘤药物载体，现在已经发展成为成熟的一类新型靶向制剂。脂质体由于稳定性差使其发展受到限制，主要原因为磷脂在储存的过程中容易发生氧化分解；而磷脂并非单一的化合物，是基架结构相同但脂肪酸链不同的一类物质的混合物，由此限制了磷脂材料的检测。由于脂质体的成分比较复杂，常规脂质体中一般都包含胆固醇、磷脂等主要功能性辅料，而磷脂的降解产物及其本身的杂质又比较多且复杂，因此给脂质体中多种磷脂的检测工作带来一定的难度。
中国药典2010版中明确指出，注射剂所用的原辅料应从来源及工艺等生产环节进行严格控制并应符合注射用的质量要求。同时，根据药品质量行业标准，作为一种功能性药用辅料，磷脂在药物制剂中的含量需要被准确定量，而现有文献方法却十分复杂，给药物制剂研究带来了一定的困难。
磷脂的研究手段多样，目前测定磷脂含量的方法，主要有高效液相色谱法、钼蓝比色法、紫外分光光度法、荧光法、硫氰铁铵显色法、薄层色谱法、以及核磁共振法等。而在实际应用中，通常对特定磷脂的检测需要有特定的检测方法。CN101692038提供了一种比色法测定脂质体中磷脂的方法；研究者赵宝琴提供了钼蓝比色法对磷脂软胶囊中磷脂含量进行测定的方法(亚麻酸磷脂软胶囊中磷脂含量测定，人参研究，2015(03:36-37))；龚金炎提供了一种测定卵磷脂中磷脂含量的硫氰铁铵显色法(硫氰亚铁铵比色法测定蛋黄卵磷脂中总磷脂含量，食品工业，2018,039(008):319-322)，这些方法所用试剂涉及仪器种类多、操作步骤复杂，也不能对多种磷脂成分进行有效分离。Hatziantoniou S则采用薄层色谱法联合火焰离子检测器分离分析脂质体磷脂组成，但是流动相复杂，色谱峰形效果差(Method ofsimultaneous analysis of liposome components using HPTLC/FID[J].Methods inmolecular biology，(Clifton,N.J.),2010,606(606):363-368)。
HPLC是目前最常用的检测方法，高效液相色谱在磷脂的分离、检测方面具有优势，高效液相色谱分离磷脂可以避免破坏磷脂分子结构，得到更准确的分子结构信息。检测磷脂的检测器有紫外、蒸发光散射、示差折光及质谱检测器。紫外检测器(UV)和蒸发光检测器(ELSD)是常用的检测器。在已报道的磷脂HPLC检测方法中多为紫外检测器检测，由于磷脂缺乏强发色团，紫外吸收性能差，其灵敏度低。亦可将磷脂分子进行衍生化，可增大磷脂的紫外吸收。通过化学反应将磷脂变成具有发色基团的化合物，或直接在磷脂分子上连接发色团或荧光基团，再用紫外或荧光检测器进行检测。但是衍生化反应过程复杂，前处理步骤繁琐，对定量结果的准确度影响较大，操作繁琐。杨亦文等研究发现紫外检测器受磷脂来源影响较大，难以实现准确定量(HPLC-RI法快速准确测定大豆磷脂酰胆碱含量，分析测试学报,2004(05):118-121)。示差折光检测器受来源影响较小，但灵敏度较低，不能用于梯度洗脱，且对环境要求高，受温度影响较大(PEG修饰脂质体中溶血卵磷脂和脂肪酸的HPLC-RID法测定，中国医药工业杂志，2015，046(007):750-753)。R.Diaz-Lopez等人报道的检测方法使用电喷雾(CAD)检测器，并以乙腈-甲醇-氨水-冰醋酸为流动相A，以甲醇-氨水-冰醋酸为流动相B进行梯度洗脱，该方法对检测器的要求高，而且样品前处理和洗脱条件非常复杂，不利于操作(Quantification of pegylated phospholipids decorating polymericmicrocapsules of perfluorooctyl bromide by reverse phase HPLC with a chargedaerosol detector.Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，48:702-707)。崔莹(磷脂的高效液相色谱分析[J].福建分析测试,2007,016(001):71-74)和Rampler E(Rampler E,Schoeny H,Mitic B M,et al.Simultaneous non-polar and polar lipidanalysis by on-line combination of HILIC,RP and high resolution MS[J].Analyst,2018:10.1039.C7AN01984J)则采用质谱检测器进行磷脂的检测，但采用质谱检测器成本较高，不利于推广。
蒸发散射光检测器为非选择型的检测器，应用不受样品种类限制。蒸发光检测器相对具有更高的灵敏度，并且适用于梯度洗脱，使其在磷脂检测上得到了更广泛的应用。但在HPLC－ELSD测定磷脂含量的常规过程中，从物料中提取出总脂肪后，常常需要通过柱层析、固相微萃取等方法进一步富集磷脂，步骤烦琐复杂，不仅延长了样品处理的时间，还会造成磷脂的部分损失，影响测定的准确性，如《刺参性腺中6种磷脂含量的HPLC－ELSD分析》(朱瑶，陈慧民，卢航等，大连海洋大学学报，2015，30(04):422－425)和《Characterisationof the glycerophospholipid fraction in flaxseed oil using liquidchromatography-mass spectrometry》(Herchi W,Sakouhi F,Khaled S,et al.FoodChemistry,2011,129(2):p.437-442)。
复合磷脂脂质体是近年来涌现的一项新兴技术，是由不同磷脂相间排列和胆固醇组成的类似生物膜结构的拥有不同相区域的磷脂双分子层的球型药物载体，其特点主要是在制备过程中采用两种不同相变温度的磷脂为膜材(一种高于常温，一种低于常温)，在制备过程中温度应控制在60℃，并且，加入高相变温度磷脂材料会影响到脂质体刚性，而刚性提高能减弱调理机制在脂质体表面吸附从而减慢脂质体从循环中清除。因此，不同比例的磷脂材料在一定范围内的变化影响复合磷脂脂质体的刚性。此外，由于复合磷脂脂质体中形成了不同的相区域，所制得的脂质体能够使得某些难溶性药物的载药量大幅度上升。与传统脂质体相比，具有更好稳定性和生物利用度，并且克服了传统脂质体的载药量偏低和包合率低等问题。
DOPE是一种常用的辅助脂质、M5是目前高效率的阳离子脂质之一。近年来随着阳离子脂质介导的小分子药物和蛋白质、RNA等生物分子的药物传递在体内外的应用越来越广泛，对复合磷脂脂质体研究越来越深入，DOPE和M5作为具有良好效果的功能性辅料也越来越受到人们的关注，而与之相对应的检测方法却寥寥无几，同时检测复合磷脂脂质体这一总体物质中的DOPE和M5则更未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明在传统磷脂检测方法的基础上，结合自主开发的COVID19LPP疫苗制剂(mRNA复合磷脂脂质体疫苗)的自身特点，开发了一种选择性好、简便快捷准确的DOPE和M5含量同时测定的新方法，首次在复合磷脂脂质体中实现同时分离检测DOPE和M5含量。
本发明所述的DOPE，中文名为二油酰基磷脂酰乙醇胺，分子式为C41H78NO8P，分子量为744.0337，CAS：4004-05-1，结构式如式Ⅰ所示。
本发明所述的M5是一种中性磷脂，可用于疫苗试剂中的脂质成分，其结构式如式Ⅱ所示。
复合磷脂脂质体中通常含有两种磷脂成分，如COVID19 LPP疫苗制剂，同时含有DOPE和M5两种磷脂，利用现有技术中的磷脂检测方法，操作过程复杂繁琐，却仍无法同时检测出DOPE和M5，使复合磷脂脂质体疫苗的质量控制面临较大的困难。因此如何快速有效地从复合磷脂脂质体中同时检测出DOPE和M5，是提高复合磷脂脂质体疫苗质量控制水平的基础。
但是由于磷脂的基架结构类似，再加上复合磷脂脂质体的成分比较复杂，以及磷脂的降解产物及其本身的杂质，DOPE和M5的分离存在一定的难度。COVID19 LPP疫苗为本申请人自主开发的mRNA复合磷脂脂质体疫苗，除磷脂外，该脂质体疫苗中还含有mRNA、鱼精蛋白等成分，进一步给DOPE和M5的分离增加了难度。而采用本发明提供的HPLC－ELSD法可同时检测复合磷脂脂质体，尤其是COVID19 LPP疫苗中的DOPE和M5两种磷脂含量，而且操作简便，适合推广。
本发明的目的就是建立一种简便、高效、准确、同时检测复合磷脂脂质体中DOPE和M5的方法，由此测定复合磷脂脂质体中各组分含量的比例，为脂质体的质量控制提供一定的实验依据。
本发明提供了一种高效液相色谱同时检测DOPE和M5两种磷脂含量的方法，所述方法采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测，流动相A为0.1％三氟乙酸溶液，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱。
流动相A的配制方法为：取1.0mL三氟乙酸加入到1.0L二次蒸馏水中，混匀。流动相B采用的甲醇为色谱级甲醇。
流动相中加入0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)可以增强阳离子脂质的保留，实现了脂质体中DOPE、M5与其他组分的良好分离。
进一步地，所述的梯度洗脱程序为：
进一步地，所述的高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相流速为0.4mL/min，柱温为35℃。所述的C18色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18 pore size12nm，3.0*100mm，2.7μm。
进一步地，所述的蒸发光散射检测器检测条件为：蒸发器温度70℃，雾化器温度为70℃，气体流速1.6L/min，Date Rate：40Hz。
进一步地，所述方法还包括标准品制备，所述标准品制备包括M5标准品的制备和DOPE标准品的制备，主要步骤为：先分别用乙醇溶解M5或DOPE，溶解为32mg/mL的储备液，再分别用甲醇稀释到2.0、1.0、0.50、0.25和0.125mg/mL的工作液，用于标准曲线样品。
M5储备液的配制：精密称取32mg M5，用乙醇溶解为32mg/mL溶液，涡流混匀。作为M5储备液，将储备液保存于4℃冰箱。
M5工作液的配制：取M5储备液，用色谱甲醇稀释到如下浓度：2.0、1.0、0.50、0.25和0.125mg/mL。将稀释后的系列溶液作为M5工作液，用于标准曲线样品。
DOPE储备液的配制：精密称取32mg DOPE，用乙醇溶解为32mg/mL溶液，涡流混匀。作为DOPE储备液，将储备液保存于4℃冰箱。
DOPE工作液的配制：取DOPE储备液，用色谱甲醇稀释到如下浓度：2.0、1.0、0.5、0.25和0.125mg/mL。将稀释后的系列溶液作为DOPE工作液，用于标准曲线样品。
进一步地，所述方法还包括样品处理，所述样品处理主要步骤为：取200μL样品到离心管，加入200μL二次蒸馏水和400μL的2％Triton 100到离心管，混匀，室温下反应1小时。
COVID19 LPP疫苗为本申请人自主开发的mRNA复合磷脂脂质体疫苗，除磷脂外，该脂质体疫苗中还含有mRNA、鱼精蛋白等成分，因此分析时需首先加入曲拉通(Triton)打开脂质体溶解磷脂，还需有效避免其他成分以及杂质干扰。
进一步地，所述的2％Triton 100的制备方法为：取20μL Triton 100加入到980μL二次蒸馏水中，37℃水浴中溶解，混匀。
进一步地，所述方法进行检测时，进样量为30μL。
进一步地，所述方法还包括数据分析。
所述高效液相色谱检测DOPE和M5两种磷脂含量的方法包括以下步骤：标准品制备，样品处理，样品检测和数据分析。
依次测定不同浓度梯度的M5(0.125-2.0mg/mL)、DOPE(0.125-2.0mg/mL)色谱曲线，以及供试品的色谱。
所述数据分析步骤为：根据M5和DOPE的浓度和在色谱曲线上的峰面积，分别取对数进行线性拟合，得到线性方程和线性相关系数的平方R2。通过供试品溶液中M5和DOPE色谱曲线上的不同保留时间和峰面积，根据各自拟合直线，计算得到供试品溶液中M5和DOPE含量。经实验计算，DOPE和M5两种磷脂色谱峰面积与其质量浓度的线性相关系数平方(R2)大于0.993，两种磷脂的平均回收率在100％～102％之间，RSD均小于2.1％。
再一方面，本发明提供的高效液相色谱检测方法用于同时检测复合磷脂脂质体中DOPE和M5两种磷脂含量的用途。
由于磷脂的基架结构类似，再加上脂质体的成分比较复杂，以及磷脂的降解产物及其本身的杂质，DOPE和M5的分离存在一定的难度。采用本发明提供的高效液相色谱检测方法可同时检测复合磷脂脂质体中DOPE和M5两种磷脂含量。
进一步地，所述的复合磷脂脂质体为COVID19 LPP疫苗。
本发明建立了一种简便、快速的反相高效液相色谱－蒸发光检测器(HPLC－ELSD)法同时测定复合磷脂脂质体，尤其是COVID19 LPP疫苗中两种磷脂(DOPE、M5)的方法。以色谱柱(Agilent Poroshell 120EC-C18 pore size 12nm，3.0*100mm，2.7μm)为固定相，以0.1％三氟乙酸的二次蒸馏水为流动相A，色谱甲醇为流动相B进行梯度洗脱，DOPE和M5两种磷脂色谱峰面积与其质量浓度的线性相关系数平方(R2)大于0.993，两种磷脂的平均回收率在100％～102％之间，RSD均小于2.1％。该方法无需溶剂萃取，可直接分析复合磷脂脂质体，具有重现性好、稳定性高、前处理简单的特点，并可同时测定复合磷脂脂质体中DOPE、M5的含量，达到了定量分析相关要求，是首次实现LPP脂质体中这两种脂质的分离定量，适用于复合磷脂脂质体制备工艺的筛选与验证、稳定性试验和产品质量的检查。
本发明具有以下有益效果：
(1)简化了前处理工序，包括流动相配制和样品前处理工序，无需溶剂萃取，可直接分析复合磷脂脂质体。
(2)在流动相中加入0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)，增强阳离子脂质的保留，实现了脂质体中DOPE、M5与其他组分的良好分离，节省时间的同时也避免了额外操作给实验带来的误差。
(3)该方法更快捷、简便、易于操作，首次在复合磷脂脂质体中同时分离检测DOPE和M5含量。
(4)重现性好，稳定性高。
附图说明
图1、实施例1检测获得的M5对照品图谱，保留时间为14.179min
图2、实施例1检测获得的DOPE对照品图谱，保留时间为20.239min
图3、实施例2检测供试样品溶液中DOPE和M5含量的图谱
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1标准曲线绘制
一、储备液和工作液的配制
M5储备液的配制：精密称取32mg M5，用乙醇溶解为32mg/mL溶液，涡流混匀。作为M5储备液，将储备液保存于4℃冰箱。
M5工作液的配制：取M5储备液，用色谱甲醇稀释到如下浓度：2.0、1.0、0.50、0.25和0.125mg/mL。将稀释后的系列溶液作为M5工作液，用于标准曲线样品。
DOPE储备液的配制：精密称取32mg DOPE，用乙醇溶解为32mg/mL溶液，涡流混匀。作为DOPE储备液，将储备液保存于4℃冰箱。
DOPE工作液的配制：取DOPE储备液，用色谱甲醇稀释到如下浓度：2.0、1.0、0.5、0.25和0.125mg/mL。将稀释后的系列溶液作为DOPE工作液，用于标准曲线样品。
二、HPLC—ELSD检测
取M5、DOPE的0.125，0.25，0.5，1.0，2.0mg/ml五个浓度的标准曲线样品，进样量为30μL，进行HPLC—ELSD检测，具体检测条件为：
高效液相色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C18 pore size 12nm，3.0*100mm，2.7μm，流动相流速为0.4mL/min，柱温为35℃；蒸发光散射检测器蒸发器温度70℃，雾化器温度为70℃，气体流速1.6L/min，Date Rate：40Hz；流动相A为0.1％三氟乙酸溶液，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
流动相A的配制方法为：取1.0mL三氟乙酸加入到1.0L二次蒸馏水中，混匀。流动相B采用的甲醇为色谱级甲醇。
其中M5(2.0mg/mL)和DOPE(0.125mg/mL)对照品溶液的色谱图分别如图1图2所示，可知，M5在14.179min出峰，DOPE在20.239min出峰。
根据检测结果，以y＝峰面积的对数与x＝进样浓度的对数进行线性回归，回归方程分别为y＝1.2133x+5.3755，R2＝0.9939；y＝1.211x+5.3855，R2＝0.9996。结果表明，M5和DOPE在0.125～2.0mg/mL范围内线性关系良好。
实施例2样品检测
采用一批次疫苗成品(批号COVID19 LPP-200414)，取200μL到离心管，加入200μL二次蒸馏水和400μL的2％Triton 100(2.0％Triton 100的配制：量取20μL Triton 100加入到980μL二次蒸馏水中，37℃水浴中溶解，混匀)到离心管，混匀，室温下反应1小时，并按照实施例1的色谱条件，采用HPLC－ELSD法对疫苗成品中磷脂含量进行检测，记录色谱图，结果如图3所示。
由图3可知，采用该方法可以分离出样品中的DOPE和M5两种磷脂，脂质体中DOPE和M5能同时被检测到分离效果良好，同时不会受杂质峰的干扰。
经检测并计算分析，获得批号COVID19 LPP-200414样品中DOPE和M5的含量见表1所示，通过与理论投入量(4mg/mL)的对比可得该方法测定脂质体中DOPE和M5的含量是可信的。
表1供试品中DOPE和M5的含量
实施例3重复性考察
取同一批次疫苗成品(批号COVID19 LPP-200416)，取200μL到离心管，加入200μL二次蒸馏水和400μL的2％Triton 100(2.0％Triton 100的配制：量取20μL Triton 100加入到980μL二次蒸馏水中，37℃水浴中溶解，混匀)到离心管，混匀，室温下反应1小时，配制成供试样品，平行6份，按实施例1的色谱条件进行检测，以峰面积计，结果如表2所示。
表2、重复性实验结果
根据表2可以看出，显示的6个样品的M5和DOPE的峰面积都非常接近，方差RSD分别为0.69％和0.85％，都小于1％，表明该检测方法重复性非常好。
实施例4回收率考察
取100μL的疫苗成品(批号COVID19 LPP-200415)于1.5mL离心管中，分别精密加入100μL的DOPE或M5对照溶液(浓度分别为2.4、4.0、5.0mg/mL)后，再按照实施例2的配制方法配制供试样品，得到低、中、高3个浓度的供试样品溶液，每个浓度平行3份。按照实施例1的色谱条件进行测定，记录色谱图。结果如表3所示。
表3、回收率实验结果
根据表3可以看出，该检测方法测定复合磷脂脂质体中M5的回收率在98.3％～103.5％之间，平均回收率为101.08％，平均相对标准偏差2.07％；DOPE的回收率在99.1％～103.9％之间，平均回收率为100.91％，平均相对标准偏差2.04％，表明该方法测定复合磷脂脂质体中DOPE和M5加样的回收率结果非常好。
实施例5本方法与现有技术的流动相组成对比
本实施例比较了本方法和现有技术中的其他方法所采用的流动相组成，其中，其他方法1为梁敏等人采用的HPLC-RID法测定脂质体中溶血卵磷脂(PEG修饰脂质体中溶血卵磷脂和脂肪酸的HPLC-RID法测定，中国医药工业杂志,2015,046(007):750-753)；其他方法2为李小翠等人采用的HPLC-ELSD法测定顺铂脂质体中的DSPE-PEG2000(HPLC-ELSD法测定顺铂脂质体中DSPE-PEG2000含量[J].湖北大学学报:自然科学版,2016(04):285-287)；其他方法3为赵琦琰等人采用的HPLC－ELSD法测定花生中磷脂含量(直接进样HPLC－ELSD法测定花生中磷脂含量[J].中国油脂，2018,43(03):131-135)；其他方法4为Uran S等人的正相液相色谱法分析人血中磷脂种类(Analysis of phospholipid species in humanblood using normal-phase liquid chromatography coupled with electrosprayionization ion-trap tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2001,758(2):265-275)，结果如表4所示。
表4流动相组成对比
从表4可以看出，本发明所采用的流动相组成更简单，仅由两种成分组成，更方便配制，操作简便，通过洗脱即可完全分离出DOPE和M5；而其他方法采用的流动相分别需要三种及三种以上成分，配制过程更加复杂，但仍然不能用于同时检测出DOPE和M5。本发明采用较简单的流动相组成，即可同时获得针对复合磷脂脂质体中DOPE和M5两种磷脂含量的理想的检测结果，进一步证明本发明方法的简单快速和高效。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
