分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域
本申请是国际申请日为2006年01月05日的申请号为200680001831.4的中国发明专利申请“分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域”的分案申请。 t
本发明涉及用于工程改造(engineer)和制造经修饰的免疫球蛋白的方法。 t
一般领域是以赋予蛋白质以特异性结合特性为目的的蛋白质工程。更具体的说，本发明中工程改造的实用蛋白质是免疫球蛋白（抗体），甚至更具体的说，是免疫球蛋白的单一结构域或者成对或组合的单一结构域。免疫球蛋白的特异性结合特性是重要特征，因为它们决定了与其它分子诸如抗原的相互作用，并使得免疫球蛋白可用于诊断和治疗应用。 t
本文将以完整IgG1免疫球蛋白为例解释基本的抗体结构。 t
两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)联合，形成Y形抗体分子。每条重链具有四个结构域。氨基末端可变区(VH)位于Y的尖端。接着是三个恒定区：CH1、CH2和羧基末端CH3，位于Y主干的底部。一小段转换区(switch)连接重链可变区和恒定区。铰链连接CH2和CH3（Fc片段）与抗体的剩余部分（Fab片段）。通过蛋白水解切割完整抗体分子中的铰链可生成一个Fc和两个相同的Fab片段。轻链由两个结构域构成，可变区(VL)和恒定区(CL)，以转换区分开。 t
铰链区中的二硫键连接两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链偶联。根据免疫球蛋白的类别，Asn连接的碳水化合物部分附着于恒定区中的不同位置。对于IgG1，铰链区中的两个二硫键，在Cys235和Cys238对之间，联合两条重链。轻链通过另外两个二硫键与重链偶联，在CH1结构域的Cys229s和CL结构域的Cys214s之间。碳水化合物部分附着于每个CH2的Asn306，在Y的主干中产生显著的凸出。 t
这些特征具有深刻的功能后果。重链和轻链二者的可变区(VH和VL) 位于Y的“尖端”，它们在此站位，与抗原起反应。分子的这个尖端是氨基酸序列N末端所在的一侧。Y的主干以有效介导效应物功能的方式凸出，诸如激活补体和与Fc受体的相互作用，或者ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域凸出，便于与效应物蛋白质相互作用。氨基酸序列的C末端位于尖端的对侧，可称为Y的“底部”。完整IgG1的结构见图1a。 t
在抗体中找到两种类型的轻链，称为拉姆达（λ）和卡帕（κ）。给定免疫球蛋白或具有κ链或具有λ链，从未具有每种各一条。在具有λ或κ链的抗体之间没有发现功能差异。 t
人免疫球蛋白主要类别单体的结构组织见图1b。各类别的差异在于其各自重链的组成和序列。IgM和IgE都缺乏铰链区，但都包含额外的重链结构域（CH4）。连接各链的二硫键（线）的数目和位置在各同种型之间有不同。它们还在N连接碳水化合物基团的分布中有不同，以圆象征性表示。 t
抗体分子的每个结构域具有相似的结构，即两组压紧的β片层在压缩的反平行β桶中彼此对立。此保守结构称为免疫球蛋白折叠结构(fold)。恒定区的免疫球蛋白折叠结构包含对立压紧的3链片层和4链片层。折叠结构通过每个片层的β折叠链之间的氢键、内部对立片层的残基之间的疏水键、和片层之间的二硫键得到稳定。3链片层包含C、F和G链，4链片层包含A、B、E和D链。字母A-G表示β折叠链沿免疫球蛋白折叠结构的氨基酸序列的顺序位置。 t
可变区的折叠结构具有9条β折叠链，排列成4条链和5条链的两组片层。5链片层在结构上与恒定区的3链片层类似，但包含额外的C′和C″链。其余链（A、B、C、D、E、F、G）与它们在恒定区免疫球蛋白折叠结构中的对应物具有相同的拓扑和相似的结构。一个二硫键连接对立片层中的B和F链，与恒定区中的一样。图2图示了免疫球蛋白恒定区和可变区的免疫球蛋白折叠结构。 t
免疫球蛋白轻链和重链的恒定区都包含三个高变环或互补决定区(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)在β折叠桶的一端簇集。CDR是连接免疫球蛋白折叠结构的β折叠链B-C、C′-C″和F-G的环。CDR中的残基在免疫球蛋白分子间有变化，赋予各抗体以抗原特异性。 t
抗体分子尖端的VL和VH结构域压紧，使得6个CDR（每个结构域3个）协作而构建供抗原特异性结合的表面（或空腔）。如此，抗体的天然抗 原结合位点由连接轻链可变区的B-C、C′-C″和F-G链及重链可变区的B-C、C′-C″和F-G链的环构成。 t
使用蛋白质的三维结构作为设计的辅助手段，已经使用蛋白质的核心结构作为支架将位于许多蛋白质的表面上的氨基酸残基随机化。此策略的例子的描述或综述见下列参考文献（收入本文作为参考）：Nygren PA,Uhlen M.,Curr Opin Struct Biol.(1997)7:463-9;Binz HK,Amstutz P,Kohl A,Stumpp MT,Briand C,Forrer P,Grutter MG,Pluckthun A.Nat Biotechnol.(2004)22:575-82;Vogt M,Skerra A.Chembiochem.(2004)5:191-9;US 6,562,617。 t
此技术的基本原理基于如下观察结果：许多蛋白质具有稳定的核心，它通过二级结构元件诸如β折叠片层或α螺旋的特定排列形成，所述二级结构元件通过诸如环、转角或随机螺旋的结构相互连接。典型的，这后三种结构元件对蛋白质的整体结构不太重要，这些结构元件中的氨基酸残基常常可交换而不破坏蛋白质的总体折叠结构。此设计原理的一个天然存在例子是抗体的CDR。人工例子包括脂笼蛋白(lipocalin)、锚蛋白(ankyrin)和其它蛋白质支架。 t
天然免疫球蛋白中CDR环以外的环不具有抗原结合或表位结合特异性，但促成整个免疫球蛋白分子的正确折叠和/或其效应物或其它功能，因此为了本发明的目的称为结构环。 t
在美国专利第6,294,654号中显示了可生成改变的抗体，其中可将肽抗原在铰链区和可变区之间的CH1区中掺入抗体(Ab)的非CDR环，所得Ab可在APC中摄取，使得该肽抗原在MHC II的背景中呈递在APC的表面，由此产生免疫应答。这些插入的肽是表位，而载体分子的整体结构不重要。演示了可将ras肽置于免疫球蛋白的（非CDR）环上，而免疫球蛋白仍然分泌。细胞中有严格的“质量控制”，阻止免疫球蛋白分泌，除非它正确折叠，而改变环的氨基酸序列可能引起蛋白质折叠成细胞将检测为不正确并因此降解它的结构。如此，在所示例子以外，认为进一步修饰结构环而不改变免疫球蛋白的性质是困难的。 t
美国专利申请2004/0101905记载了包含靶结合位点和Fc效应物肽的结合分子。Fc效应物肽指与效应物分子相互作用的肽。已经显示了将效应物肽插入免疫球蛋白片段的CH1结构域的非CDR环。 t
Fc效应物肽是在抗体的非CDR环中天然存在的结构，因此预期在移植 到免疫球蛋白的不同的相当位置上时不会干扰免疫球蛋白的结构。 t
无论如何，依照本公开书移植到非CDR环中的每种肽很有可能在它被选择的不同结构环境中是没有活性的。 t
上文提到的两份现有技术文件中都声明难以将肽插入应当保持其结构和功能的环，因为不干扰免疫球蛋白折叠结构是至关重要的，因为这对于功能和分泌是重要的。 t
美国专利申请2004/0132101和2005/0244403记载了对效应物配体具有改变的结合亲和力的突变型免疫球蛋白，所述效应物配体是该抗体结构环的天然配体。在此文件中，记载了横跨整个免疫球蛋白分子的多个区域中影响完整抗体的效应物功能的许多突变。 t
其它现有技术文件显示，为了操作现有抗原结合位点的目的，由此引入新的结合特性，至今已经采用免疫球蛋白样支架。然而，至今只有CDR区为抗原结合进行了工程改造，换言之，在免疫球蛋白折叠结构的情况中，只修饰了天然抗原结合位点以改变其结合亲和力或特异性。有极大量的文献记载了不同形式的此类经操作免疫球蛋白，其常常以单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表达，或是展示在噬菌体颗粒的表面上或是在各种原核或真核表达系统中可溶性表达。在本领域领先的作者中有Greg Winter、Andreas Plückthun和Hennie Hoogenboom。 t
本发明的一个目标是提供引入了新的抗原结合位点的免疫球蛋白，及用于工程改造和制造所述免疫球蛋白的方法。 t
因此，本发明涉及用于工程改造免疫球蛋白的方法，包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中的至少一处修饰，并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合，其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位，包括下列步骤： t
－提供编码包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸， t
－修饰至少一个所述结构环区域的至少一个核苷酸残基， t
－将所述经修饰的核酸转移入表达系统， t
－表达所述经修饰的免疫球蛋白， t
－使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触，并 t
－测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位。 t
具体而言，本发明涉及用于工程改造特异性结合选自下组的抗原的表位 的免疫球蛋白的方法：变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原。通过结构环区域中的修饰，免疫球蛋白可工程改造成结合该表位。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白特异性结合至少两种彼此不同的此类表位，所述表位或是相同抗原的或是不同抗原的。 t
例如，依照本发明的方法指工程改造特异性结合至少一种第一表位的免疫球蛋白，且在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中包含至少一个修饰，并测定所述至少一个环区域对至少一种第二表位的特异性结合，所述表位选自上文所述抗原的组，其中未修饰的结构环区域（非CDR区）不特异性结合所述至少一种第二表位，包括下列步骤： t
－提供编码特异性结合至少一种第一表位、包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸， t
－修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基， t
－将所述经修饰的核酸转移入表达系统中， t
－表达所述经修饰的免疫球蛋白， t
－使表达的经修饰的免疫球蛋白与所述至少一种第二表位接触，并 t
－测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二表位。 t
依照本发明的方法优选指所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中的至少一处修饰并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的抗原的特异性结合：变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生动物抗原，其中包含未修饰的结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种抗原。 t
依照本发明待修饰的术语“免疫球蛋白”（在用于本文时术语免疫球蛋白和抗体可互换）可展现单特异性或多特异性，或者多价结合特性，至少两个、优选至少三个对例如抗原、效应物分子/蛋白质的表位的特异性结合位点。依照本发明的免疫球蛋白还有本领域公认的功能性片段，诸如Fc、Fab、scFv、CH/CL结构域的单链二聚体、Fv、或者免疫球蛋白、完整抗体的重链和轻链可变区（诸如Fd、Vl、Vk、Vh）和恒定区（诸如CH1、CH2、CH3、CH4、Cl和Ck）的结构域的其它衍生物或组合，以及由以结构环相连的免疫球蛋白结构域的两条β折叠链组成的微型结构域(mini-domain)。 t
应当理解，术语“免疫球蛋白”、“经修饰的免疫球蛋白”或“依照本发明的 免疫球蛋白”同样包括免疫球蛋白的衍生物。衍生物指一种或多种本发明免疫球蛋白的任意组合和/或其中本发明免疫球蛋白的任何结构域或微型结构域可在一种或多种其它蛋白质（诸如其它免疫球蛋白、配体、支架蛋白、酶、毒素等等）的任何位置融合的融合蛋白。本发明免疫球蛋白的衍生物还可通过以各种化学技术诸如共价偶联、静电相互作用、二硫键等结合其它物质来获得。 t
结合免疫球蛋白的其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子、或其任意组合（例如PEG、前药或药物）。衍生物还有具有相同氨基酸序列但完全或部分由非天然或化学修饰氨基酸制备的免疫球蛋白。 t
依照本发明的工程改造分子作为独立的蛋白质以及融合蛋白或衍生物都是有用的，最典型的是作为更大抗体结构或完整抗体分子或其部分诸如Fab、Fc片段、Fv片段及其它的一部分融合。将有可能使用工程改造的蛋白质来生成单特异性、双特异性、三特异性分子，甚至可能同时携带多种特异性，而且同时将有可能依照此类分子的计划用途的要求同时控制和预先选择结合的效价。 t
依照本发明，可将所有种类的变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原的抗原结合区或抗原结合位点引入给定抗体结构的结构环。 t
依照本发明的术语“抗原”应当指已知与免疫球蛋白的CDR环区域相互作用或能够相互作用的分子或结构。现有技术的结构环区域不与抗原相互作用，但是促成整体结构和/或对效应物分子的结合。 t
依照本发明的术语“变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原”应当包括能够为抗体结构所识别的所有变应原和抗原及此类分子的片段（尤其是通常称为“表位”（例如B细胞表位）的子结构(substructure)），只要它们是免疫学相关的，即也受到天然或单克隆抗体的识别。 t
依照本发明的术语“表位”应当指可完全构成本发明免疫球蛋白的结合结构域的特定结合配偶体或是特定结合配偶体的一部分的分子结构。 t
在化学上，表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、无机物质、或其衍生物、及其任意组合构成。若表位是多肽，则它将通常在肽中包含至少3个氨基酸，优选8-50个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。肽的长度没有临界上 限(critical upper limit)，它可包含多肽序列的几乎全长。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽链的一段一级序列构成。线性表位可以是连续的或交叠的。构象表位由通过多肽的折叠而聚到一起，形成三级结构的氨基酸构成，而且所述氨基酸在线性序列中不必彼此相邻。 t
具体而言，表位是诊断相关分子的至少一部分，即样品中表位的存在与否与疾病或与健康状况或与制造中的进程状态或与环境和食物状况定性或定量相关。表位还可以是治疗相关分子的至少一部分，即可由改变疾病进程的特异性结合结构域靶向的分子。 t
优选的“变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原”指那些早已证明就是或者能够成为免疫学或治疗相关的变应原或抗原，尤其是那些已经测试了临床功效的。 t
另一方面，依照本发明的另一个方面，还可在结构环区域中引入其它结合性能，例如对小分子诸如药物或酶、酶的催化位点或酶底物，或者对酶底物转变状态类似物的结合性能。 t
优选的是，结构环中的新的抗原结合位点对未修饰的免疫球蛋白而言是外源的。如此，像效应物分子或Fc受体的靶物优选排除在依照本发明的免疫球蛋白的结合分子和特异性以外。 t
优选的是，结构环中的新的抗原结合位点是通过由选定核酸编码的免疫球蛋白的替换、缺失和/或插入而引入的。 t
依照本发明的另一个优选实施方案，至少一个核苷酸的修饰导致由所述核酸编码的免疫球蛋白的替换、缺失和/或插入。 t
至少一个环区域的修饰可导致一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或插入，优选点突变、整个环的交换，更优选至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、多至30个氨基酸的改变。 t
还优选定点随机突变。通过这种方法，使用随机生成的插入物在此类结构环中交换或引入环的一个或多个特定氨基酸残基。或者，优选使用组合方法。 t
优选通过随机、半随机或特别是通过定点随机诱变方法突变或修饰至少一个环区域。这些方法可用于在本发明免疫球蛋白的期望位置产生氨基酸修饰。在这些情况中，位置是随机选择的，或者氨基酸变化是使用过分简单化原则(simplistic rule)产生的。例如，可将所有残基突变成丙氨酸，称为丙氨 酸扫描。此类方法可偶联更加复杂的工程改造方法，它们采用选择方法来筛选更高水平的序列多样性。 t
依照本发明的一种优选方法涉及随机修饰的核酸分子，它包含至少一个具有序列5′-NNS-3′、5’-NNN-3’或5’-NNK-3’的核苷酸重复单元。 t
随机修饰的核酸分子可包含上文鉴定的重复单元，它们编码所有已知的天然存在氨基酸。 t
正如本领域众所周知的，有多种选择技术可用于鉴定和分离具有某些结合特性和亲和力的蛋白质，包括例如展示技术诸如噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示、等等，见下文所述。用于生成和筛选抗体变体的方法是本领域众所周知的。用于抗体分子生物学、表达、纯化、和筛选的通用方法记载于《Antibody Engineering》，Duebel & Kontermann编，Springer-Verlag，Heidelberg，2001；及Hayhurst & Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol5:683-689;Maynard&Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-76。 t
依照本发明的“结构环”或“非CDR环”以如下方式理解：免疫球蛋白由具有所谓的免疫球蛋白折叠结构的结构域构成。本质上，反平行β片层由环相连而形成压缩的反平行β折叠桶。在可变区中，结构域的有些环本质上促成抗体的特异性，即对抗原的结合。这些环称为CDR环。相反，抗体结构域的所有其它环促成分子的结构和/或效应物功能。这些环在本文中定义为结构环或非CDR环。 t
可将编码经修饰的免疫球蛋白（而且在下文整篇说明书中总是包括免疫球蛋白片段）的核酸分子克隆到宿主细胞中，表达，并测定它们的结合特异性。这些实践使用众所周知的程序进行，可用于本发明的多种方法记载于《Molecular Cloning--A Laboratory Manual》，第3版，Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001及《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons。可将编码本发明经修饰的免疫球蛋白的核酸掺入表达载体以表达所述免疫球蛋白。表达载体典型的包含与控制或调节序列、选择标志、任何融合配偶体、和/或另外的元件可操作连接的免疫球蛋白，即置于功能性关系中。为了生成本发明的经修饰的免疫球蛋白，可以在适于诱导或引起经修饰的免疫球蛋白表达的条件下培养经包含编码经修饰的免疫球蛋白的核酸的核酸，优选表达载体转化的宿主细胞。将外源核酸分子导入宿主的方法是本领域众所周知的，而且将随所用宿主而变化。当然， 还可采用非细胞或无细胞表达系统来表达经修饰的免疫球蛋白。 t
在本发明的一个优选实施方案中，在表达后纯化或分离经修饰的免疫球蛋白。经修饰的免疫球蛋白可以以本领域技术人员知道的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括层析技术、电泳、免疫学、沉淀、透析、过滤、浓缩、和层析聚焦技术。特定融合配偶体常常可提供纯化方法。例如，若采用GST融合，则可使用谷胱甘肽树脂来纯化抗体；若采用His标签，则可使用Ni+2亲和层析；若采用flag标签，则可使用固定化抗flag抗体。关于合适纯化技术的一般指导，参阅《Antibody Purification:Principles and Practice》，第3版，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994。当然，还有可能在宿主的表面上表达依照本发明的经修饰的免疫球蛋白，特别是在细菌、昆虫或酵母细胞的表面上或者在噬菌体或病毒的表面上。 t
经修饰的免疫球蛋白可使用多种方法筛选，包括但不限于那些使用体外测定法、体内和基于细胞的测定法、和选择技术的。可在筛选程序中利用自动化和高通量筛选技术。筛选可采用融合配偶体或标记物，例如酶、免疫标记物、同位素标记物、或小分子标记物诸如荧光或比色染料或发光分子。 t
在一个优选的实施方案中，在体外测定法中筛选免疫球蛋白的功能性和/或生物物理学特性。在一个优选的实施方案中，对抗体筛选功能性，例如它催化反应的能力或它对其靶物的结合亲和力。 t
测定法可采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光、或同位素标记物。 t
正如本领域知道的，有些筛选方法选择文库的有利成员。这些方法在本文中称为“选择方法”，而且这些方法可在本发明中用于筛选经修饰的免疫球蛋白。在使用筛选方法筛选免疫球蛋白文库时，只有文库中那些有利的，即达到有些选择标准的成员得到繁殖、分离、和/或观察。应当领会，因为只观察到最合适的变体，所以此类方法能够筛选比那些可通过个别测定文库成员合适性的方法筛选的文库更大的文库。可通过共价或非共价连接免疫球蛋白的表型与其基因型，即抗体的功能与编码它的核酸的任何方法、技术、或融合配偶体来进行选择。例如，通过将文库成员与基因III蛋白融合，从而能够使用噬菌体展示作为选择方法。这样，达到有些标准例如对免疫球蛋白的靶物的结合亲和力的经修饰的免疫球蛋白的选择或分离还选择或分离了编码它的核酸。一旦分离，然后可扩增编码经修饰的免疫球蛋白的一个或多 个基因。可重复称为淘选的这个分离和扩增过程，从而富集文库中有利的抗体变体。所附核酸的核酸测序最终容许基因的鉴定。 t
本领域知道多种选择方法可在本发明中用于筛选免疫球蛋白文库。这些包括但不限于噬菌体展示(《Phage display of peptides and antibodies:a laboratory manual》，Kay等人，1996，Academic Press，San Diego，Calif.，1996;Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832-10838;Smith,1985,Science 228:1315-1317)及其衍生物，诸如选择性噬菌体感染(selective phage infection)(Malmborg et al.,1997,J Mol Biol 273:544-551)、选择性感染性噬菌体(selectively infective pahge)(Krebber et al.,1997,J Mol Biol 268:619-630)、和延迟感染性淘选(delayed infectivity panning)(Benhar et al.,2000,J Mol Biol 301:893-904)，细胞表面展示(Witrrup,2001,Curr Opin Biotechnol,12:395-399)诸如展示在细菌(Georgiou et al.,1997,Nat Biotechnol 15:29-34;Georgiou et al.,1993,Trends Biotechnol 11:6-10;Lee et al.,2000,Nat Biotechnol 18:645-648;Jun et al.,1998,Nat Biotechnol 16:576-80)、酵母(Boder & Wittrup,2000,Methods Enzymol 328:430-44;Boder & Wittrup,1997,Nat Biotechnol15:553-557)、和哺乳动物细胞(Whitehorn et al.,1995,Bio/technology13:1215-1219)上，以及体外展示技术(Amstutz et al.,2001,Curr Opin Biotechnol 12:400-405)，诸如多核糖体展示(Mattheakis et al.,1994,Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)、核糖体展示(Hanes et al.,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942)、mRNA展示(Roberts & Szostak,1997,Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302;Nemoto et al.,1997,FEBS Lett 414:405-408)、和核糖体灭活展示系统(Zhou et al.,2002,J Am Chem Soc 124,538-543)。 t
可用于本发明的其它选择方法包括不依赖于展示的方法，诸如体内方法，包括但不限于周质表达和细胞计量筛选(Chen et al.,2001,Nat Biotechnol19:537-542)、抗体片段互补测定法(Johnsson & Varshavsky,1994,Proc NatlAcad Sci USA 91:10340-10344;Pelletier et al.,1998,Proc Natl Acad Sci USA95:12141-12146)、和酵母双杂交体筛选(Fields & Song,1989,Nature340:245-246)，以选择模式使用(Visintin et al.,1999,Proc Natl Acad Sci USA96:11723-11728)。在一个备选实施方案中，通过结合表达载体上的特定序列从而将融合配偶体和相关Fc变体文库成员与编码它们的核酸的融合配偶体共价或非共价连接来进行选择。例如，PCT WO 00/22906;PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852;PCT WO 02/04853;PCT WO 02/08023;PCT WO 01/28702;及PCT WO 02/07466记载了这样的融合配偶体和可用于本发明的技术。在一个备选实施方案中，若抗体的表达赋予细胞以有些生长、繁殖、或存活优势，则可发生体内选择。 t
称为“定向进化”方法的有些选择方法包括在选择过程中交配或繁殖有利序列，有时掺入新的突变。本领域技术人员应当领会，定向进化方法可便于文库中最有利序列的鉴定，而且可提高所筛选序列的多样性。本领域知道多种定向进化方法可在本发明中用于筛选抗体变体，包括但不限于DNA改组(PCT WO 00/42561 A3;PCT WO 01/70947 A3)、外显子改组(美国专利第6,365,377号;Kolkman & Stemmer,2001,Nat Biotechnol 19:423-428)、家族改组(Crameri et al.,1998,Nature 391:288-291;美国专利第6,376,246号)、RACHITTTM(Coco et al.,2001,Nat Biotechnol 19:354-359;PCT WO 02/06469)、STEP和体外重组的随机引发(Zhao et al.,1998,Nat Biotechnol16:258-261;Shao et al.,1998,Nucleic Acids Res 26:681-683)、外切核酸酶介导的基因装配(美国专利第6,352,842号;美国专利第6,361,974号)、基因位点饱和诱变TM(美国专利第6,358,709号)、基因再装配TM(美国专利第6,358,709号)、SCRATCHY(Lutz et al.,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253)、DNA片段化法(Kikuchi et al.,Gene 236:159-167)、单链DNA改组(Kikuchi et al.,2000,Gene 243:133-137)、和AMEsystemTM定向进化抗体工程改造技术(Applied Molecular Evolution)(美国专利第5,824,514号;美国专利第5,817,483号;美国专利第5,814,476号;美国专利第5,763,192号;美国专利第5,723,323号)。 t
在一个优选的实施方案中，使用一种或多种基于细胞的或体内测定法筛选抗体变体。对于此类测定法，典型的是外源添加已纯化或未纯化的经修饰的免疫球蛋白，使得细胞暴露于属于文库的个别免疫球蛋白或免疫球蛋白集合。这些测定法典型的但非总是基于免疫球蛋白的功能；即，抗体结合其靶物和介导有些生物化学事件，例如效应物功能、配体/受体结合抑制、凋亡、等等的能力。此类测定法常常牵涉监测细胞对抗体的应答，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态的改变、或转录激活诸如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，此类测定法可测量抗体变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。对于有些测定法，可能需要添加靶细胞以外的额外细胞或成分，例如血清补 体或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等等。此类额外细胞可以来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。免疫球蛋白可引起表达靶物的某些细胞系凋亡，或者它们可介导已经添加到测定法中的免疫细胞对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或存活力的方法是本领域知道的，包括使用染料、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如，通过胱天蛋白酶染色测定法可测量凋亡，通过放射性物质或荧光染料诸如alamar blue的摄取或释放可监测细胞生长或激活。在一个优选的实施方案中，可使用DELFIA
在一个优选的实施方案中，可使用一种或多种基于细胞的测定法通过实验测定经修饰的免疫球蛋白的免疫原性。在一个优选的实施方案中，使用先体外后体内(ex vivo)T细胞激活测定法通过实验对免疫原性定量。在这种方法中，用目的肽或完整抗体一次或多次激发(challenge)来自匹配供体的抗原呈递细胞和幼稚T细胞。然后，可使用许多方法检测T细胞激活，例如通过监测细胞因子的生成或测量氚化胸苷的摄取。在最优选的实施方案中，使用Elispot测定法(Schmittel et.al.,2000,J.Immunol.Meth.,24:17-24)监测干扰素γ生成。 t
可在细胞、组织、和完整生物体实验中表征本发明经修饰的免疫球蛋白的生物学特性。正如本领域知道的，为了测量药物治疗疾病或疾病模型的功效或者测量药物的药动学、毒性和其它特性，常常在动物中测试药物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、猫、猪和猴。这些动物可称为疾病模型。常 常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植物小鼠和转基因小鼠（包括敲入和敲除）。此类实验可为确定抗体用作治疗剂的潜力提供有意义的数据。测试可使用任何生物体，优选哺乳动物。例如，由于猴与人的遗传相似性，猴可以是合适的治疗模型，因而可用于测试本发明经修饰的免疫球蛋白的功效、毒性、药动学或其它特性。批准作为药物最终要求在人体中测试，因此当然设想了这些实验。如此，可以在人体中测试本发明的经修饰的免疫球蛋白以测定它们的治疗功效、毒性、免疫原性、药动学和/或其它临床特性。 t
本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于广泛的抗体产品。在一个实施方案中，本发明的抗体变体用于治疗或预防，用于制备或分析用途，用作诊断剂、工业化合物或研究试剂，优选治疗剂。抗体变体可用于单克隆的或多克隆的抗体组合物。在一个优选的实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白用于杀伤携带靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在一个备选实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动(agonize)靶抗原，例如通过拮抗细胞因子或细胞因子受体。在一个备选的优选实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动靶抗原和杀伤携带靶抗原的靶细胞。 t
在一个备选的优选实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动生长因子或生长因子受体和杀伤携带或需要靶抗原的靶细胞。在一个备选的优选实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白用于阻断、拮抗或激动酶和酶的底物。 t
本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于各种治疗目的。在一个优选的实施方案中，将包含经修饰的免疫球蛋白的抗体施用于患者以治疗特定紊乱。为了本发明的目的，“患者”包括人和其它动物，优选哺乳动物，最优选人。“特定紊乱”在本文中指可通过施用包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物而改善的紊乱。 t
在一个实施方案中，依照本发明的经修饰的免疫球蛋白是施用于患者的唯一治疗活性剂。或者，依照本发明的经修饰的免疫球蛋白联合一种或多种其它治疗剂施用，包括但不限于细胞毒剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、心脏保护剂、或其它治疗剂。经修饰的免疫球蛋白可以与一种或多种其它治疗方案相伴施用。例如，本发明的抗体变体可以与化疗、放疗、或化疗和放疗二者一起施用。在一个实施方案 中，本发明的经修饰的免疫球蛋白可以与一种或多种抗体（可以包含或不包含本发明的抗体变体）联合施用。依照本发明的另一个实施方案，采用本发明的经修饰的免疫球蛋白和一种或多种其它抗癌疗法来先体外后体内处理癌细胞。设想了此类先体外后体内处理在骨髓移植和特别是自体骨髓移植中可能是有用的。当然设想了可以联合其它治疗技术诸如外科手术而采用本发明的抗体。 t
多种其它治疗剂可用于与本发明的经修饰的免疫球蛋白一起施用。在一个实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与抗血管发生剂一起施用，后者是阻断或一定程度干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合牵涉促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或蛋白质，例如抗体、Fc融合物、或细胞因子。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在一个备选的实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与诱导或增强适应性免疫应答的治疗剂一起施用，例如靶向CTLA-4的抗体。在一个备选的实施方案中，经修饰的免疫球蛋白与酪氨酸激酶抑制剂一起施用，后者是一定程度抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在一个备选的实施方案中，本发明的经修饰的免疫球蛋白与细胞因子一起施用。“细胞因子”在用于本文时指由一种细胞群释放、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称，包括趋化因子。 t
设想了其中配制了本发明的经修饰的免疫球蛋白和一种或多种治疗活性剂的药用组合物。通过将具有期望纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980)混合，制备本发明抗体变体的配制剂供贮存，采取冻干配制剂或水溶液的形式。将用于体内施用的配制剂优选是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤或其它方法来实现。本文中所公开的经修饰的免疫球蛋白和其它治疗活性剂还可配制成免疫脂质体和/或包裹在微胶囊中。 t
包含本发明经修饰的免疫球蛋白的药用组合物的施用，优选无菌水溶液的形式，可以多种方式进行，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、经皮、局部（例如凝胶剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂等）、腹膜内、肌肉内、肺内（例如AERxTM可吸入技术，可从Aradigm购买；或InhanceTM肺部投递系统，可从Inhale Therapeutics购买）、阴道、肠胃外、直肠、或眼内。 t
在用于本文时，术语“特异性结合”指异质分子群中目的关联配体决定性 的结合反应。如此，在指定条件（例如在免疫球蛋白的情况中是免疫测定条件）下，指定抗体结合其特定“靶物”且不以显著量结合样品中存在的其它分子。与抗体的CDR相当，经修饰的结构环区域是结合抗原或分子的蛋白质模块，而非抗原。 t
术语“表达系统”指包含可操作连接的期望编码序列和控制序列，使得用这些序列转化的宿主能够生成所编码蛋白质的核酸分子。为了实现转化，表达系统可包含在载体上；然而，相关DNA然后还可整合到宿主染色体中。 t
依照本发明的一个优选实施方案，表达系统包含载体。本领域知道的任何表达载体都可在适当时用于此目的。 t
经修饰的免疫球蛋白优选在宿主中表达，优选在细菌、酵母、植物细胞、动物细胞中或者在植物或动物中表达。 t
极多种适当的宿主细胞可用于表达经修饰的免疫球蛋白，包括但不限于哺乳动物细胞（动物细胞）、植物细胞、细菌（例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)）、昆虫细胞、和酵母（例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)）。例如，可从美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)获得的ATCC细胞系目录中记载了可用于本发明的多种细胞系。此外，植物和动物也可作为宿主用于表达依照本发明的免疫球蛋白。可根据所用宿主来选择表达以及转染载体或盒。 t
当然，也可使用非细胞或无细胞蛋白质表达系统。生成足够量蛋白质的体外转录/翻译蛋白质表达平台提供了无细胞表达的许多优势，消除了对典型的与基于细胞的表达系统有关的费力的上游和下游步骤（例如宿主细胞转化、培养、或溶解）的需要。 t
本发明的另一个方面涉及用于制造免疫球蛋白或其药用制剂的方法，包含在所述免疫球蛋白的结构环区域中至少一处修饰，并测定所述免疫球蛋白对抗原表位的结合，其中未修饰的免疫球蛋白不显著结合所述表位，包括下列步骤： t
－提供编码包含至少一个环区域的免疫球蛋白的核酸， t
－修饰至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基， t
－将所述经修饰的核酸转移入表达系统， t
－表达所述经修饰的免疫球蛋白， t
－使表达的经修饰的免疫球蛋白与表位接触， t
－测定所述经修饰的免疫球蛋白是否结合所述表位，并 t
－提供结合所述表位的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。 t
具体而言，本发明涉及用于制造特异性结合至少一种第一分子的多特异性免疫球蛋白或其药用制剂的方法，包含在所述免疫球蛋白的至少一个结构环区域中的至少一处修饰，并测定所述至少一个环区域对至少一种选自下组的第二分子的特异性结合：变应原、肿瘤相关抗原、自身抗原、酶、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原和病毒抗原，其中包含未修饰结构环区域的免疫球蛋白不特异性结合所述至少一种第二分子，包括下列步骤： t
－提供编码特异性结合至少一种第一分子、包含至少一个结构环区域的免疫球蛋白的核酸， t
－修饰由所述核酸编码的至少一个所述环区域的至少一个核苷酸残基， t
－在表达系统中转移所述经修饰的核酸， t
－表达所述经修饰的免疫球蛋白， t
－使表达的经修饰的免疫球蛋白与所述至少一种第二分子接触， t
－测定所述经修饰的免疫球蛋白是否特异性结合第二分子，并 t
－提供对所述至少一种第二分子特异的经修饰的免疫球蛋白并任选将其制成药用制剂。 t
将超过一种特异性工程改造到特异性结合对的一个成员中是优选的(Kufer et al.(2004)Trends in Biotechnology vol.22 pages 238-244)。 t
已经做了许多尝试来生成多特异性，例如双特异性的单克隆抗体或抗体片段。生成由两条不同多肽链（重链和轻链）构成的双特异性抗体中的一个问题是必需在一个细胞中表达四种不同的链（两种重链和两种轻链），产生许多不同的不得不与混合物中的期望双特异性分子分开的分子组合。由于它们的相似性，将这些分子分开是困难且昂贵的。已经采用许多技术使此类不想要的配对的出现最小化(Carter(2001)Journal of Immunological Methods,vol 248,pages 7-15)。 t
这个问题的一种解决办法是生成一条具有两种特异性的多肽链，像例如彼此相连的两种scFv，或者生成所谓的双抗体。此类分子已经显示出与天然分子的折叠结构相距甚远，而且出了名的难以生成(LeGall et al.(2004)Protein Engineering,Design & Selection vol 17 pages 357-366)。 t
当前双特异性抗体设计的另一个问题在于即使亲本抗体双价结合其各自结合配偶体（例如IgG），所得双特异性抗体对每一种各自结合配偶体仍是单价的事实。 t
本发明的优选多特异性分子解决了这些问题： t
将双特异性分子表达成一条多肽链是可能的（具有两种结合特异性的经修饰的Ig结构域，见实施例部分），这比表达两条抗体多肽链更加易于实现(Cabilly et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984))。 t
由于第二特异性位于分子的非可变部分，因而不需要两条不同重链或不同轻链的事实，它也可生成为抗体样分子（即由2条多肽链构成）。如此，不可能有两条链的错误配对。 t
本发明的抗体可以由一条重链和一条轻链组成，它们一起形成结合特定结合配偶体的可变区。第二特异性可以由重链或轻链的任何结构环的经修饰的环形成。结合位点也可以由超过一个非CDR环形成，它们可以是结构上相邻的（或是在重链上或是在轻链上或是在两条链上）。 t
经修饰的抗体或衍生物可以是完整抗体或抗体片段（例如Fab、CH1-CH2、CH2-CH3）。 t
根据设计，它可单价或多价结合结合配偶体，甚至对不同结合配偶体具有不同效价。 t
既然重链和轻链非CDR区有许多不同环可用于选择和设计特异性结合位点，有可能设计具有甚至超过两种特异性的抗体衍生物而没有上文提到的问题。 t
一条多肽链内的特异性结合位点可以用或不用肽接头相连。 t
有些抗体类别天生可视为多特异性的，特别是双特异性：它们以可变区结合抗原（典型的是例如外源结构或癌相关结构）并以Fc部分结合Fc效应物分子（例如各种免疫细胞上的Fc受体或补体蛋白），从而能够实现诸如ADCC、ADCP或CDC的效应。 t
Fc效应物分子通过免疫球蛋白分子Fc部分（对于IgG1，它由CH2和CH3结构域组成）结合，而且已经记载了许多方法通过改进抗体分子的Fc部分的结合来优化效应物功能，或是通过糖工程技术(glycoengineering technique)(US 6,602,684)或是通过蛋白质工程，后者或是直接在Fc处(US2005/0054832)或是间接通过Fc以外的工程改造(US 2005/02444403)。Fc区 与Fc受体的结合和/或与补体蛋白诸如Cq1的结合二者都已经通过此类技术改变。通常试图改进对此类Fc效应物分子的结合亲和力，因为它与改良的效应物功能有关。 t
通过本发明，有可能设计在天然Fc结合区以外结合Fc效应物分子的抗体。抗体结构域中除牵涉“天然”Fc效应物分子结合的环以外的经修饰的环可从文库中选择或者设计成结合一种或多种Fc效应物分子。具有此类额外Fc效应物分子结合位点的抗体将对某种Fc效应物分子或展示Fc效应物分子的效应细胞具有更强的亲合力，因此可比糖工程抗体或以其它方式改良的Fc区具有甚至更强的效果。然而，对于本发明的某些实施方案，不应直接改变待修饰的给定抗体的效应物特征，而是保持不受依照本发明的结构环中的修饰的影响。 t
抗体片段与完整抗体相比具有某些优势。片段通常具有较好的生物分布特性，而且可更加容易的生产。然而，大多数抗体片段设计缺乏效应物功能且具有较短的体内半衰期(Holliger P,et al.Nat Biotechnol.(2005)23:1126-36.)。 t
CH1或者Cκ或Cλ结构域都不介导效应物功能，这就是Fab不显示ADCC、ADCP或CDC的原因。WO 02/44215记载了由抗体的抗原结合位点和结合Fc效应物分子的肽组成的结合分子。以这样一种方式，可构建展示效应物功能的抗体片段。将肽掺入结合分子，位于既不破坏抗原结合也不破坏肽结合Fc效应物分子的能力的位置。 t
然而，依照本发明，对Fc效应物分子的结合可以用已经从免疫球蛋白结构域的固定支架中随机环序列文库中选择Fc效应物分子结合的经修饰的免疫球蛋白结构域来执行。因此，有可能选择不会在Ig结构域支架以外结合Fc效应物分子的特定环序列。得自本发明的多肽因此优选可以由超过100个氨基酸组成。 t
为了选择依照本发明的此类结构域的潜在效应物功能，可对突变CH1、Cκ或Cλ结构域的文库选择与Fc受体和/或补体因子诸如C1q的结合。 t
为了延长由这样的结构域（例如CH1、CH2、CH3、CH4、Cκ或Cλ）组成或包含它们的分子的体内半衰期，可以对突变体例如依照本发明的CH1、CH2、CH3、CH4、Cκ或Cλ结构域的文库选择与FcRn的结合。 t
供选择的FcRn受体可以在天然表达相应受体的细胞的表面上提供，或 者通过表达并纯化相应受体的胞外部分来提供。为了本发明的目的，对FcRn的第一筛选可以选择这样的突变结构域，它们可以在体外进一步测试和甚至通过与表达FcRn受体的细胞的结合在FACS实验中进一步表征。它可通过与各种重组FcRn、同种型和同种异型的结合的亲和力分级来进一步表征，例如通过表面等离振子共振技术。 t
依照本发明的一个优选实施方案，免疫球蛋白是人或鼠起源的。 t
既然经修饰的免疫球蛋白可用于各种目的，特别是药用组合物，那么免疫球蛋白优选是人或鼠起源的。当然，经修饰的免疫球蛋白也可以是人源化的或嵌合的免疫球蛋白。 t
依照本发明的另一个优选实施方案，人免疫球蛋白选自下组：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。 t
鼠免疫球蛋白优选选自下组：IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM。 t
经修饰的免疫球蛋白可衍生自上文鉴定的免疫球蛋白类别之一。 t
免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白的重链和/或轻链或其部分。 t
经修饰的免疫球蛋白可包含重链和/或轻链，至少一个可变区和/或恒定区。 t
依照本发明的免疫球蛋白优选包含免疫球蛋白的至少一个恒定区和/或至少一个可变区或其包括微型结构域的部分。 t
恒定区指免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折叠结构单元，也称为恒定区结构域（例如CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl）。 t
可变区指免疫球蛋白可变部分的免疫球蛋白折叠结构单元，也称为可变区结构域（例如Vh、Vk、Vl、Vd）。 t
依照本发明的一种优选免疫球蛋白由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定区或其包括微型结构域的部分组成，具有至少一个环区域，其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰，形成至少一个经修饰的环区域，其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。 t
依照本发明的另一种优选免疫球蛋白由重链或轻链的可变区或其包括微型结构域的部分组成，具有至少一个环区域，其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰，形成至少一个经修饰的环区域，其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。 t
依照一个优选的实施方案，恒定区选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合。 t
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可包含一个或多个恒定区（例如至少两个、三个、四个、五个、六个、十个结构域）。如果经修饰的免疫球蛋白中存在超过一个结构域，那么这些结构域可以是相同类型或不同类型的（例如CH1-CH1-CH2、CH3-CH3）。当然，单一结构域的次序也可以是任何种类的（例如CH1-CH3-CH2、CH4-CH1-CH3-CH2）。 t
免疫球蛋白氨基酸序列的所有编号依照IMGT编号方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics information systemimgt.cines.fr;http://imgt.cines.fr;Lefranc et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212;Ruiz et al.,2000Nucleic Acids Res.28:219-221;Lefranc et al.,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209;Lefranc et al.,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310;Lefranc et al.,2005,Dev Comp Immunol 29:185-203)。 t
依照本发明的另一个优选实施方案，CH1、CH2、CH3和CH4的经修饰的环区域包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。 t
人起源的Igk-C和Igl-C的环区域优选包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。 t
鼠起源的Igk-C和Igl-C的环区域优选包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。 t
人起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域优选包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。 t
依照本发明的一个优选实施方案，鼠起源的免疫球蛋白的可变区的结构环区域包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。 t
上文鉴定的各免疫球蛋白的经修饰的氨基酸区域包含待修饰的环区域。 t
依照本发明的免疫球蛋白优选是骆驼起源的。 t
骆驼抗体只包含一条抗体，与由轻链和重链组成的正常抗体具有相同的抗原亲和力。因此，骆驼抗体比例如人抗体小得多，容许它们穿透稠密组织 达到抗原，而更大蛋白质则不能。此外，比较简单、亲和力和特异性高、及到达活性位点和与活性位点相互作用的潜力，骆驼的重链抗体在有临床价值的化合物的设计、生产和应用中呈现了优于常见抗体的优点。 t
骆驼起源的免疫球蛋白优选包含至少一个选自CH1、CH2和CH3的恒定区。 t
依照本发明的一个优选实施方案，骆驼免疫球蛋白的CH1、CH2和CH3的环区域包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。 t
依照本发明的一个优选实施方案，经修饰的免疫球蛋白对分子的特异性结合通过选自下组的结合测定法测定：免疫学测定法优选优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离振子共振测定法、饱和转移差异核磁共振光谱法、转移NOE(trNOE)核磁共振光谱法、竞争测定法、组织结合测定法、活细胞结合测定法和细胞提取物测定法。 t
结合测定法可使用本领域知道的多种技术来进行，包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的测定法、AlphaScreenTM(放大的发光亲近同质测定法)、闪烁亲近测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、SPR(表面等离振子共振，也称为BIACORE
经修饰的免疫球蛋白优选偶联选自下组的标记物：有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属配合物、金属、胶体金及其混合物。 t
经修饰的免疫球蛋白可偶联容许在例如结合测定法（例如ELISA）和结合研究中简单检测所述偶联物的其它分子。 t
本发明的另一个方面涉及由选自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定区或其包括微型结构域的部分或其组合组成的免疫球蛋白，具有至少一个环区域，其中所述至少一个环区域包含至少一处氨基酸修饰，形成至少一个经修饰的环区域，其中所述至少一个经修饰的环区域特异性结合至少一种抗原表位。 t
优选在分子上组合至少一种经修饰的抗体结构域（＝经非可变序列或结构环结合特定配偶体）与至少一种其它结合分子，后者可以是抗体、抗体片 段、可溶性受体、配体或另一种经修饰的抗体结构域。 t
所述分子选自蛋白质性质的分子、核酸和碳水化合物。 t
经修饰的免疫球蛋白的环区域可特异性结合任何种类的结合分子，特别是蛋白质性质的分子、蛋白质、肽、多肽、核酸、聚糖、碳水化合物、脂质、有机小分子、无机分子。当然，经修饰的免疫球蛋白可包含至少两个环区域，由此每个环区域可特异性结合其它分子或表位。 t
依照本发明的一个优选实施方案，结合经修饰的结构环区域的分子选自下组：肿瘤相关抗原，特别是EpCAM，肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)，肿瘤相关抗原CA125，前列腺特异膜抗原(PSMA)，高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)，表达Lewis Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18和细胞角蛋白肿瘤相关抗原，细菌抗原，病毒抗原，变应原，荧光素，溶菌酶，toll样受体9，红细胞生成素，CD2，CD3，CD3E，CD4，CD11，CD11a，CD14，CD18，CD19，CD20，CD22，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD33（p67蛋白），CD38，CD40，CD40L，CD52，CD54，CD56，CD80，CD147，GD3，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，干扰素α，干扰素β，干扰素γ；TNF-α，TNF-β2，TNFα，TNFαβ，TNF-R1，TNF-RII，FasL，CD27L，CD30L，4-1BBL，TRAIL，RANKL，TWEAK，APRIL，BAFF，LIGHT，VEG1，OX40L，TRAIL受体-1，A1腺苷受体，淋巴毒素β受体，TACI，BAFF-R，EPO；LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，整联蛋白β1，整联蛋白β2，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α5，整联蛋白α6，整联蛋白αv，αVβ3整联蛋白，FGFR-3，角质形成细胞生长因子，VLA-1，VLA-4，L-选择蛋白，抗Id，E-选择蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T细胞受体，B7-1，B7-2，VNR整联蛋白，TGFβ1，TGFβ2，eotaxin1，BLyS(B淋巴细胞刺激物)，补体C5，IgE，因子VII，CD64，CBL，NCA 90，EGFR(ErbB-1)，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB4)，组织因子，VEGF，VEGFR，内皮缩血管肽受体，VLA-4，碳水化合物诸如血型抗原和相关碳水化合物，Galili糖基化，促胃液素，促胃液素受体，肿瘤相关碳水化合物，半抗原NP帽或NIP帽，T细胞受体α/β，E-选择蛋白，地高辛，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和睾丸PLAP样碱性磷酸酶，运铁蛋白受体，类肝素酶(Heparanase)I，人心肌球蛋白，糖 蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIV gp120，HCMV，呼吸道合胞病毒RSV F，RSVF Fgp，VNR整联蛋白，Hep B gp120，CMV，gpIIbIIIa，HIV IIIB gp120 V3环，呼吸道合胞病毒(RSV)Fgp，单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素及其片段。 t
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可优选结合上文所公开的分子之一。这些分子还包括变应原。 t
依照本发明的另一个优选实施方案，修饰了CH3第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位的氨基酸残基。 t
依照本发明的免疫球蛋白的修饰优选是缺失、替换或插入。 t
依照本发明，至少1个，优选至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个和15个氨基酸遭到缺失，用其它氨基酸（也用经修饰的氨基酸）替换，或插入免疫球蛋白的环区域。然而，插入免疫球蛋白环区域的氨基酸的最大数目不能超过30个，优选不超过25个，更优选不超过20个氨基酸。氨基酸替换和插入优选通过本领域知道的、本专利申请中公开的方法随机发生。 t
依照一个具体实施方案，依照本发明的免疫球蛋白的特征在于当EpCam结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.18，当荧光素结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.20，当溶菌酶结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.22,24,26,28,30或32，当TLR9结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.34,36,38或40，而当溶菌酶和/或红细胞生成素结合所述免疫球蛋白时CH3区包含SEQ ID No.42。 t
依照本发明的一个具体实施方案，免疫球蛋白的特征在于在溶菌酶和gp41结合所述免疫球蛋白时它包含SEQ ID No.44或SEQ ID No.46。 t
经修饰的免疫球蛋白优选偶联选自下组的标记物或受体分子：有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、显色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属配合物、金属、胶体金及其混合物。 t
偶联有上文指定的标记物的经修饰的免疫球蛋白可用于例如诊断方法。 t
本发明的另一个方面涉及依照本发明的或可通过依照本发明的方法获 得的免疫球蛋白用于制备供自动免疫接种(active immunization)的疫苗的用途。据此，免疫球蛋白或是作为抗原性药物物质用于配制疫苗或者用于钓取或捕获抗原性结构供疫苗配制剂之用。 t
本发明的另一个方面涉及依照本发明的或可通过依照本发明的方法获得的免疫球蛋白用于制备免疫球蛋白的蛋白质文库的用途。 t
本发明的还有一个方面涉及用于特异性结合和/或检测分子的方法，包括下列步骤： t
(a)使依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触怀疑含有所述分子的测试样品，并 t
(b)检测特异性免疫球蛋白/分子复合物的潜在形成。 t
本发明的另一个方面涉及用于特异性分离某种分子的方法，包括下列步骤： t
(a)使依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白接触含有所述分子的样品， t
(b)分离形成的特异性免疫球蛋白/分子复合物，并 t
(c)任选从所述复合物分离该分子。 t
依照本发明的免疫球蛋白可用于从样品中特异性分离分子。如果使用多特异性免疫球蛋白，那么可以从样品中分离超过一种分子。在此类方法中使用经修饰的免疫球蛋白是尤其有利的，因为它容许例如生成具有同质表面且限定量的能够结合待分离分子的结合配偶体（即经修饰的免疫球蛋白）固定其上的基质。与之相反，如果使用单特异性结合配偶体，那么无法生成同质基质，因为单一结合配偶体并非以相同效率结合基质。 t
本发明的另一个方面涉及用于将化合物靶向靶物的方法，包括下列步骤： t
(a)将能够特异性结合所述化合物的依照本发明的经修饰的免疫球蛋白或可通过依照本发明的方法获得的经修饰的免疫球蛋白与所述化合物接触， t
(b)将特异性免疫球蛋白/化合物复合物投递至靶物。 t
依照本发明的经修饰的免疫球蛋白可用于将至少一种结合CDR和/或经修饰的环区域的化合物投递至靶物。此类免疫球蛋白可用于在疾病的治疗过程中将治疗性物质靶向优选作用部位。 t
本发明的另一个方面涉及包含依照本发明的或者可通过依照本发明的 方法获得的免疫球蛋白的蛋白质文库。 t
用于构建所述文库的优选方法可在上文和实施例中找到。依照本发明的文库可用于鉴定结合独特分子的免疫球蛋白。 t
具体而言，本发明涉及包含依照本发明的或者可通过依照本发明的方法获得的免疫球蛋白的蛋白质文库用于设计免疫球蛋白衍生物的用途。可改变现有的免疫球蛋白，通过使用各结构域的至少10种，优选100种，更优选1000种，更优选10000种，更优选100000种，最优选超过1000000种具有至少一个经修饰的环的变异结构域的蛋白质文库，将抗原结合位点引入任何结构域或微型结构域。然后对文库筛选对特定抗原的结合。在对期望特性进行分子表征后，通过遗传工程技术将选择的结构域或微型结构域克隆到最初的免疫球蛋白中，使得它替换野生型区域。或者，可以只交换编码环或编码突变氨基酸的DNA以获得具有对特定抗原的额外结合位点的免疫球蛋白。 t
突变的、抗原特异性的结构环的位点的选择取决于最初免疫球蛋白的结构和额外结合位点的目的。如果例如最初的分子是需要插入额外抗原结合位点且不干扰效应物功能的完整免疫球蛋白，那么待修饰的环将从远离CH2和CH3的结构域中选择，CH2和CH3是Fc效应物分子的天然结合配偶体。如果最初的免疫球蛋白是Fab，那么有可能修饰轻链或重链的恒定区或可变区中的环。为了生成文库，可制备突变的最初分子的文库，它们在一个或多个结构域的一个或多个结构环中具有突变。对完整的、突变的最初分子的选择可具有一些优势，在于对经修饰的结构环选择抗原结合将瞄准空间有利的修饰，如果还测试突变型免疫球蛋白应当显示的其它特性的话。 t
突变的结构域或微型结构域或结构域融合分子的蛋白质文库的库容量要求（即变异蛋白质数目）取决于目标。一般而言，用于从头生成抗原结合位点的文库需要比用于进一步修饰早就存在的由经修饰的结构环构成的工程改造的抗原结合位点的文库（例如用于提高亲和力或改变对抗原的精细特异性）更大。 t
本发明还涉及包含多种免疫球蛋白的免疫球蛋白文库或核酸文库，例如恒定区或可变区、微型结构域和/或微型结构域中所包含的至少一个结构环区域、或者编码它们的核酸分子。文库包含具有不同修饰的成员，其中多数由至少一个结构环区域中的修饰限定。核酸文库优选包含至少10个不同成员（导致一处氨基酸交换），更优选包含至少100个，更优选1000个或10000 个不同成员（例如通过随机化策略或组合技术设计）。甚至更多多样化个体成员数，诸如至少1000000个或至少10000000个也是优选的。 t
本发明的另一个方面是选自至少两个依照本发明的文库的两种不同结构域或微型结构域的组合，以生成多特异性免疫球蛋白。这些选择的特定免疫球蛋白可相互组合，与其它分子组合，类似于积木(building block)，以设计结构域或微型结构域的最佳排列以得到期望特性。 t
此外，可以将依照本发明的一种或多种经修饰的免疫球蛋白引入蛋白质的多个或所有可能的不同位点而不破坏蛋白质的结构。通过这样一种“结构域改组”技术，产生了可再次选择期望特性的新文库。 t
优选的文库包含依照本发明的，选自免疫球蛋白的结构域、微型结构域或其衍生物的免疫球蛋白。 t
本发明的一个优选实施方案是抗原的结合分子（抗原结合分子），所述抗原的结合分子包含至少一个免疫球蛋白结构域和结构环区域，所述结构环区域为结合抗原而依照本发明修饰的，其中所述结合分子不包含抗体的可变区。它可包含可用于抗体活性的其它部分（例如诸如天然的或经修饰的效应物区域（序列））；然而，它在抗体的“天然”结合区即可变区的天然存在位置缺乏可变区。依照本发明的这些抗原结合分子具有上文关于现有分子描述的优势，但没有抗体的特异性结合活性；然而，具有在结构环区域中新引入的特异性结合活性。 t
优选的是，依照本发明的这些抗原结合分子包含CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其组合；所述组合包含至少两个，优选至少四个，尤其是至少六个恒定区且至少一个结构环区域依照本发明修饰。优选的是，这些结构环区域或是经依照本发明的结构环区域连接，或是经天然存在于两个此类恒定区之间的结构环连接。依照本发明的这些抗原结合分子的一个实施方案由在结构环中具有至少一处依照本发明的修饰的，抗体的Fc区组成。同样，对于依照本发明的抗原结合分子，优选结构环中新的抗原结合位点是通过随机化技术引入的，即通过随机化技术交换环的一个或多个氨基酸残基，或者通过将随机生成的插入物引入此类结构环。或者，优选使用组合方法。 t
依照另一个方面，本发明涉及在一个或多个结构环中掺入了对未修饰免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白。术语“外源的”意味着抗原结合位点不是由免疫球蛋白的特定区域天然形成的，而且外源的结 合配偶体而非免疫球蛋白的天然结合配偶体得到抗原结合位点的结合。这意味着结合配偶体，诸如Fc受体或免疫系统的效应物，不认为受到对未修饰免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的结合。 t
优选的是，抗原选自：病原体抗原、肿瘤相关抗原、酶、底物、自身抗原、有机分子或变应原。更优选的抗原选自：病毒抗原、细菌抗原、或来自真核生物或噬菌体的抗原。优选的病毒抗原包括HAV、HBV、HCV、HIV I、HIV II、细小病毒、流感病毒、HSV、肝炎病毒、黄病毒、西尼罗河病毒、埃博拉病毒、痘病毒、天花病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、细小病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、日本脑炎病毒、登革病毒、蜱媒脑炎病毒、黄热病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、拉克罗斯病毒、拉沙病毒、狂犬病病毒、轮状病毒抗原；优选的细菌抗原包括假单胞菌、分枝杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、脑膜炎球菌、疏螺旋体、利斯特氏菌、奈瑟氏球菌、梭菌、埃希氏菌、军团菌、芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、肠球菌、棒杆菌、诺卡氏菌、红球菌、莫拉氏菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、肉杆菌、弗朗西丝氏菌、螺杆菌、嗜血菌、克雷伯氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、弧菌、衣原体、钩端螺旋体、立克次氏体、分枝杆菌、密螺旋体、巴尔通氏体抗原。病原性真核生物的优选真核生物抗原包括来自贾第鞭毛虫、弓形体、环孢菌、隐孢子虫、毛线虫、酵母、假丝酵母、曲霉、隐球酵母、芽生菌、组织胞浆菌、球孢菌的抗原。 t
依照本发明的优选免疫球蛋白包含至少两个抗原结合位点，第一位点结合第一表位而第二位点结合第二表位。 t
依照一个优选的实施方案，本发明的免疫球蛋白包含至少两个环区域，第一环区域结合第一表位而第二环区域结合第二表位。或是至少第一或至少第二环区域或者二者可包含结构环。依照本发明的免疫球蛋白包括其本领域知道有功能的、包含依照本发明的本质元件——依照本发明修饰的结构环区域的片段。 t
优选的是，依照本发明的免疫球蛋白由至少两个免疫球蛋白结构域或其包括微型结构域的部分构成，且每个结构域包含至少一个抗原结合位点。 t
还优选这样的依照本发明的免疫球蛋白，它包含免疫球蛋白的至少一个恒定区的结构域和/或可变区的至少一个结构域，或其包括微型结构域的部分。如此，例如C末端区域有修饰的可变区，或与经修饰的CH1区例如经 修饰的CH1微型结构域连接的可变区是优选实施方案之一。 t
依照本发明的优选免疫球蛋白包含与未修饰结构域具有至少50%同源性的结构域。 t
术语“同源性”表示多肽在一级、二级或三级结构的对应位置具有相同或保守的残基。该术语还延伸至编码同源多肽的两种或多种核苷酸序列。 t
“同源免疫球蛋白结构域”意味着依照本发明的免疫球蛋白结构域相对于本文中所公开的全长天然序列免疫球蛋白结构域序列或全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它片段具有至少约50%的氨基酸序列同一性。优选的是，同源免疫球蛋白结构域将与本文中所公开的天然免疫球蛋白结构域序列或全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它明确限定片段具有至少约50%的氨基酸序列同一性，优选至少约55%的氨基酸序列同一性，更优选至少约60%的氨基酸序列同一性，更优选至少约65%的氨基酸序列同一性，更优选至少约70%的氨基酸序列同一性，更优选至少约75%的氨基酸序列同一性，更优选至少约80%的氨基酸序列同一性，更优选至少约85%的氨基酸序列同一性，更优选至少约90%的氨基酸序列同一性，更优选至少约95%的氨基酸序列同一性。 t
关于本文中所鉴定的免疫球蛋白结构域序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定免疫球蛋白结构域序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。 t
%氨基酸序列同一性值可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul et al.,Methods in Enzymology 266:460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2搜索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可调整参数设成如下值：交叠跨度＝1，交叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11，和评分矩阵＝BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时，%氨基酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然免疫球蛋白结构域的序列的目的免疫球蛋白结构域氨基酸序列和目的比较氨基酸序列（即目的免疫球蛋白结 构域针对其进行比较的序列，它可以是未修饰的免疫球蛋白结构域）之间的匹配相同氨基酸残基数除以(b)目的免疫球蛋白结构域的未随机化部分的氨基酸残基总数确定的。例如，在叙述“包含与氨基酸序列B具有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列A是目的比较氨基酸序列，氨基酸序列B是目的免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。 t
在一个优选的实施方案中，依照本发明的免疫球蛋白是双特异性抗体或双特异性单链抗体。进一步优选的是免疫球蛋白包含双特异性结构域或其包括微型结构域的部分。 t
依照本发明的免疫球蛋白可用于本领域知道的关于免疫球蛋白的任何目的，但还使得依赖于通过本发明引入的特异性组合的应用成为可能。因此，依照本发明的免疫球蛋白优选用于治疗和预防用途（例如作为自动或被动免疫疗法）；用于制备和分析用途；及用于诊断用途。 t
本发明的另一个方面涉及结合配偶体的试剂盒，包括： t
(a)在一个或多个结构环中掺入对免疫球蛋白而言外源的抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白，和 t
(b)包含所述抗原表位的结合分子。 t
依照本发明的这种试剂盒的这样一种结合分子可用于鉴定依照本发明的经修饰的免疫球蛋白的结合特异性。通过使用依照本发明的这种试剂盒的，可测定依照本发明的经修饰的免疫球蛋白的效力(potency)。 t
效力在本文中定义为经修饰的分子对其抗原的结合特性。结合可以在特异性和/或亲和力和/或亲合力方面定量和/或定性测定，用于质量控制目的。 t
此外，依照本发明的试剂盒的结合分子可用于从由至少10种、优选至少100种、更优选至少1000种、更优选至少10000种、尤其至少100000种在结构环中具有不同修饰的免疫球蛋白组成的文库中选择依照本发明的经修饰的免疫球蛋白。 t
依照本发明，本发明的主要特色之一在于免疫球蛋白结构域的工程改造发生在正常情况下不牵涉抗原结合的区域中，换言之，在抗体的CDR以外的区域中。观察到免疫球蛋白结构域的特定折叠结构容许在结构与CDR类似但序列中位置不同的区域中引入随机突变。通过本发明鉴定的区域是像CDR一样连接免疫球蛋白折叠结构的β折叠链的环区域。 t
更具体的说，本文中描述了通过在连接人IgG1 CH3结构域的β折叠链 A-B和E-F的环中引入随机突变，选择了特异性结合Toll样受体9肽(TLR-9)或鸡卵溶菌酶的突变型CH3结构域，Toll样受体9肽(TLR-9)和鸡卵溶菌酶分别是在正常情况下不受人IgG1的CH3结构域识别和结合的肽和蛋白质。由我们引入的突变包括其中在野生型序列中选择的氨基酸残基用随机选择的残基替换的突变，它们还包括在上文所述环中插入额外氨基酸残基。 t
通过类推，来自任何类别的免疫球蛋白和来自任何物种的免疫球蛋白的免疫球蛋白结构域都适用于这种类型的工程改造。此外，不仅可操作本发明所瞄准的特定环，而且可以相同方式操作免疫球蛋白中连接β折叠链的任何环。 t
来自任何生物体和来自任何类别免疫球蛋白的工程改造的免疫球蛋白结构域可依照本发明使用，或是就这样（作为单一结构域）或者作为更大分子的一部分。例如，它们可以是完整免疫球蛋白的一部分，该完整免疫球蛋白因此将具有其由6个CDR形成的“正常”抗原结合区和新的工程改造的抗原结合区。像这样，可生成多特异性，例如双特异性免疫球蛋白。工程改造的免疫球蛋白结构域还可以是任何融合蛋白的一部分。这些工程改造的免疫球蛋白结构域的用途在免疫球蛋白的一般用途领域中。 t
本文中将下列免疫球蛋白的结构域理解为免疫球蛋白结构域： t
对IgG、IgD和IgA：VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3； t
对IgM和IgE：VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3、CH4。 t
1.单一免疫球蛋白结构域，一侧随机化，即连接β折叠链B-C、D-E或F-G（“尖端”，除了被许多专利覆盖的可变区）或者β折叠链A-B、C-D（在可变区的情况中是C-C′和C″-D）或E-F（“底部”）的环中。可随机化单一环或任何环组合。可改变、缺失残基，或者可插入额外残基。 t
2.单一免疫球蛋白结构域，在尖端和底部两侧都随机化。 t
3.包含单一随机化结构域之一的任何蛋白质，诸如： t
a)“单链CH3”二聚体(scCH3)、scCH2、scCH1/CL，一侧或两侧随机化 t
b)单链Fv，“底部”随机化，即CDR的对侧 t
c)Fab片段，“底部”随机化，即CH1和CL结构域的C末端 t
d)Fc片段（即由CH2-CH3组成的蛋白质），一侧或两侧随机化 t
e)完整免疫球蛋白，Fc底物随机化 t
f)其它合适的结构域 t
单一结构域的主要优势与用于倡仪骆驼VH分子（“nanobodies”(纳米抗体)，参阅www.ablynx.com）的所有论点非常相似。随机化免疫球蛋白结构域是非常小的蛋白质（分子量约12-15kDa，取决于插入的氨基酸残基数），因此与常规抗体或抗体片段诸如scFv和Fab相比将具有下列优势：识别不常见的或隐藏的表位，结合到蛋白质靶物的空腔或活性位点中，易于制造，及许多其它的。在两侧都随机化的免疫球蛋白结构域的情况中，可生成二价或双特异性分子。作为融合蛋白一部分的单一结构域的主要优势在于可在任何其它蛋白质上工程改造额外结合特性。 t
设想了任何表达系统都可用于制备蛋白质。本文中所描述的单一结构域的类似物可在来自骆驼的抗体中找到，它只具有VH但没有VL。在这些蛋白质，只有3个CDR（而非“正常”抗体中的6个）负责抗原结合。 t
将下列专利参考文献收入本文作为参考，就像完整列出它们一样： t
US 6,294,654 Modified immunoglobulin molecule incorporating an antigen in a non-CDR loop region（在非CDR环区中掺入抗原的改良免疫球蛋白分子） t
US 5,844,094 Target binding polypeptide（靶结合多肽） t
US 5,395,750 Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens（用于生成结合预定抗原的蛋白质的方法） t
US 2004/0071690 High avidity polyvalent and polyspecific reagents（高亲合力、多价和多特异性试剂） t
US 2004/0018508 Surrogate antibodies and methods of preparation and use thereof（代用抗体及其制备和使用方法） t
US 2003/0157091 Multi-functional proteins（多功能蛋白质） t
US 2003/0148372 Method to screen phage display libraries with different ligands（用不同配体筛选噬菌体展示文库的方法） t
US 2002/0103345 Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production（双特异性免疫球蛋白样抗原结合蛋白质及生产方法） t
US 2004/0097711 Immunoglobulin superfamily proteins（免疫球蛋白超家族蛋白质） t
US 2004/0082508 Secreted proteins（分泌型蛋白质） t
US 2004/0063924 Secreted proteins（分泌型蛋白质） t
US 2004/0043424 Immunoglobulin superfamily proteins（免疫球蛋白超家族蛋白质） t
US 5,892,019 Production of a single-gene-encoded immunoglobulin（单基因编码的免疫球蛋白的生成） t
US 5,844,094Target binding polypeptide（靶结合多肽） t
下面的附图和实施例进一步例示而非限制本发明。 t
图1a显示了完整IgG1的结构。箭头标示各结构域。 t
图1b图示了人免疫球蛋白主要同种型单体的结构组织。二硫键以线表示，N连接碳水化合物基团以圆表示。 t
图2显示了免疫球蛋白恒定区（左图）和可变区（右图）的免疫球蛋白折叠结构。箭头标示β折叠链。 t
图3显示了依照本发明的工程改造的CH3结构域的分子模型，随机化部分以溶剂可到达表面标示。所述表面以圈围绕。 t
图4显示了用于生成装配突变型CH3结构域所用片段的PCR的示意图。箭头标示PCR引物，它们各自采取5’-3’取向，而垂直线标示为了装配突变型基因而引入的限制性位点的大致位置。引物上包含下列限制性位点供PCR片段的连接之用：CH3LNCO：NcoI；CH3LSAC和CH3CSAC：SacI；CH3CHIN和CH3RHIN：HindIII；CH3RNOT：NotI。 t
图5显示了如何使用本申请的免疫球蛋白结构域的一些例子。以星形符号表示随机化区域。一个分子中的随机化区域的特异性可以是相同的或者是不同的。 t
图6显示了双特异性工程改造的CH3结构域的设计示意图。框中给出了引物的名称，箭头标示引物的延伸方向。带倾斜线的框标示此构建物中随机化的区域的相对位置，带垂直线的框标示为了生成克隆C24而引入的区域的相对位置，而且给出了用于克隆程序的限制性位点。 t
图7显示了双特异性工程改造的CH3结构域的设计示意图。显示了双特异性工程改造的CH3结构域的基本设计的核苷酸序列及其翻译结果。红色序列标示为了生成双特异性构建物而随机化的区域，而绿色框标示其中序列为了生成克隆C24而随机化的区域。 t
图8显示了本文中所公开的序列的序列表。 t
具体实施例的描述 t
实施例1：CH3文库的构建和噬菌体表面展示 t
使用Brookhaven数据库中条目1OQO.pdb公开的IgG1 Fc片段的晶体结构来辅助设计突变型CH3结构域。 t
作为CH3文库构建的基础使用的序列见SEQ ID No.1。在此序列中，第一个氨基酸对应于Brookhaven数据库条目1OQO.pdb的A链的脯氨酸343。1OQO.pdb中所含最后一个残基是SEQ ID No.1的丝氨酸102。在详细分析1OQO.pdb的结构并直观检查形成连接β链的环的残基后，决定将残基17、18和19（它们是连接β链A-B的环的一部分）以及残基71、72、73、76和77（它们是连接SEQ ID No.1的β链E-F的环的一部分）随机化。工程改造CH3结构域的分子模型见图3，以溶剂可到达表面标示随机化部分。通过一系列PCR反应，接着连接所得PCR产物，生成工程改造基因。为了便于连接，修饰编码SEQ ID No.1的核苷酸序列的有些密码子以生成限制性位点但不改变氨基酸序列（沉默突变）。为了插入克隆载体pHEN1（Nucleic Acids Res.1991 Aug 11;19(15):4133-7.Multi-subunit proteins on surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody(Fab)heavy and light chains.Hoogenboom HR,Griffiths AD,Johnson KS,Chiswell DJ,Hudson P,Winter G.），与pelB分泌信号处于同一读码框，在序列的5’末端附着编码Met-Ala的额外核苷酸残基以生成NcoI限制性位点。对于随机化残基，选择编码所有20种天然存在氨基酸但避免3种终止密码子中2种的密码子NNS（IUPAC代码，其中S指C或G）。工程改造序列的核苷酸序列见SEQ ID No.2，氨基酸序列见SEQ ID No.3。SEQ ID No.3中的字母X表示随机化氨基酸残基。用于装配突变型CH3结构域的PCR引物的序列见SEQ ID No.4-9。图4显示了为了装配突变基因而生成的PCR片段及所用引物的示意图。 t
使用人单克隆抗体3D6的重链的cDNA（Felgenhauer M,Kohl J,Rüker F.Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV-1-gp41.Nucleic Acids Res.1990 Aug 25;18(16):4927）作为PCR反应的模板。将3种PCR产物分别用SacI和/或HindIII消化并连接到一起。将连接产物进一步用NcoI和NotI消 化并连接到已经用NcoI和NotI消化过的表面展示噬菌粒载体pHEN1中。选择许多克隆通过限制性分析和DNA测序进行检验，发现它们包含计划的插入物，包括正确插入的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之，将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒，溶于水，并用于通过淘选进行的选择，或者保存于-80℃。 t
实施例2：CH3+3文库的构建 t
此文库以与CH3文库相同的方式构建和克隆。构建物的氨基酸序列见SEQ ID No.10，对应的核苷酸序列见SEQ ID No.11，而构建所用引物见SEQ ID No.4-7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.12。 t
实施例3：CH3+5文库的构建 t
此文库以与CH3文库相同的方式构建和克隆。构建物的氨基酸序列见SEQ ID No.13，对应的核苷酸序列见SEQ ID No.14，而构建所用引物见SEQ ID No.4-7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.15。 t
实施例4：CH3噬菌体文库对TLR-9肽的淘选 t
依照标准方案进行3轮淘选。简而言之，应用如下方法。用代表Toll样受体9(TLR-9)的部分序列的合成肽包被Maxisorp 96孔板(Nunc)。向每个孔中加入200μl下列溶液：0.1M碳酸钠缓冲液,pH 9.6,含下列浓度的溶解的肽： t
第1轮淘选：1mg/ml TLR-9肽 t
第2轮淘选：500μg/ml TLR-9肽 t
第3轮淘选：100μg/ml TLR-9肽 t
于37℃温育1小时，接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。 t
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS)，接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟，容许表面展示噬菌体文库与所结合的肽反应。 t
如下洗去未结合的噬菌体颗粒。在第1轮淘选后：10x300μl T-PBS,5x300μl PBS；在第2轮淘选后：15x300μl T-PBS,10x300μl PBS；在第3轮淘选后：20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。 t
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟，进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后，通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液，接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟，感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后，将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上，并于30℃温育过夜。 t
表1：CH3-噬菌体文库对TLR-9肽的淘选结果（噬菌体滴度） t
淘选轮次 淘选时TLR-9的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml) t
第1轮 1mg/ml 6x1018 2x1010
第2轮 0.5mg/ml 4x1018 2x1010
第3轮 0.1mg/ml 4x1022 6x1010
实施例5：克隆针对TLR-9选择的CH3突变体的选定克隆供可溶性表达 t
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CH3区的DNA，并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中，该载体是插入了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中，并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中，于30℃培养过夜，并通过添加L-阿拉伯糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后，通过离心收获细胞，并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA（见下文）。 t
实施例6：针对TLR-9选择的CH3突变体的ELISA t
通过ELISA对选择的克隆测定对TLR-9肽的特异性结合。 t
包被：微量滴定板(NUNC,Maxisorp)，100μl/孔，20μg TLR-9肽/ml0.1M 碳酸钠缓冲液pH 9.6，37℃，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
封闭：1%BSA-PBS，室温，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
周质提取物结合：50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS，室温，过夜 t
清洗：3x200μl PBS t
一抗：抗His4(Qiagen)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
二抗：山羊抗小鼠*HRP(SIGMA)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
检测：3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5，0.4μl30%H2O2
停止：100ml3M H2SO4
吸光度读数：492/620nm t
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA（如上所述）测试供确认。 t
表2：确认ELISA的结果 t
背景（只有抗原）（12个平行读数）：0.0115 t
实施例7：CH3和CH3+5噬菌体文库对鸡卵溶菌酶的淘选 t
进行3轮淘选。通过向每个孔中添加200μl下列溶液，用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc)： t
PBS，含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶： t
第1轮淘选：2mg/ml HEL t
第2轮淘选：1mg/ml HEL t
第3轮淘选：1mg/ml HEL t
于37℃温育1小时，接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。 t
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS)，接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟，容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。 t
如下洗去未结合的噬菌体颗粒： t
第1轮淘选：10x300μl T-PBS,5x300μl PBS t
第2轮淘选：15x300μl T-PBS,10x300μl PBS t
第3轮淘选：20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。 t
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH2.2并于室温振摇温育30分钟，进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后，通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液，接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟，感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后，将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上，并于30℃温育过夜。 t
表3：噬菌体文库CH3对鸡卵溶菌酶的淘选结果（噬菌体滴度） t
淘选轮次 淘选时HEL的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml) t
第1轮 2mg/ml 4.7x1010
第2轮 1mg/ml 1.29x1022 8.0x109
第3轮 1mg/ml 5.71x1020 4.8x1010
表4：噬菌体文库CH3+5对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选结果（噬菌体滴度） t
淘选轮次 淘选时HEL的浓度 输入(噬菌体/ml) 输出(噬菌体/ml) t
第1轮 2mg/ml 8.3x1016 2.9x109
第2轮 1mg/ml 2.1x1019 2.6x109
第3轮 1mg/ml 5.4x1019 1.2x1010
实施例8：克隆实施例7的选定克隆供可溶性表达 t
如上文关于针对TLR-9选择的CH3突变体所述，进行选定克隆的克隆供可溶性表达。 t
实施例9：实施例7的选定克隆的可溶性表达 t
如上文关于针对TLR-9选择的CH3突变体所述，进行选定克隆的可溶性表达。在初步ELISA（方案见实施例10）中测试周质提取物。 t
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA（如实施例10所述）测试供确认。 t
实施例10：针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的ELISA t
包被：微量滴定板(NUNC,Maxisorp)，100μl/孔，100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS，37℃，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
封闭：1%BSA-PBS，室温，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
周质提取物结合：50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS，室温，过夜 t
清洗：3x200μl PBS t
一抗：抗His4(Qiagen)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
二抗：山羊抗小鼠*HRP(SIGMA)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
检测：3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5，0.4μl30%H2O2
停止：100ml 3M H2SO4
吸光度读数：492/620nm t
表5：针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的确认ELISA的结果 t
背景（只有抗原）（12个平行读数）：0.1763 t
表6：针对鸡卵溶菌酶选择的CH3突变体的抗原稀释的确认ELISA的结果 t
nc:未添加周质提取物 t
注意到鸡卵溶菌酶与抗his4抗体起反应，因此观察到相对较高的背景。 t
表7：针对鸡卵溶菌酶选择的CH3+5突变体的确认ELISA的结果 t
背景（只有抗原）（12个平行读数）：0.1334 t
注意：鸡卵溶菌酶与抗his4抗体起反应，因此观察到相对较高的背景。 t
实施例11：CL文库 t
对Fab片段晶体结构的直观检查（使用人单克隆抗体3D6的Fab的结构：RSCB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)条目1DFB.PDB(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Aug 1;89(15):7154-8)及此蛋白质的二级和三级结构的计算机辅助分析（例如Protein Explorer用于此目的(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)））容许鉴定位于连接CL结构域支架的β链的环区中的残基。这些残基包括第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸（编号依照IMGT编号系统(Lefranc MP,et al.Nucleic Acids Res.2005 Jan 1;33(Database issue):D593-7;Lefranc MP,et al.Dev Comp Immunol.2005;29(3):185-203)）。 t
更具体的说，将人CL结构域内的残基11、12、14-18及92-95随机化(SEQ ID No.48)。随机化是通过用其中相关密码子的位置以核苷酸序列5’-NNS-3’编码的PCR引物PCR扩增编码序列实现的，5’-NNS-3’潜在编码所有20种氨基酸，同时避免3种终止密码子中的2种。通过两个分开的PCR反应扩增文库插入物，并将两个PCR片段经通过PCR引物作为沉默突变引入的HpyCH4IV限制性位点连接到一起。引物还分别提供了限制性内切核酸酶位点NcoI和NotI供克隆到噬菌体展示载体pHEN中(Hoogenboom HR,et al.Nucleic Acids Res.1991 Aug 11;19(15):4133-7)。噬菌体展示不包含CL结构域的C末端半胱氨酸，但是可以稍后在使用改良CL克隆时添加，例如用于构建Fab片段。 t
使用包含人单克隆抗体的完整轻链作为插入物的质粒，诸如pRcCMV-3D6LC(Rüker F,et al.Ann N Y Acad Sci.1991 Dec 27;646:212-9)，作 为PCR扩增的模板。 t
对于在CL结构域的第92和95位之间包含插入的额外残基的CL+3(SEQ ID No.50,51)和CL+5(SEQ ID No.52,53)文库，分别使用引物CLRHPY3和CLRHPY5代替引物CLRHPY。 t
下文显示了克隆到pHEN1的NcoI位点中，导致pelB前导序列附着于构建物的N末端的PCR和连接终产物的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID No.48,49)： t
用于CL文库的引物表： t
cllnco:5′-cttaccatgg ccgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctnn snnscagnns nnsnnsnnsn nsgcctctgt tgtgtgc-3′(SEQ ID No.56) t
cllhpy:5′-tgacaacgtc agggtgctgc tgaggc-3′(SEQ ID No.57) t
clrhpy:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnstacgaga aacacaaagt c-3′(SEQ ID No.58) t
clrhpy3:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nstacgagaa acacaaagtc-3′(SEQ ID No.59) t
clrhpy5:5′-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsta cgagaaacac aaagtc-3′(SEQ ID No.60) t
clrnot:5′-catcgcggcc gcctctcccc tgttgaagct c-3′(SEQ ID No.61) t
选择许多文库克隆（在噬菌粒载体pHEN1中克隆的突变的CL结构域）通过限制性分析和DNA测序进行检验，发现它们包含计划的插入物，包括正确插入的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之，将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒，溶于水，并用于通过淘选进行的选择，或者它们可保存于-80℃。 t
实施例12：CH1文库 t
对Fab片段晶体结构的直观检查（使用人单克隆抗体3D6的Fab的结构：RSCB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)条目1DFB.PDB(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 Aug 1;89(15):7154-8)及此蛋白质的二级和三级结构的计算机辅助分析（Protein Explorer用于此目的(http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)））容许鉴定位于连接CH1结构域支架的β链的环区中的残基。这些残基包括第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117氨基酸（编号依照IMGT编号系统）。 t
更具体的说，将人CH1结构域内的残基12-19及93-100随机化(SEQ ID No.54,55)。随机化是通过用其中相关密码子的位置以核苷酸序列5’-NNS-3’ 编码的PCR引物PCR扩增编码序列实现的，5’-NNS-3’潜在编码所有20种氨基酸，同时避免3种终止密码子中的2种。通过两个分开的PCR反应扩增文库插入物，并将两个PCR片段经CH1结构域中天然存在的BstEII限制性位点连接到一起。引物还分别提供了限制性内切核酸酶位点NcoI和NotI供克隆到噬菌体展示载体pHEN中。噬菌体展示不包含CH1结构域的C末端半胱氨酸，但是可以稍后在使用改良CH1克隆时添加，例如用于构建Fab片段。 t
使用包含人单克隆抗体的完整重链作为插入物的质粒，诸如pRcCMV-3D6HC，作为PCR扩增的模板。 t
下文显示了克隆到pHEN1的NcoI位点中，导致pelB前导序列附着于构建物的N末端的PCR和连接终产物的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID No.54,55)： t
用于CH1文库的引物表： t
CH1LNCO:5′-acgtccatgg ccgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn sgccctgggc tgcctggtc-3′(SEQ ID No.62) t
CH1LBST:5′-ggcacggtca ccacgctgct gag-3′(SEQ ID No.63) t
CH1RBST:5′-agcgtggtga ccgtgcccnn snnsnnsnns nnsnnsnnsa cctacatctg caacgtgaat c-3′(SEQ ID No.64) t
CH1RNOT:5′-catagcggcc gcagatttgg gctcaacttt cttgtc-3′(SEQ ID No.65) t
选择许多文库克隆（在噬菌粒载体pHEN1中克隆的突变的CH1结构域）通过限制性分析和DNA测序进行检验，发现它们包含计划的插入物，包括正确插入的随机化序列。制备噬菌体的后续步骤遵循标准方案。简而言之，将连接混合液通过电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。随后用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞回收(rescue)噬菌体颗粒。然后以2步用PEG/NaCl从培养物上清液沉淀噬菌体颗粒，溶于水，并用于通过淘选进行的选择，或者它们可保存于-80℃。 t
实施例13：CH1噬菌体文库对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选 t
用CH1噬菌体文库进行3轮淘选（见实施例12）。通过向每个孔中添加200μl下列溶液，用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc)：PBS，含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶： t
第1轮淘选：2mg/ml HEL t
第2轮淘选：1mg/ml HEL t
第3轮淘选：1mg/ml HEL t
于37℃温育1小时，接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1 小时。 t
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl 4%奶粉(M-PBS)，接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟，容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。 t
如下洗去未结合的噬菌体颗粒： t
第1轮淘选：10x300μl T-PBS,5x300μl PBS t
第2轮淘选：15x300μl T-PBS,10x300μl PBS t
第3轮淘选：20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。 t
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟，进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后，通过添加60μl 2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液，接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟，感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后，将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上，并于30℃温育过夜。 t
克隆针对溶菌酶选择的CH1突变体的选定克隆供可溶性表达 t
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CH1结构域的DNA，并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中，该载体是插入了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中，并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中，于30℃培养过夜，并通过添加L-阿拉伯糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后，通过离心收获细胞，并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA。 t
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA（如下所述）测试供确认。 t
针对鸡卵溶菌酶选择的CH1突变体的ELISA t
包被：微量滴定板(NUNC,Maxisorp)，100μl/孔，100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS，37℃，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
封闭：1%BSA-PBS，室温，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
周质提取物结合：50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS，室温，过夜 t
清洗：3x200μl PBS t
一抗：抗His4(Qiagen)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
二抗：山羊抗小鼠*HRP(SIGMA)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
检测：3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5，0.4μl30%H2O2
停止：100ml3M H2SO4
吸光度读数：492/620nm t
若克隆的ELISA信号是背景信号的至少3倍，则认为它是阳性的。 t
实施例14：CL噬菌体文库对鸡卵溶菌酶(HEL)的淘选 t
用CL噬菌体文库进行3轮淘选（见实施例11）。通过向每个孔中添加200μl下列溶液，用鸡卵溶菌酶包被Maxisorp 96孔板(Nunc)：PBS，含下列浓度溶解的鸡卵溶菌酶： t
第1轮淘选：2mg/ml HEL t
第2轮淘选：1mg/ml HEL t
第3轮淘选：1mg/ml HEL t
于37℃温育1小时，接着每个孔用200μl2%奶粉(M-PBS)于室温封闭1小时。 t
然后通过添加100μl噬菌体悬浮液和100μl4%奶粉(M-PBS)，接着于室温振摇温育45分钟、静置温育90分钟，容许表面展示噬菌体文库与所结合的鸡卵溶菌酶反应。 t
如下洗去未结合的噬菌体颗粒： t
第1轮淘选：10x300μl T-PBS,5x300μl PBS t
第2轮淘选：15x300μl T-PBS,10x300μl PBS t
第3轮淘选：20x300μl T-PBS,20x300μl PBS。 t
通过向每个孔中添加200μl0.1M甘氨酸pH 2.2并于室温振摇温育30分钟，进行所结合噬菌体颗粒的洗脱。随后，通过添加60μl2M Tris-碱中和噬菌体悬浮液，接着通过混合10ml指数式生长的培养物与0.5ml洗脱的噬菌体并于37℃温育30分钟，感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后，将受感染的细菌涂布在含1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TYE培养基上，并于30℃温育过夜。 t
克隆针对溶菌酶选择的CL突变体的选定克隆供可溶性表达 t
用微量制备试剂盒(midi-prep)分离来自通过3轮淘选选择的噬菌体的噬菌粒DNA。通过PCR分批扩增编码突变的CL结构域的DNA，并以NcoI-NotI克隆到载体pNOTBAD/Myc-His中，该载体是插入了NotI限制性位点以便于克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。通过电穿孔将连接构建物转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)中，并于30℃在含1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将选择的克隆接种到200μl含氨苄青霉素的2xYT培养基中，于30℃培养过夜，并通过添加L-阿拉伯糖至终浓度0.1%而诱导。于16℃表达过夜后，通过离心收获细胞，并用100μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃处理过夜以制备周质提取物。取50μl周质提取物用于ELISA。 t
将在此第一次、初步ELISA中给出高信号的克隆如上所述以相同条件在20ml体积中培养。如上所述在1/20培养物体积中分离它们的周质提取物并通过ELISA（如下所述）测试供确认。 t
针对鸡卵溶菌酶选择的CL突变体的ELISA t
包被：微量滴定板(NUNC,Maxisorp)，100μl/孔，100μg鸡卵溶菌酶/mlPBS，37℃，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
封闭：1%BSA-PBS，室温，1小时 t
清洗：3x200μl PBS t
周质提取物结合：50μl周质提取物,50μl2%BSA-PBS，室温，过夜 t
清洗：3x200μl PBS t
一抗：抗His4(Qiagen)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
二抗：山羊抗小鼠*HRP(SIGMA)，1:1000在1%BSA-PBS中稀释，室温，90分钟，100μl/孔 t
清洗：3x200μl PBS t
检测：3mg/ml OPD溶于Na-柠檬酸/磷酸缓冲液pH 4.5，0.4μl30%H2O2
停止：100ml3M H2SO4
吸光度读数：492/620nm t
若克隆的ELISA信号是背景信号的至少3倍，则认为它是阳性的。 t
实施例15：两侧都随机化的免疫球蛋白结构域（双特异性工程改造的CH3结构域）的构建 t
此实施例描述了具有两种结合特异性的工程改造的免疫球蛋白结构域。 t
此工程改造的免疫球蛋白结构域的设计包括下列策略： t
●使用衍生自特异性结合溶菌酶的CH3+5文库的工程改造的CH3结构域，克隆C24（见实施例10）作为起点 t
●在此经修饰的CH3结构域中鉴定这样的待随机化残基，它们连接免疫球蛋白折叠的β链，且与在生成克隆C24时突变的残基相比位于结构域的对侧 t
●设计这样的PCR引物，它们容许这些残基的随机化，并以与上文关于CH3、CH3+3和CH3+5文库所述相似的流程合成此工程改造的免疫球蛋白结构域 t
通过PCR连接含随机化位置的4个PCR产物并扩增全长插入物。随后，它们经NcoI-NotI位点克隆到pHEN-1中并转化到大肠杆菌TG-1细胞中以构建约108个菌落的文库。将20个随机选择的菌落测序，发现随机化位置独立突变了。而且没有观察到“野生型”(C24)序列。依照标准方案生成噬菌体文库，噬菌体滴度达到6.32x1010TU/ml。 t
为了测试双特异性，选择重组人红细胞生成素(rhEPO)作为第二抗原，同时预期构建物保留其对鸡卵溶菌酶的最初的工程改造的特异性。在4轮淘选中选择rhEPO反应性噬菌体。为了保存在诱变后仍然应当结合鸡卵溶菌酶的C24克隆群，在第一轮对rhEPO选择后，噬菌体群对鸡卵溶菌酶（1mg/ml，溶于PBS）进行一轮淘选。在后续淘选轮次中在0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6 中以逐渐降低的浓度用200μl rhEPO包被微量滴定板(Maxisorp,Nunc)的5个孔（见下表）。用2%M-PBS封闭后，容许噬菌体在封闭剂中于室温结合2小时。用T-PBS清洗20次、用PBS清洗20次后，用0.1M甘氨酸pH2.2洗脱，并用2M Tris中和。洗脱的噬菌体立即用于感染指数式生长的TG-1。在含氨苄青霉素的培养基上选择受感染的细胞。用辅助噬菌体M13-KO7超感染后从培养物上清液回收(rescue)噬菌体颗粒，用PEG浓缩，并用于另一轮淘选。每轮淘选后以大肠杆菌转化单位测定输入和输出噬菌体数（表8）。 t
表8： t
从板上刮下所得菌落，在含氨苄青霉素的2xYT中培养，并用微量制备试剂盒(midi-prep)分离它们的质粒DNA。通过PCR扩增插入物，然后亚克隆到载体pNOTBAD中并转化到大肠杆菌菌株E104中。将4x72个菌落在200μl含氨苄青霉素的2xYT中培养并在次日用0.1%L-阿拉伯糖诱导。于16℃表达24小时后，将它们用200μl硼酸钠缓冲液pH 8.0于4℃溶解6小时并将周质提取物用于ELISA。 t
对于ELISA，将Maxisorp板分别用PBS中鸡卵溶菌酶(20μg/ml)或0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6中的rhEPO于37℃包被1小时。用1%BSA-PBS封闭后，容许周质提取物在相同的封闭剂中结合过夜。用抗His-(4)抗体和偶联有HRP（用于鸡卵溶菌酶检测）或AP（用于rhEPO检测）的山羊抗小鼠IgG抗体展现结合。用1.25M H2SO4停止后在492/620nm读取OPD转变(HRP)的有色反应，在405/620nm读取pNPP转变(AP)。选择吸光度值有希望的14个克隆用于20ml规模的表达。用阿拉伯糖于16℃诱导24小时后，收集细胞并在1ml硼酸钠缓冲液中于4℃溶解过夜，将溶解液用于ELISA。如上4份平行进行ELISA，使用没有周质提取物和没有抗原的孔作为阴性对照。依照SEQ ID No.42,43的克隆得到如下结果（表9）。 t
表9： t
实施例16：工程改造的CH3结构域以Fab样型式提供双特异性 t
在此实施例中所使用的构建物中，抗体的VL和VH链都与经工程改造的CH3结构域融合。 t
使用识别HIV-1 gp41上表位的人单克隆抗体3D6的VL和VH区(He XM,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1992 89:7154-8.;Kohl J,et al.Ann N Y Acad Sci.1991 646:106-14.;Felgenhauer M,et al.Nucleic Acids Res.199018:4927)作为特异性结合鸡卵溶菌酶的经工程改造的CH3结构域克隆C24的融合配偶体。 t
为了促进经二硫键形成VL-CH3/VH-CH3二聚体，将残基Ser-Cys添加到C24序列的C末端。 t
两条链，3D6VL-C24和3D6VH-C24的核苷酸和氨基酸序列分别给出于SEQ ID No.47,46及SEQ ID No.45,44。 t
设计这样的引物，它们容许扩增编码区，同时引入限制性位点（沉默突变）用于将编码区连接到一起。对于基因的表达，选择巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达系统。将构建物克隆到合适的巴斯德毕赤氏酵母表达载体中：将3D6VL-C24克隆到pPIC9K中（最终的名称：pPIC9K3LC），将3D6VH-C24克隆到pPICZalphaA中（最终的名称：pPICZ3HC）。将构建物pPICZ3HC用Bgl II线性化，转化到巴斯德毕赤氏酵母GS115中，并在含zeocin的固体培养基上选择转化子。随后将转化子之一用作Sal I线性化的构建物pPIC9K3LC的宿主细胞。然后在RDB培养基上选择双重转化子。 t
将克隆接种到30ml YPG培养基中并培养至OD600=10，然后通过添加BMMY培养基中的1%甲醇而诱导。诱导于16℃持续36小时。通过离心取出上清液，然后浓缩约10倍。通过使用抗His(4)抗体的Western印迹验证了重组蛋白的存在，估计浓度是约50-100μg/l最初培养物。 t
第一功能测试用10倍浓缩的上清液进行。首先，将Maxisorp板的孔分别用PBS中的20μg/ml鸡卵溶菌酶或0.1M碳酸钠缓冲液pH 9.6中的 20μg/ml抗体3D6的表位于37℃包被1小时。3D6表位以重组生成的GST融合蛋白的形式使用。用1%BSA-PBS封闭后，容许浓缩的上清液在相同的封闭剂中结合过夜。用抗His(4)抗体和偶联有HRP的山羊抗小鼠IgG抗体展现结合，并以492/620nm源自OPD转变的有色反应显现（表10）。 t
表10 t
