一对多肽及其编码基因和应用
技术领域tt
本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一对多肽及其编码基因与应用，尤tt其涉及一对特异识别猪A20基因的多肽及其编码基因和应用。tt
背景技术tt
A20属于抗凋亡基因家族，除具有抗凋亡的作用外，它也是NFκB信号通路一个重tt要的抑制因子。而且，相对于其它NFκB抑制因子而言，A20具有其自身独特的优势，tt一方面可克服lκBα促凋亡的缺点，另一方面也不存在p65RHD发挥功能的入核门槛(即ttp65RHD须进入核内方可发挥抑制作用)。人A20目前已成功应用于异种供体用转基因猪tt制作(Oropeza et a1.，2009)，其抗内皮细胞凋亡、抗炎症的作用在个体水平得到了验证。tt因此，A20基因可作为猪抗病育种及异种移植研究的一个重要候选基因。在细胞或个体tt水平上对猪A20基因进行敲除或修饰，可解析猪A20基因的功能，为猪育种及医药研发tt服务。tt
转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)tt技术是一个高效的基因打靶新工具。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够tt识别、结合DNA。TALE与DNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序tt列介导。将TALEs与Fokl核酸内切酶的切割域相连接，形成TALENs，从而可以实现对基tt因组DNA序列的精确修饰。TALENs是一种异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构tt域融合到一单位的催化性结构域)，能够切割两个相隔较近的序列，从而使得特异性增tt强。tt
发明内容tt
本发明的目的是提供一对特异识别猪A20基因的多肽及其编码基因和应用。本发明tt利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别tt猪A20基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效tt应因子核酸酶(TALENs)，能够对猪A20基因进行准确、高效地靶向修饰。tt
具体地，本发明的目的是这样实现的：tt
一对特异识别猪A20基因的多肽(命名为特异多肽对)，由多肽甲和多肽乙组成；tttttt所述多肽甲由16个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨tt基酸；所述多肽乙由17个TAL核酸识别单元组成，每个TAL核酸识别单元中具有一个tt双连氨基酸；tt
所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下：序列表的序列3自N末端第12-13位tt氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残tt基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、tt第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第tt352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455tt位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基；tt
所述多肽乙中的17个双连氨基酸依次如下：序列表的序列4自N末端第12-13位tt氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残tt基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、tt第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第tt352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455tt位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基、第522-523位氨基酸残基和第556-557位氨tt基酸残基。tt
所述多肽甲的氨基酸序列具体可如序列表的序列2所示。tt
所述多肽乙的氨基酸序列具体可如序列表的序列4所示。tt
本发明还保护一对DNA分子(命名为特异DNA分子对)，由编码所述多肽甲的DNAtt分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。tt
所述DNA分子甲中，编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列tt表的序列1自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、tt第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷tt酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059tt位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、tt第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸。tt
所述DNA分子乙中，编码所述多肽乙的17个双连氨基酸的核苷酸依次如下：序列tt表的序列3自5’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、tt第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷tt酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059tttttt位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、tt第1462-1467位核苷酸、第1564-1569位核苷酸和第1666-1671位核苷酸。tt
所述DNA分子甲的核苷酸序列具体可如序列表中的序列1所示。tt
所述DNA分子乙的核苷酸序列具体可如序列表中的序列3所示。tt
本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰猪A20基因中的应用。所述猪ttA20基因，其NCBI Genne ID为392583951。tt
本发明还保护所述特异多肽对在构建猪A20基因突变库中的应用。所述猪A20基因，tt其NCBI Gene ID为392583951。tt
与现有技术相比，本发明提供了特异识别猪A20基因的多肽对，并提供了该多肽对tt的编码基因。本发明可实现在细胞或个体水平上对猪A20基因进行准确敲除或修饰，以tt解析猪A20基因的功能、构建猪A20基因突变库或获得相关疾病模型，为猪育种及医药tt研发服务。tt
附图说明tt
图1为TALENs靶点设计结果示意图。tt
图2为TALEN质粒对(左臂TALEN和右臂TALEN)转染猪PEF细胞60小时后提取ttDNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)。tt
图3为TALEN质粒对的工作原理示意图。tt
具体实施方式tt
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方tt法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均tt为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，tt结果取平均值。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。tt
FastTALETM TALEN快速构建试剂盒：上海斯丹赛生物技术有限公司，CatttNo.1802-030。该试剂盒包含两个模块板：模块板1包含96个模块，每个模块识别连续的tt两个碱基；模块板2包含76个模块，其中48个模块识别连续的两个碱基，28个模块识别tt单个碱基。另外，该试剂盒还包括其他组分：溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、tt感受态细胞、SOC培养基、ddH2O；TALEN骨架载体，包括左臂骨架和右臂骨架。tt
实施例1、TALENs质粒对的构建tt
1、TALENs靶点设计tt
采用在线软件(https：／／tale-nt.cac.cornell.edu)设计。将猪A20基因CDS序列(NCBI Gene ttID为392583951)输入软件中，在7-60bp区域找到靶序列，具体示意图如图1所示。ttTALENs左臂识别序列是5’-GAGCAACTCCTTCCCC-3’，右臂识别序列是5’-ttCTTCACAGCCTTCCGCA-3’。tt
2、TALENs模块组装tt
依照FastTALETMTALEN快速构建试剂盒(以下简称“试剂盒”)说明书进行。具体tt步骤如下：tt
1)将左右臂识别序列分别拆分为9个模块，以一个或两个碱基组合为一个模块，tt依次进行标记，如首个标记为1，最后一个标记为9，如下所示：tt
左臂L4：G1AG2CA3AC4T5CC6TT7CC8CC9(使用骨架载体L15)tt
右臂R4：CT1TC2AC3A4GC5CT6TC7CG8CA9(使用骨架载体R11)tt
2)从试剂盒中取出相应编号的9个模块，每个模块取1.5微升，并将其加入同一tt个PCR管中。tt
3)将溶液1、溶液2从-20℃冰箱取出置于冰盒上，溶液3放置于37℃水浴锅中溶tt解。tt
4)按如下体系加样，先加入相应的TALEN骨架载体(L15或R11)，然后将溶液3、tt溶液1、溶液2依次加入步骤2的PCR管中，最后加水补至20微升，短暂离心混匀。tt
连接体系：tt
5)将上述PCR管放入PCR仪中进行连接反应(关掉PCR仪热盖温度)。tt
连接程序如下：tt
6)取出PCR管，将溶液4(1微升)、溶液5(0.5微升)依次加入该管中，混匀，tt在PCR仪中37℃孵育一小时。tt
7)将步骤6的最终产物(20微升)加入含感受态细胞(试剂盒组分)的FP管中，tt混匀，在冰上放置30分钟，然后放入42℃水浴锅中热激45秒，在迅速放置于冰上3tt分钟。tt
8)在超净工作台中向上一步的EP管中加入500微升SOC溶液(试剂盒组分)，置tt于37℃、250rpm的摇床中培养30分钟。tt
9)将上一步的EP管取出，4000rpm离心5分钟。tt
10)在超净工作台中弃去EP管中的大部分上清，留下约100微升，并将沉淀轻轻tt吹打均匀，均匀涂布于卡那霉素抗性的平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时。tt
11)次日挑取10个单克隆，将单克隆接种于装有5毫升LB培养液(含卡那霉素)tt的15毫升离心管中，在37℃、250rpm的摇床中培养16小时。tt
12)将上一步所得单克隆菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序正tt向引物为5'-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’，测序反向引物为tt5'-AGCTGGGCCACGATTGAC-3'。所得一对质粒命名为左臂TALEN和右臂TALEN。左tt臂TALEN质粒测序所得序列为序列表所示序列1，右臂TALEN质粒测序所得序列为序列tt表所示序列3。tt
实施例2、通过测序验证实施例1构建的TALENs对的活性tt
PEF细胞(猪胎儿成纤维细胞)：从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞(分离方法参见tt文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维tt细胞系的建立及其生物学特征；湖南农业大学学报(自然科学版)；第36卷第6期；2010tt年12月；678-682)。tt
1、将重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN各4μg通过电转化的方式共转染1×106PEFtt细胞，得到重组细胞。tt
2、将步骤1得到的重组细胞30℃培养60小时，然后收集细胞。tt
3、提取步骤2收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组成的引物对进tttttt行PCR扩增，回收249bp的PCR扩增产物。tt
PCRF：5’-ATGGCTGAGCAACTCCTTC-3’；tt
PCRR：5’-GAGCTTCTTCTGGCTTTCC-3’。tt
4、将步骤3得到的PCR扩增产物与pMD18-T载体(宝生物，货号：D101A)连接，得tt到连接产物。tt
5、将步骤4得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物，D9057S)，tt然后涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取100个克隆并进tt行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而估算出该对TALEN质粒的效率。结tt果发现4个克隆在预期切割位点附近出现突变(详见图2)，即重组质粒左臂TALEN和右tt臂TALEN组成的TALEN质粒对在PEF细胞基因组中的切割效率达4％。tt
重组质粒左臂TALEN和右臂TALEN的工作原理见图3，两种带有Fok I功能域的靶向ttTALE核酸酶分别在CMV启动子控制下高效表达，并进入细胞核内，与相应的靶点DNA发生tt特异性结合，使得Fok I核酸内切酶形成二聚体行使DNA切割活性，切断目标基因DNA双tt链。tt
