特异结合卡介苗BCG的七肽、编码基因、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及特异结合卡介苗BCG的七肽、编码基因、制备方法及用途。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的慢性致死性人兽共患病，是一种严重威胁公共卫生安全的世界性传染病。据世界卫生组织报道，2017年，全球共有约1040万结核病例，其中新增640万例。每年约有160万死于该病，包括与艾滋病共感染的患者。但患者康复后体内仍然有少量的滞留菌，当机体处于免疫抑制状态或者免疫力低下时，滞留菌会大量增殖，并最终导致结核病的发生。此时结核病的复发，会使结核病的治疗更加困难。近年来，随着Mtb多重耐药性菌株的出现、艾滋病的共感染、结核病病原体的交叉感染、人口流动的增加以及对结核病控制的忽视等因素，使得结核病的防控难度加大。
卡介苗(BCG)仍是目前唯一被批准使用的抗结核疫苗，但其对成人的保护效果备受争议。研制新型结核病疫苗来降低结核病的感染率与发病率极为迫切和必要。结核病新疫苗的研究中，对新疫苗的研制总体策略已基本达成共识，即重点研制替代BCG的初免用疫苗、BCG接种后的加强免疫用疫苗和潜伏感染人群预防用疫苗，从而针对不同感染背景与免疫状态的人群实施精准免疫，构建全人群的结核病免疫预防体系。目前，唯一可用的结核病疫苗BCG，自1921年首次应用于人类以来，其免疫接种历史已近百年。
目前的靶向药物递送系统中的给药载体包括单克隆抗体、多肽、脂质体和纳米粒等，其中的多肽因具有高亲和性、较好的特异性和安全性的特点而受到广泛关注，目前已成为一种发展迅速且应用日益广泛的新型靶向给药载体。靶向的多肽偶联药物递送系统，首先要发现具有靶向结合活性的多肽载体，可以通过噬菌体展示肽库筛选、化学合成活性肽的方法获取靶向多肽载体。因BCG免疫保护效果的不确定性，单独用一种结核疫苗如BCG免疫通常不足以产生较好的免疫保护作用。因此，在BCG初次免疫的基础上，通过靶向药物递送系统进行加强免疫以达到增强免疫效果之目的，即初始-加强免疫策略，使得BCG可以发挥其免疫学功能。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供特异性强、亲和性高、活性好的特异结合卡介苗BCG的七肽及编码基因。
本发明另一目的是提供所述七肽及编码基因的制备方法。
本发明最后一目的是提供所述七肽及编码基因的用途。
技术方案：本发明提供一种特异结合卡介苗BCG的七肽，氨基酸序列为Asn TrpLeu Gly Ser Thr Phe，其编码基因的核苷酸序列为gtccagaatgttgccgacaca。
进一步地，所述七肽以融合蛋白的形式融合表达在噬菌体外壳蛋白PVIII或PIII的N端。
所述的特异结合卡介苗BCG的七肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将BCG包被在平板上，封闭平板，将噬菌体展示随机七肽库加入包被和封闭后的平板中，进行至少4轮生物学淘选并测定每轮淘选后的噬菌体滴度；
(2)从至少第4轮计数平板上随机选择数珠噬菌体，挑选每一个噬菌体至OD0.5的E.coli ER2738菌液中，培养4-5h，后离心，取上清，重复两次，加入PEG-8000/NaCl对噬菌体进行沉淀，后离心，取上清，用TBS溶液溶解，得到每一个噬菌体单克隆的扩增产物；
(3)将噬菌体单克隆扩增产物加入到已经包被好BCG的平板上，通过噬菌体ELISA测定各株噬菌体对结核分支杆菌的结合强度，并进行测序。
所述的特异结合卡介苗BCG的七肽在制备结核病靶向药物递送系统中的用途。
所述的特异结合卡介苗BCG的七肽在结核病检测中的用途。
有益效果：本发明使用噬菌体展示技术进行淘选，获得多肽序列，通过该多肽对BCG特异专一结合，用于BCG的靶向治疗，提高诊断灵敏度和特异性，为结核病靶向诊断提供一种新的方法。另外还可利用筛选出的多肽特异结合BCG的特点，为BCG的入膜，递送，起到主动靶向的作用，特异性结合BCG的细菌表面以达到靶向输送的作用。同时，本发明的七肽特异性强、亲和性高、活性好。
附图说明
图1是挑选的20个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD450值；
图2是竞争ELISA检测BCG，OD值与BCG浓度曲线，横坐标为BCG的浓度，纵坐标为OD450值；
图3是将Thanos2注射到C57小鼠模型的肺部的免疫组化图，A图为对照组，B图为Thanos2组。
具体实施方式
实施例主要试剂如下：
(1)LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，高压灭菌，室温贮存；
(2)LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；
(3)顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，分成50ml等份，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
(4)四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于70％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；
(5)LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；
(6)PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
(7)IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1g Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；
(8)TBS：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl。高压灭菌，室温贮存；
(9)PBST溶液：在PBS溶液中加入体积比为0.05％/0.02％的吐温20
(10)碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，4M NaI。室温避光贮存；
(11)0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)，1M Tris-HCl(pH 9.1)，高压灭菌，室温贮存。
实施例1.噬菌体文库的扩增及纯化
接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床孵育至对数中期(OD 0.5)；加入10ul噬菌体，37℃，200rpm摇床震荡4-5h，10000g离心10min，取上清；再次10000g离心10min，取80％上清，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，4℃静置过夜。次日取出，白色沉淀即为噬菌体。10000g离心15分钟，倒掉上清，瞬时离心后轻轻吸出残留溶液；加入1ml TBS溶液溶解白色沉淀。
实施例2.结合BCG的七肽的淘选及鉴定
(1)噬菌体滴度测定
接种E.coli ER2738单菌落于5-10ml LB液体培养基中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD600：～0.5)；微波炉加热融化顶层琼脂糖培养基，分成3mL/份分装到灭菌试管中，每个噬菌体稀释度用一管，保存于45℃备用；37℃预温LB/IPTG/Xgal琼脂平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用；用LB培养液对噬菌体进行10倍比系列稀释(建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104)；每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染；当大肠杆菌菌液达对数中期时，将菌液分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管；每管大肠杆菌菌液中分别加入10μL不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min；将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂糖培养基管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal琼脂平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜；检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数，然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pifu)滴度。
(2)BCG特异性噬菌体的富集
以50μg/mL浓度的BCG包被免疫试管并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入噬菌体肽库，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加0.2mol/L Glycine-HCl(pH2.2)1mL振荡10min洗脱特异结合的噬菌体，加150μL 1mol/L Tris-HCl(pH 9.1)中和，取10μL洗脱产物计数噬菌体的滴度，其余洗脱产物感染大肠杆菌ER2738扩增并纯化噬菌体，得到次级库，对次级库滴度进行测定后进入下一轮筛选程序。
(3)特异性结合噬菌体的筛选
重复步骤2的方法再进行四轮淘选，每一轮的滴度如表1所示，第1轮洗涤条件是体积比0.1％的Tween20，第2和第3轮Tween-20浓度变为0.3％(v/v)，第4轮Tween-20浓度为0.5％(v/v)。
表1特异性噬菌体富集第一轮至第四轮噬菌体投入产出表
实施例3.BCG特异性噬菌体的鉴定
随机挑取第三轮筛选后滴度测定平板上的分离良好的单菌落20个，经过分别培养纯化后，用噬菌体ELISA检测各株噬菌体对BCG的结合活性。具体步骤如下为：分别以BCG和Blocking包被酶标板，每组三个平行，并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次后加入纯化后的噬菌体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次，加TMB底物室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于450nm波长测定OD值，以P/N≥2.1为阳性。
检测结果如图1显示，有15株噬菌体表现出对BCG的结合。提取这15株噬菌体ssDNA，阳性克隆的菌液DNA测序由上海生工生物技术公司完成，引物为-96gIII。实施例中涉及的核苷酸序列：gtccagaatgttgccgacaca。
使用DNAMAN和Swiss数据库序列进行分析。获得相应的氨基酸序列：Asn Trp LeuGly Ser Thr Phe。
分别以不同浓度BCG和Blocking包被平板并于4℃封闭过夜，TBST洗涤6次，加入展示有Thanos2序列的噬菌体2*1011(以相同滴度的无关噬菌体为对照)，TBST洗涤10次去除未结合的噬菌体，加入HRP标记的鼠抗M13单克隆抗体100μL，37℃振荡孵育1h，TBST洗涤10次；加TMB室温避光反应5～10min，2mol/L硫酸终止反应，于490nm波长测定OD值。结果如图2所示，展示有Thanos2序列的噬菌体表现出对BCG的特异性结合。
实施例4.序列体内结合实验
取C57小鼠5只，采用腹腔注射方法接种BCG 40μL，浓度为2.5*108CFU/mL，称作BCG组；另取C57小鼠5，采用腹腔注射方法注射等量的PBS溶液，作为BCG小鼠模型的对照组。分别选取不同组的C57小鼠的肺组织切片，进行特异性噬菌体免疫组化检测，如图3所示，可以发现结核病小鼠模型病变部位出现典型的黄色或棕色颗粒，和对照组有显著差异。提示可以应用该七肽，建立靶向结合BCG定向加强治疗的目的。
