一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒
技术领域t
本发明涉及化学领域，特别是涉及一种先导化合物的合成及筛选方法与试剂盒。 t
背景技术t
自80年代末期，随着分子生物学研究的突破—高通量筛选技术的发展，新药开发所需要的新分子实体的数目越来越多，科学家们把注意力从寻找天然产物转入合成大数目的化合物群——化学库，化学库是由诸多不同属性的有机化合物组成的。组合化学方法是一种合成化学库的技术，运用这项技术，不同系列的合成砌块——反应成分有序地排列起来以组成大系列的多样化分子实体群。组合化学合成法经常被人们称为数字游戏，也就是如何排列众多的合成砌块的问题，从理论上讲，组合合成的总反应产物数N是由两个因素决定的，每一步的合成砌块数目b和合成的步骤x，例如，对于一个三步的线性组合反应，如果每步的反应物数目分别是b1、b2、b3，那么理论上的总反应产物的数目是N=b1b2b3。组合化学研究的目标就是怎样有效地得到这一反应的所有产物N。近年来，从固相合成到快速液相平行合成，组合化学在合成方法上取得了突破性的进展，常用的几种合成方法有固相有机合成和液相有机合成，固相有机合成包括混合裂分法和平行合成法，液相有机合成包括多组分液相合成法和官能团转化法。 t
组合化学合成技术建立的化学库中，产物成千上万，甚至上亿，像经典有机合成那样一个一个的纯化分离鉴定已不再可能。高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千、万计的样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。高通量筛选方法极大地提高了小分子化合物筛选的速度和效率，可以从组合化学文库中筛选作用于靶标分子的化合物。但是，用传统的高通量筛选方法将化合物从化学文库中筛选出来后，纯化并确定目标化合物的结构非常困难，需要的时间长，成本高，随着化合物文库的扩大，难度更大。 t
为了解决该问题，申请号：95193518.6，发明名称：“用标记编码的复杂组合化学文库”的专利申请公开了一种方法，即在合成的每个阶段， 在化合物进行合成的载体（例如颗粒）上，专一地进行标记，以定义随同该载体上化合物合成时伴随的特定事项（通常指所加化学试剂）。所述标记使用鉴定剂分子来完成，该分子记录合成期间载体颗粒所经历的按顺序的事项，由此提供在该载体上生产化合物的反应历程。但是该申请并未提供实现该方法的技术方案。 t
现有技术中有报道使用寡核苷酸标记化合物的合成单元，根据生物领域的常识，在常规条件下，双链DNA较单链DNA稳定，因此通常选择双链的寡核苷酸对化合物的合成单元进行标记，如： t
公告号：EP0643778，发明名称：“encoded combinatorial chemical libraries”的专利公开了用单链寡核苷酸标记氨基酸或多肽的方法；公告号：US7935658，发明名称：“methods for synthsis of encoded libraries”的专利公开了一种用双链DNA片段标记合成砌块，形成化合物文库的方法；申请号：WO/2010/094036，发明名称：“METHODS OF CREATING ANDSCREENING DNA-ENCODED LIBRARIES”的专利申请公开了用寡核苷酸标记化合物，形成化合物文库的方法，其寡核苷酸为发卡结构的双链DNA。 t
但是，用双链DNA标记合成砌块或者化合物时，在连接延伸过程中，双链DNA容易交联，形成卷曲的三级结构，测序时，需要解链，操作较复杂，用双链DNA标记三步以上的线性组合反应时，双链DNA的测序结果误差较大，导致该方法只能停留在两维，因而只能通过增加每一步反应的合成砌块数目来增加文库中化合物数量，制得的化合物文库多样性差，不易合成得到目标化合物。 t
需要寻找新的，操作简便，结果更准确的标记方法。 t
发明内容t
为了解决上述问题，本发明提供了一种先导化合物的合成及筛选的试剂盒和方法，以及一种新的组合化学文库。 t
名词解释： t
合成砌块（Synthetic Building Block），又叫合成子，是指具备各种理化性质以及特定生物化学性质的、在新药（西药、农药）研发过程中必须使用的小分子化合物。 t
先导化合物（lead compound）简称先导物，是通过各种途径和手段得到的具有某种生物活性和化学结构的化合物，用于进一步的结构改造和修饰，是现代新药研究的出发点。 t
反应历程：就是反应所经历的过程。 t
串联连接：是指若干段单链DNA序列之间依次两端点相连，且连接点 上没有分枝。 t
本发明先导化合物的合成及筛选的方法，它包括如下步骤： t
（1）取原料：i种合成砌块与（i+2）种单链DNA片段，（i+2）种单链DNA片段包括i种标记序列、1种始端序列和1种末端序列，i种标记序列分别特异标记i种合成砌块，其中，i=1，2，3…n； t
（2）用组合化学方法合成化合物： t
a、制备初始合成砌块：选择1~i种合成砌块，将始端序列的一端连接在合成砌块上，另一端与所述合成砌块的特异标记序列串联连接，得到1~i种标记有一端游离的单链DNA的初始合成砌块； t
b、以步骤a得到的初始合成砌块为基础，用线性组合反应的方式合成化合物，合成过程中，每加入新的合成砌块，就在与初始合成砌块相连的单链DNA游离端串联连接所加入合成砌块的特异标记序列，使所述单链DNA逐渐延长，合成结束后，在所述单链DNA游离端串联连接末端序列，即得到单链DNA标记的化合物文库； t
（3）筛选：对DNA标记的化合物的文库进行筛选，选出目标化合物； t
（4）测序：将步骤（3）筛选得到的目标化合物的DNA进行测序，确定目标化合物的结构。 t
其中，步骤（1）所述始端序列包括多聚腺苷。优选地，所述多聚腺苷为12~20个腺苷。 t
其中，步骤（1）所述标记序列的长度不低于6bp。优选地，所述标记序列的长度为9个bp。 t
其中，所述步骤（2）合成过程中，pH为8~12，温度为0~30℃。 t
其中，步骤（1）所述标记序列的3’端连接一个核糖核苷酸。所述核糖核苷酸为胞苷。 t
其中，步骤（2）中，a步骤中始端序列与初始合成砌块连接的方法是： t
将始端序列氨基化，初始合成砌块羧基、巯基或炔基化，反应即得。 t
其中，步骤（2）所述连接始端序列与标记序列、标记序列之间或者标记序列与末端序列的连接方法是：用多核苷激酶使得单链DNA的5’-端磷酸化，用RNA连接酶连接，即可。所述的多核苷激酶为T4多核苷激酶，所述RNA连接酶为T4RNA连接酶。 t
其中，所述步骤（3）中的筛选方法是基于受体-配体特异性反应的筛选方法。 t
本发明先导化合物的合成及筛选试剂盒，它包括如下成分： t
1）i种合成砌块与（i+2）种单链DNA片段，单链DNA片段分为始端序列、末端序列和i种标记序列，i种标记序列分别特异标记i种合成砌块， 其中，i=1，2，3…n； t
2）始端序列与合成砌块连接用试剂、组合化学方法用试剂和单链DNA片段连接用试剂； t
3）化合物筛选用试剂； t
4）DNA测序用试剂。 t
其中，成分1）所述始端序列包括多聚腺苷。优选地，所述多聚腺苷为12~20个腺苷。 t
其中，成分1）所述标记序列的长度不低于6bp。优选地，所述标记序列的长度为9个bp。 t
其中，步骤（1）所述标记序列的3’端连接一个核糖核苷酸。所述核糖核苷酸为胞苷。 t
其中，成分2）所述始端序列与合成砌块连接用试剂包含氨基化单链DNA的试剂以及羧基、巯基或炔基化初始合成砌块的试剂。 t
其中，成分2）所述单链DNA片段连接用试剂包括多核苷激酶和RNA连接酶。 t
优选地，所述的多核苷激酶为T4多核苷激酶，所述RNA连接酶为T4RNA连接酶连接。 t
本发明组合化学文库，它是以合成砌块为原料，用组合化学方法合成的组合化学文库，其中，每个化合物标记了一段单链DNA序列，该单链DNA序列的结构为始端序列——i种标记序列——末端序列，所述i种标记序列特异标记i种组合化学合成过程中使用的合成砌块，其排列顺序与组合化学合成过程中合成砌块的加入顺序相同。 t
其中，所述标记序列的长度不低于6bp。优选地，所述标记序列的长度为9个bp。 t
标记序列的长度为6时，可制备4096个不同序列的单链DNA片段，DNA片段编码的、用于制备组合化学文库的合成砌块数以千计，能满足大多数化合物合成及筛选的需要；标记序列为或9时，可制备262144个不同序列的单链DNA片段，其编码的、用于制备组合化学文库的合成砌块高达262144个，DNA片段编码的、用于制备组合化学文库的合成砌块数以百万计，完全可以满足化合物合成及筛选的需要。若标记序列越长，其可以编码的合成砌块数量越大，制备的组合化学文库越大，但是相应的，成本越高，综合考虑库容和成本，标记序列的长度为9时最优。 t
在本发明条件下，用单链DNA标记合成砌块，连接过程中，单链DNA之间不会互补而形成双链，结构稳定，也不易交联，测序时不需要解链，操作简单、快速、结果准确。因此，本发明方法可以包含多步线性组合反应， 合成的化合物文库多样性好，库容大，容易合成得到目标化合物并确定其合成砌块、反应历程及化学结构，从而迅速合成得到大量目标化合物，是一种准确高效、操作简便、成本低廉的先导化合物文库合成和筛选方法，应用前景良好。 t
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 t
附图说明t
图1本发明用组合化学方法合成化合物的进程示意图，其中，“H”表示合成砌块；“初”表示初始序列；“B”表示标记序列，其特异标记合成砌块，数字代表二者的对应关系，如，B1特异标记H1；“末”表示末端序列；左栏表示反应步骤，与实施例1反应步骤一致；得到的终产物，合成砌块从右至左仅表示合成砌块的加入顺序，初始序列、标记序列和末端序列从左至右表示最终得到的单链DNA序列的结构； t
图2本发明化学文库以及筛选得到的胰蛋白酶抑制剂的电泳图； t
图3测序结果柱状图，柱与化合物一一对应，其高度与该化合物与靶标的结合力相关； t
图4本发明胰蛋白酶抑制剂的IC50图谱； t
图5本发明胰蛋白酶抑制剂的IC50图谱。 t
具体实施方式t
以下通过实施例的形式来阐述具体实施方式，并对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 t
实施例1本发明先导化合物的合成及筛选方法 t
1、制备方法 t
（1）取合成砌块和单链DNA片段： t
i种合成砌块与（i+2）种单链DNA片段，（i+2）种单链DNA片段包括i种标记序列、一种始端序列和一种末端序列，i种标记序列分别特异标记i种合成砌块，其中，i=1，2，3…n； t
始端序列上可连接多聚腺苷，以便分离纯化，标记序列上均可以连接胞苷，提高后续单链DNA片段的连接效率。 t
表1单链DNA片段 t
（2）合成：如图1所示，用组合化学方法合成化合物文库： t
a、制备初始合成砌块：选择1~i种合成砌块，将始端序列的一端连接在合成砌块上，另一端与所述合成砌块的特异标记序列串联连接，得到1~i种标记有一端游离的单链DNA的初始合成砌块，如，i=2；
①初始合成砌块与始端序列连接： t
取始端序列，氨基化，取合成砌块1和2，羧基、巯基或炔基化；取活化的合成砌块1和2与活化的始端序列反应，得连接了始端序列的初始合成砌块； t
②分别在始端序列上连接合成砌块1和2的标记序列（该连接方法除了可以用下述方法以外，还可以用其他单链DNA的连接方法）： t
用多核苷激酶使得单链DNA的5’-端磷酸化；RNA连接酶连接，即可； t
③混合，得初始合成砌块混合物。 t
b、以步骤a得到的初始合成砌块为基础，用线性组合反应的方式合成化合物，合成过程中，每加入新的合成砌块，就在与初始合成砌块相连的单链DNA游离端串联连接所加入合成砌块的特异标记序列，使所述单链DNA逐渐延长，合成结束后，在所述单链DNA游离端串联连接末端序列，即得到单链DNA标记的化合物文库；比如，三步线性组合反应。
I： t
①合成（除了下述合成方法以外，还可以用其他化学合成方法）：取合成砌块3~4，置于2个微型反应容器中，分别与步骤a制得的初始合成砌块混合物中混合，按照混合裂分法、平行合成法、多组分液相合成法或者官能团转化法合成； t
②加标记序列：同步骤a步骤②。 t
③混合，得混合物。 t
Ⅱ： t
①合成（除了下述合成方法以外，还可以用其他化学合成方法）：取合成砌块5~6，置于2个微型反应容器中，分别与步骤b制得混合物混合，按照混合裂分法、平行合成法、多组分液相合成法或者官能团转化法合成； t
②加标记序列：同步骤a步骤②。 t
③加末端序列：同步骤a步骤②。 t
④混合，即得到单链DNA标记的化合物的文库。 t
（3）筛选：对DNA标记的化合物的文库进行筛选： t
基于受体-配体特异性反应的色谱分离筛选方法，用生物靶分子对DNA标记的化合物的文库进行筛选。 t
对色谱进行洗脱，将未与生物靶标分子结合的DNA标记的化合物除去，分离得到与生物靶分子结合的DNA标记的化合物。 t
（4）测序： t
取步骤（3）筛选得到的DNA标记的化合物，对DNA标记的化合物上的DNA测序，根据DNA序列即可确定该化合物的合成砌块和反应历程。 t
实施例2用本发明方法成和筛选胰蛋白酶配体 t
1、材料和试剂 t
T4PNK(500U NEB-M0201V),T4RNA ligase1(NEB-M0204S),Cartridges(PCR purification Kit(cat.no28104,Nucleotides removal Kit cat.no28306)purchased from Qiagen(Hilden,Germany).dNTPs(0.5mM,NEB,cat.no89009). t
表1所示单链DNA片段，由Genscript公司和Biosune公司合成。 t
2、制备方法 t
（1）制备单链DNA片段： t
本实施例一共用了多少个合成砌块，请提供这写合成砌块及其编码序列。 t
54种合成砌块与56种单链DNA片段，57种单链DNA片段包括55种标记序列、1种始端序列和1种末端序列； t
下述标记序列上均可以连接胞苷，提高后续单链DNA片段的连接效率。 t
表2单链DNA片段 t
（2）合成： t
a、制备初始合成砌块：选择一种合成砌块，将始端序列的一端连接在合成砌块上，另一端与所述合成砌块的特异标记序列串联连接，得到一种标记有一端游离的单链DNA的初始合成砌块；
①初始合成砌块与始端序列连接： t
取始端序列，氨基化，取合成砌块1，羧基化；取活化的合成砌块1与活化的始端序列反应，得连接了始端序列的初始合成砌块。 t
反应混合物总体积为150微升，溶剂为水和二甲亚砜体积比为3:7，其中含三乙胺盐酸缓冲体系（pH10.0，80mM），其中，合成砌块1的浓度为30mM，活化试剂1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）浓度为4mM，2-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10mM，始端序列浓度为20M，室温反应1小时。 t
②在始端序列上连接合成砌块1的标记序列（该连接方法除了可以用下述方法以外，还可以用其他单链DNA的连接方法）： t
用多核苷激酶使得单链DNA的5’-端磷酸化；RNA连接酶连接，即可。 t
连接：取步骤①处理后的始端序列与标记序列1，15ul的反应混合物包括225pmol始端序列、25pmol标记序列1、50单位T4RNA连接酶以及连接反应的缓冲液；该混合物在25℃孵育1.5h，后再70℃加热20min，T4RNA连接酶变性；加入T4多核苷酸激酶和1nmATP，反应10个循环，接着在75℃孵育20min使额外的多核苷激酶变性； t
纯化：产物用等体积的2×上样缓冲液中，该缓冲液包含40mMTris-HCL(pH7.6)、1M NaCL和1mM EDTA； t
得到的混合物通过如下步骤纯化：反应液上Qiagen Cartridge柱子；用1×上样缓冲液悬浮；1000rmp离心1min，用硅化玻璃棉过滤；用1×上样缓冲 液、0.5M NaCL溶液和80%乙醇依次冲洗；用20ul PE洗脱液洗脱；真空干燥，即可。 t
b、以步骤a得到的初始合成砌块为基础，用三步线性组合反应的方式合成化合物，合成过程中，每加入新的合成砌块，就在与初始合成砌块相连的单链DNA游离端串联连接所加入合成砌块的特异标记序列，使所述单链DNA逐渐延长，合成结束后，在所述单链DNA游离端串联连接末端序列，即得到单链DNA标记的化合物文库；
第一批合成砌块，即初始砌块（1个）：合成砌块1；
第二批合成砌块（5个）：合成砌块2~6；
第三批合成砌块（49个）：合成砌块7~55；
I： t
①合成 t
取合成砌块2~6，分别置于5个微型反应容器中，与步骤a制得的初始合成砌块混合，按照混合裂分法、平行合成法、多组分液相合成法或者官能团转化法合成。 t
分别置于5个微型反应容器中，与步骤a制得的初始合成砌块反应。以合成砌块2为例，反应条件为150微升反应混合物，溶剂为水和二甲亚砜体积比为3:7，其中含三乙胺盐酸缓冲体系（pH9.0，80mM），合成砌块1的浓度为30mM，活化试剂1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）4mM，2-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺10mM,合成砌块2的浓度1.5M，室温反应15小时。 t
②分别加合成砌块2~6的标记序列：同步骤a步骤②。 t
③混合，得混合物。 t
Ⅱ： t
①合成 t
取合成砌块7~55，分别置于49个微型反应容器中，与步骤a制得的初始合成砌块混合，按照混合裂分法、平行合成法、多组分液相合成法或者官能团转化法合成。 t
分别置于49个微型反应容器中，与步骤a制得的初始合成砌块反应。以合成砌块2为例，反应条件为150微升反应混合物，溶剂为水和二甲亚砜体积比为3:7，其中含三乙胺盐酸缓冲体系（pH9.0，80mM），合成砌块1的浓度为30mM，活化试剂1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）4mM，2-磺酸基-N-羟基琥珀酰亚胺10mM,合成砌块2的浓度1.5M，室温反应15小时。 t
②加标记序列：同步骤a步骤②。 t
③加末端序列：同步骤a步骤②。 t
④混合，即得到单链DNA标记的化合物的文库。 t
（3）筛选：对DNA标记的化合物的文库进行筛选： t
基于受体-配体特异性反应的色谱分离筛选方法，用生物靶分子对DNA标记的化合物的文库进行筛选。 t
①CNBr树脂活化： t
1）0.1033克CBNr活化Sepharose4B树脂，并把它们分为2支，然后在4ml的1mM的氯化氢溶液（PH3.0）里静止； t
2）用1mM的盐酸（pH值3.0）清洗液清洗15分钟； t
3）将4mg的胰蛋白酶溶解在0.5毫升的偶联缓冲液（0.1M碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH值8.3）中； t
4）轻微上下震荡混合物1小时，在室温或4℃过夜孵育； t
5）用4ML耦合溶液洗去多余的蛋白质； t
6）将树脂转入4mL0.1M的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中，孵育2小时； t
7）用清洗缓冲液1和2清洗树脂三次；（清洗液1:0.1M acetic acid,0.5MNaCl,pH4.0;，清洗液2:0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0.） t
8）离心分离树脂，6000r/min，10min。 t
②胰蛋白酶在活化CNBr树脂上的固化 t
1）称取100毫克活化的CNBr树脂至于4毫升1mM的盐酸中孵育； t
2）用8mL的1mM盐酸（PH值3.0）清洗； t
3）将0.004mg/ml,0.02mg/ml,0.1mg/ml,0.5mg/ml,2.5mg/ml的胰蛋白酶溶液分别与五份活化CNBr树脂混合，在4℃下孵育5小时； t
4）用0.1M Tris盐酸，0.5M氯化钠，（pH值8.3）溶液清洗树脂； t
5）用0.1M醋酸钠，0.5M氯化钠，（pH4.0）溶液清洗树脂； t
6）重复4,5步骤，交替清洗至少3个循环。 t
7）将胰蛋白酶固化的树脂在4℃下保存在PBS缓冲液中（pH7.4）； t
③胰蛋白酶化合物库亲和筛选 t
1）取的步骤（2）得到的单链DNA标记的化合物的文库与PBS缓冲液以1:15体积比混合（17uL：255uL）； t
2）分别将50μL的文库样品加入胰腺牛胰蛋白酶/CNBr树脂浆（2.5，0.5，0.1，0.02，0.004和0mg/mL）； t
3）用PBS缓冲液配制0.3毫克/毫升的鲱鱼精DNA溶液； t
4）步骤3）得到的鲱鱼精DNA溶液与步骤2）得到的胰腺牛胰蛋白酶/CNBr树脂浆在25℃下孵育1小时； t
5）将步骤4）的混合物转移到2ml的Spin柱子中，除去上清液； t
6）用200μL PBS缓冲液洗涤树脂，重复4次； t
7）在清洗后的浆液中加入100μL无菌水，筛选得到与胰蛋白酶配体样品。 t
鉴定：取步骤（2）得到的单链DNA标记的化合物文库与步骤（3）筛选得到的胰蛋白酶亲和样品电泳检测。 t
检测结果如图2所示，用胰腺牛胰蛋白酶/CNBr树脂浆筛选均得到一目标条带，阴性对照则为空白条带，说明本发明筛选得到了纯化的胰蛋白酶配体样品。 t
（4）测序： t
取步骤（3）筛选得到的DNA标记的化合物，对DNA标记的化合物上的DNA测序，根据DNA序列即可确定该化合物的合成砌块和反应历程： t
取步骤（3）筛选得到的样品进行聚合酶链接反应（PCR），将编码化合物的寡核苷酸代码进行PCR扩增（总体积50微升，30个循环，每个循环94℃1分钟，55℃反应1分钟，72℃反应40秒），以5μL胰蛋白酶245库（浓度100fM）为模板。 t
采用Illumina Hiseq2000高通量测序平台，测序流程如下： t
1）PCR扩增后的筛选寡核苷酸文库，利用Axygen公司的MAG-PCR-CL-250试剂盒进行纯化及质量检测报告； t
2）利用Illumina公司的Picogreen试剂盒进行核酸定量，得出样品核酸浓度，进行下一步测序文库制备； t
3）利用Illumina公司的chip-seq DNA sample试剂盒将Hiseq2000特定测序接头（6个碱基长度）接在测序样本的5‘端和3’端，再固定到Hiseq2000测序仪的芯片chip-seq plate上面，进行下一步桥式扩增； t
4）利用Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂盒进行核酸样本桥式扩增，在每个chip-seq lane上面得到足够测序使用的核酸簇（cluster）； t
5）利用Hiseq2000的laser imaging系统，Truseq SB S Kit v3-HS(200cycles)的带标签dNTP，记录从测序接头开始读取的每个碱基出现顺序及频次，测试核酸样本碱基； t
6）下机取出数据，数据处理。 t
测序结果如图3所示，序列如SEQ ID NO.1所示： t
TCAGGCAGAGGCGATAGAGGCGATAGA，结合表2可以确定筛选得到的胰蛋白酶配体的结构如下： t
根据该结构式，合成该化合物后进行检测，检测确定该化合物为胰蛋白酶抑制剂，其抑酶活性如图4~5所示，IC50为8.1±2.1nM，说明筛选得到的化合物确实为胰蛋白酶配体。 t
实验结果说明，本发明构建了一个含有245个化合物的化学文库，并筛选得到了一个胰蛋白酶配体，其具有抑制胰蛋白酶的活性，说明本发明方法可以有效合成并筛选先导化合物。 t
实施例3本发明先导化合物的合成和筛选试剂盒 t
1、本发明试剂盒的组成（N个合成砌块的合成用量） t
1）i种合成砌块与i+2种单链DNA片段，将单链DNA片段分为始端序列、末端序列和i种标记序列，i种标记序列分别特意标记i种合成砌块，其中，i=1，2，3…n； t
表3合成砌块和不同序列的单链DNA片段 t
2）始端序列与合成砌块连接用试剂、组合化学方法合成用试剂和单链DNA片段连接用试剂； t
表4始端序列与合成砌块连接用试剂 t
表5组合化学方法合成用试剂 t
表6DNA片段连接用试剂 t
3）化合物筛选用试剂； t
表7化合物筛选用试剂 t
[0189]
4）DNA测序用试剂。 t
表8DNA测序用试剂 t
本发明试剂盒按照本发明实施例1提供的方法使用，可用于先导化合物的快速合成和筛选。 t
综上，与现有技术用双链DNA标记合成砌块相比，本发明用单链DNA标记合成砌块，连接过程中单链DNA不会互补，不易交联，结构稳定，单链DNA的PCR扩增以及测序较双链DNA更为方便、快速。因此，本发明方法可以包含多步线性组合反应，合成的化合物文库多样性好，库容大，容易合成得到目标化合物，通过测序即可确定其合成砌块、反应历程及化学结构，准确高效、操作简便、成本低廉，具有良好的应用前景。 t
