一种用于微阵列生物芯片的载体、其制备方法及微阵列生物芯片
技术领域tt
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种微阵列生物芯片的载体、tt其制备方法及微阵列生物芯片。tt
背景技术tt
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融tt微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，tt具有重大的基础研究价值及明显的产业化前景。该技术可将大量探针同时固tt载于支持物上，依次可以对大量的生物分子进行检测分析，从而弥补传统核tt酸印记杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子量少、低通量等不足。tt生物芯片技术以其高通量、大规模和集成的特点被广泛用于分子生物学水平tt上的生理及病理现象的探讨以及疾病发生的机理、疾病的诊断和预后等研究。tt此外，生物芯片技术还可应用于疫苗和新药的研制和开发。tt
生物芯片是将大量生物分子按预先设计的排列固载于一种载体表面，利tt用生物分子的特异性亲和反应，来分析各种生物分子存在的量的一种技术。tt生物芯片的研制和分析的前提条件是生物芯片的制备，而制备生物芯片的关tt键技术是如何制备其载体材料。高分子材料因其能够快速成型而得到了重点tt关注。各种具有不同性质的高分子材料，特别是热塑性高分子成为实用、通tt用且廉价的新型芯片基底材料。tt
然而，高分子聚合物材料的表面具有两个明显的缺点：一是化学惰性，tt缺少用于固载生物分子的通用功能化基团；二是高度疏水，难以在微流管道tt中进行液体注射和流动控制。因此，制作芯片时要对聚合物基底材料进行表tt面活化修饰，如光接枝、臭氧处理、等离子活化和化学碱处理等。现有技术tt针对不同的高分子材料采取不同的方法进行活化修饰，缺少通用的功能化方tt法成为阻碍高分子材料在生物芯片领域广泛应用的一个主要瓶颈。tt
发明内容tt
本发明的目的在于提供一种用于微阵列生物芯片的载体、其制备方法及tt微阵列生物芯片，本发明提供的用于微阵列生物芯片的载体具有通用的功能tt基团，可采用通用的活化方法对载体表面进行活化处理。tt
本发明提供了一种用于微阵列生物芯片的载体，包括聚合物基底和设置tttttt在所述聚合物基底上的多块二氧化硅膜；tt
所述多块二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈阵列分布。tt
优选的，相邻二氧化硅膜之间的垂直距离为50μm～200μm。tt
优选的，单块二氧化硅膜为圆形；tt
所述单块二氧化硅膜的直径为10μm～300μm。tt
优选的，所述聚合物基底的材质为热塑性聚合物。tt
优选的，所述聚合物基底的材质为环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或tt聚碳酸酯。tt
本发明提供了上述技术方案所述用于微阵列生物芯片的载体的制备方tt法，包括以下步骤：tt
采用光刻方法，在聚合物基底表面覆加多块掩膜，所述多块掩膜在所述tt聚合物基底表面呈阵列分布；tt
在所述覆加掩膜后的聚合物基底上物理气相沉积二氧化硅膜，得到载体tt前体；tt
剥离所述载体前体上的掩膜，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
优选的，所述物理气相沉积包括直流磁控溅射、射频磁控溅射、离子溅tt射或电子束蒸发。tt
优选的，所述掩膜在所述聚合物基底表面呈阵列分布；tt
相邻掩膜之间的垂直距离为10μm～300μm。tt
优选的，所述物理气相沉积的时间为2min～6min。tt
本发明提供了一种微阵列生物芯片，包括载体和固载在所述载体上的生tt物信息分子；tt
所述载体为上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述制备方法得到tt的载体。tt
本发明提供了一种用于微阵列生物芯片的载体，包括聚合物基底和设置tt在所述聚合物基底上的多块二氧化硅膜；所述多块二氧化硅膜在所述聚合物tt基底上呈阵列分布。本发明提供的载体，以聚合物材料为基底，在聚合物基tt底上设置呈阵列分布的多个二氧化硅膜，从而使得聚合物材料载体的表面能tt够采用通用的活化方法处理，如本发明实施例用到的硅烷化处理，避免了聚tt合物材料载体活化处理的个体差异性，简化了载体表面活化处理。而且，本tttttt发明提供的载体表面具有良好的反应活性，方便进行进一步的功能化修饰和tt生物信息分子的固载。tt
本发明提供的制备用于微阵列生物芯片载体的制备方法，采用光刻的方tt法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通过物tt理气相沉积的方法沉积二氧化硅膜；剥离掩膜后，得到载体。本发明提供的tt制备方法工艺简单，且显著提高了芯片形状和结构的多样性。tt
附图说明tt
图1为本发明实施例提供的微阵列生物芯片的制作流程示意图；tt
图2为本发明实施例1得到的微阵列生物芯片位点阵列的扫描电镜图片；tt
图3为本发明实施例3聚合物基底沉积二氧化硅前后的光电子能谱图；tt
图4为本发明实施例4得到的微阵列生物芯片进行生物分子检测的荧光tt分析结果；tt
图5为本发明实施例7得到的微阵列生物芯片进行寡核苷酸库合成的产tt物表征结果。tt
具体实施方式tt
本发明提供了一种用于微阵列生物芯片的载体，包括聚合物基底和设置tt在所述聚合物基底上的二氧化硅膜；tt
所述二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈阵列分布。tt
本发明提供的用于微阵列生物芯片的载体，包括聚合物基底和呈阵列设tt置在所述聚合物基底上的二氧化硅膜，本发明提供的载体活化特异性较弱，tt可以采用通用的活化方法对其表面进行活化，无需再根据聚合物种类的不同tt采用不同的活化方式；本发明提供的载体既能够保证其表面具有良好的化学tt反应活性，方便进行进一步的功能化修饰，利于生物信息分子的固载；又能tt够大幅降低成本，显著提高了芯片形状和结构的多样性。tt
本发明提供的用于微阵列生物芯片的载体包括聚合物基底。本发明对所tt述聚合物基底的材质、大小、形状没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟tt知的能够用作微阵列生物芯片载体的聚合物即可，而且，本领域技术人员可tt根据需要，设置合适大小和形状的聚合物基底。在本发明中，所述聚合物基tt底可以为长方形、正方形或圆形。在本发明中，所述聚合物基底的材质包括tt但不限于热塑性聚合物，具体的，在本发明的实施例中，所述聚合物基底的tt材质优选为环烯烃共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯；在本发明中，所tttttt述环烯烃共聚物可以为Topas 6015；所述聚甲基丙烯酸甲酯的重均分子量优选tt为25000～200000；所述聚碳酸酯的重均分子量优选为10000～70000。tt
在本发明中，所述聚合物基底的厚度优选为1.0mm～3.0mm，具体的，所tt述聚合物基底的厚度可以为1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm或3.0mm。tt
本发明对获取所述聚合物基底的方式没有特殊的限制，本领域技术人员tt可根据需要将聚合物材料经模压、注塑和裁剪，得到合适形状和大小的基底。tt本发明对所述模压和注塑的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知tt的聚合物的模压和注塑的技术方案即可。tt
本发明提供的用于微阵列生物芯片的载体包括设置在所述聚合物基底上tt的二氧化硅膜，所述二氧化硅膜在所述聚合物基底上呈阵列分布。本发明对tt所述阵列的具体方式没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的生物芯片tt中的阵列分布形式即可，如可以为点阵列分布，还可以为矩形阵列分布，也tt可以为圆形阵列分布。在本发明中，相邻二氧化硅膜之间的垂直距离优选为tt50μm～200μm，具体的可以为50μm、100μm或200μm。本发明对所述二氧tt化硅膜的形状没有特殊的限制，可以为本领域技术人员熟知的任意形状，如tt可以为圆形，也可以为矩形，还可以为三角形；当所述二氧化硅膜的形状为tt圆形时，单块二氧化硅膜的直径优选为10μm～300μm，更优选为50μm～200ttμm，具体的，在本发明的实施例中，单块二氧化硅膜的直径可以为50μm、tt100μm或200μm。在本发明中，同一聚合物基底上的二氧化硅膜的大小、形tt状可以相同，也可以不同，本发明对此没有特殊的限制。在本发明中，所述tt二氧化硅膜的厚度优选为40nm～5μm，更优选为300nm。tt
在本发明中，所述二氧化硅膜优选在聚合物基底表面通过物理气相沉积tt的方法得到。本发明优选将原料二氧化硅通过物理气相沉积的方法，在聚合tt物基底表面沉积，形成二氧化硅膜，且所述二氧化硅膜在所述聚合物基底表tt面呈阵列分布，从而得到用于微阵列生物芯片的载体。在本发明中，所述物tt理气相沉积的方法包括直流磁控溅射、射频磁控溅射、离子溅射或电子束蒸tt发。本发明对上述物理气相沉积所用到的设备以及设备的使用方法没有特殊tt的限制，采用本领域技术人员熟知的直流磁控溅射、射频磁控溅射、离子溅tt射或电子束蒸发的设备即可。本发明通过控制物理气相沉积的时间来控制聚tt合物基底表面二氧化硅膜的厚度，在本发明中，所述物理气相沉积的时间优tt选为2min～6min，更优选为1.5min～5min。tt
具体的，当采用射频磁控溅射方法，在聚合物基底表面沉积二氧化硅膜tt时，本发明将所述聚合物基底固载在射频磁控溅射系统中靶子顶端的固载器tt上，固载器匀速转动，从而使得在聚合物基底表面均匀沉积二氧化硅膜；舱tt室的真空度降至10-3Pa后，打开气阀充入高纯氩气和氧气的混合气体，使气tt压达到1.0Pa后稳定；在本发明中，所述射频磁控溅射中射频的能量优选为tt300W；提高所述射频能力到300W的速率优选为10W/min；所述射频的能tt力提高到300W后开始进行溅射，所述溅射的时间优选3min。tt
当采用离子溅射的方法，在聚合物基底表面沉积二氧化硅膜时，具体的，tt本发明可采用真空离子溅射镀膜机进行沉积，所述离子溅射仪的工作距离优tt选为50mm，所述离子溅射仪工作的真空度优选为5Pa，所述离子溅射仪的tt工作电流优选为20mA，所述离子溅射的时间优选为2.5min。tt
当采用电子束蒸发沉积的方法，在聚合物基底表面沉积二氧化硅膜时，tt具体的，本发明可采用真空光学(电子枪)镀膜机进行沉积，在本发明中，tt所述电子枪的加速电压优选为6kV，所述电子枪的束流优选为40mA～50mA，tt所述电子束蒸发沉积的时间优选为5min。tt
本发明提供了上述技术方案所述用于微阵列生物芯片的载体的制备方tt法，包括以下步骤：tt
采用光刻方法，在聚合物基底表面覆加多块掩膜，所述多块掩膜在所述tt聚合物基底表面呈阵列分布；tt
在所述覆加掩膜后的聚合物基底上物理气相沉积二氧化硅膜，得到载体tt前体；tt
剥离所述载体前体上的掩膜，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明优选先对聚合物材料进行模压、注塑和裁剪，得到合适大小和形tt状的聚合物材料。在本发明中，所述聚合物基底的材质、大小、形状与上述tt技术方案所述聚合物基底一致，在此不再赘述。tt
本发明得到合适大小和形状的聚合物基底后，本发明优选清洗所述聚合tt基底，去除聚合物基底表面的无机杂质和有机杂质。本发明对所述清洗聚合tt物基底用到的试剂和清洗方法没有特殊的限制，本领域技术人员可根据聚合tt物基底的材质以及其表面可能存在的杂质种类，选择合适的清洗方法。如当tt所述聚合物基底的材质为环烯烃共聚物时，本发明优选采用氨水、双氧水和tt水的混合溶液对所述聚合物基底进行清洗；在本发明中，所述氨水的质量浓tttttt度优选为15％～30％，更优选为18％～25％；所述双氧水的质量浓度优选为tt20％～35％，更优选为25％～30％；所述氨水、双氧水和水的体积比优选为1:1:5；tt在本发明中，对环烯烃共聚物基底清洗的温度优选为70℃～90℃，更优选为tt75℃～85℃，最优选为80℃，对所述环烯烃共聚物基底清洗的时间优选为10ttmin～20min，更优选为13min～18min，最优选为15min。tt
当所述聚合物基底的材质为聚甲基丙烯酸甲酯时，本发明优选将所述聚tt合物基底用乙醇和去离子水进行超声波清洗，具体的，用乙醇进行超声波清tt洗聚甲基丙烯酸甲酯基底的时间优选为5min～10min，用去离子水进行超声波tt清洗聚甲基丙烯酸甲酯基底的时间优选为5min～10min。本发明对所述超声波tt清洗的条件，如超声频率、温度等没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟tt知的超声波清洗的技术方案即可。tt
当所述聚合物基底的材质为聚碳酸酯时，本发明优选将所述聚合物基底tt用乙醇和去离子水进行超声波清洗，具体的，用乙醇进行超声波清洗聚碳酸tt酯基底的时间优选为5min～10min，用去离子水进行超声波清洗聚碳酸酯基底tt的时间优选为5min～10min。本发明对所述超声波清洗的条件，如超声频率、tt温度等没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的超声波清洗的技术方案tt即可。tt
完成对聚合物基底的清洗后，本发明优选将所述清洗后的聚合物基底干tt燥。本发明优选采用氮气流将清洗后的聚合物基底吹干，再进行真空干燥。tt在本发明中，所述真空干燥的温度优选为80℃～110℃；所述真空干燥的时间tt优选为0.5h～1h。本领域技术人员可根据聚合物基底的材质，控制真空干燥tt的温度和时间，以将所述清洗后的聚合物基底完全干燥即可。tt
完成所述聚合物基底的干燥后，本发明采用光刻的方法，在所述干燥后tt的聚合物基底表面覆加多块掩膜，所述多块掩膜在所述聚合物基底表面呈阵tt列分布。在本发明中，在所述聚合物基底上覆加多块掩膜的过程优选具体为：tt
在所述干燥后的聚合物基底表面涂覆正性光刻胶；tt
干燥后，将涂覆有正性光刻胶的聚合物基底进行光刻；tt
将完成光刻的聚合物基底进行显影。tt
本发明采用光刻的方法，在所述聚合物基底的表面覆加掩膜。本发明首tt先在所述干燥后的聚合物基底表面涂覆正性光刻胶。本发明对所述涂覆光刻tt胶的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的涂覆的技术方案即可，tttttt如可以为旋涂；本发明对所述正性光刻胶的种类和来源没有特殊的限制，采tt用本领域技术人员熟知的正性光刻胶的市售商品即可，如可以采用美国ttMicroChem公司出售的正性光刻胶Shipley 1813。在本发明中，所述旋涂的旋tt转速率优选为3000rpm～5000rpm，更优选为3500rpm～4500rpm，最优选为tt4000rpm；所述旋涂的时间优选为20s～40s，更优选为25s～35s，最优选为tt30s。tt
完成所述正性光刻胶的涂覆后，本发明优选将涂覆有正性光刻胶的聚合tt物基底进行干燥。在本发明中，所述干燥的温度优选为80℃～90℃，更优选为tt85℃；所述干燥的时间优选为1min～3min，更优选为2min；tt
完成对所述涂覆有正性光刻胶的聚合物基底的干燥后，本发明优选将干tt燥后的聚合物基底进行光刻。本发明通过光刻，使得所述聚合物基底表面的tt正性光刻胶呈阵列分布，从而在剥离掩膜后得到呈阵列分布的二氧化硅膜。tt本发明对所述光刻的设备和方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知tt的光刻机即可，如可以采用德国Karl Suss公司出售的Karl-Suss光刻机。本领tt域技术人员可根据需要的二氧化硅膜的大小、形状和分布方式，对涂覆有正tt性光刻胶的聚合物基底表面进行光刻。tt
完成所述光刻后，本发明将完成光刻的聚合物基底进行显影，完成对所tt述聚合物基底表面掩膜的覆加。本发明对所述显影的方法没有特殊的限制，tt采用本领域技术人员熟知的显影的技术方案即可，采用与上述正性光刻胶相tt对应的显影剂进行显影即可。具体的，在本发明的实施例中，所述显影剂可tt以为美国MicroChem公司出售的MF 319显影剂。tt
完成对所述聚合物基底表面覆加掩膜后，本发明在所述覆加掩膜后的聚tt合物基底表面物理气相沉积上二氧化硅膜，得到载体前体。在本发明中，所tt述物理气相沉积二氧化硅膜的技术方案与上述技术方案所述物理气相沉积的tt技术方案一致，在此不再赘述。tt
得到载体前体后，本发明剥离所述载体前体上的掩膜，得到用于微阵列tt生物芯片的载体。将所述载体前体上的掩膜剥离后，沉积在所述掩膜上的二tt氧化硅膜也随之一并剥离，从而使得遗留在聚合物基底上的二氧化硅膜呈阵tt列分布，得到用于微阵列生物芯片的载体。本发明优选将所述载体前体依次tt在丙酮和乙醇中超声清洗，再在硫酸和过氧化氢的混合溶液中浸泡，完成掩tt膜的剥离，得到载体。tt
在本发明中，所述载体前体在丙酮中超声清洗的时间优选为5min～10ttmin；所述载体前体在乙醇中超声清洗的时间优选为5min～10min。本发明对tt所述超声的参数，如超声的频率、温度等没有特殊的限制，采用本领域技术tt人员熟知的超声清洗的参数即可。tt
在本发明中，所述硫酸的质量浓度优选为96％～97％；所述硫酸与过氧化tt氢的体积比优选为1:1；所述载体前体在硫酸和过氧化氢的混合溶液中浸泡的tt时间优选为10min～20min，更优选为15min。tt
完成对所述载体前体上掩膜的剥离后，本发明优选将剥离掩膜后的载体tt前体用去离子水冲洗并吹干，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明提供的方法，通过物理气相沉积的方法，在聚合物基底的表面沉tt积上呈阵列分布的二氧化硅膜，简化了微阵列生物芯片载体的制作工艺；而tt且沉积上二氧化硅膜后，载体表面具有良好的化学反应活性，有利于进一步tt的功能化修饰；而且，与现有技术相比，减弱了聚合物载体表面活化方法的tt特异性。对于本发明提供的载体来说，采用通用的表面硅烷化，就能够完成tt对载体表面的活化。tt
本发明提供的载体，通过表面硅烷化处理即可完成对载体表面的活化，tt反应条件温和，不会破坏聚合物基底表面，使得载体在使用中稳定、不易降tt解或退化；也不会由于载体表面游离单体的消耗阻塞微流管道。tt
参见图1，图1为本发明实施例提供的微阵列生物芯片的制作流程示意图，tt如图1所示，采用光刻法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的tt聚合物基底上沉积二氧化硅膜；剥离掩膜后得到用于微阵列生物芯片的载体；tt该载体表面可以用通用的活化方法进行进一步功能化，如硅烷化处理，使得tt载体表面富有硅羟基。tt
本发明还提供了一种微阵列生物芯片，包括载体和固载在所述载体上的tt生物信息分子；tt
所述载体为上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述制备方法得到tt的载体。tt
本发明对所述生物信息分子的种类没有特殊的限制，采用本领域技术人tt员熟知的生物芯片技术领域的生物探针即可，如可以DNA、RNA、多肽、蛋tt白质等。tt
在本发明中，所述载体在固载生物信息分子前，优选进行活化。在本发tttttt明中，所述活化优选具体为：对载体表面进行硅烷化处理。在对本发明提供tt的载体进行活化时，采用通用的硅烷化处理即可，无需再根据聚合物材质的tt不同，进行不同的活化处理，简化了活化方法。本发明对所述硅烷化处理的tt方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的硅烷化处理的技术方案即tt可。具体的，本发明优选将载体置于硅烷化试剂的溶液中，浸泡，完成对载tt体表面的硅烷化处理。在本发明中所述硅烷化试剂优选为3-氨基丙基三乙氧tt基硅烷或N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基-丁酰胺；所述硅烷化试剂的tt溶液中的溶剂优选为醇类溶剂的水溶液，更优选为甲醇水溶液或乙醇水溶液；tt在本发明中，所述醇类溶剂的水溶液的体积浓度优选为95％；所述硅烷化试tt剂溶液的体积浓度优选为1％～2％。在本发明中，所述浸泡的时间优选为12tth～18h，更优选为14h～16h，最优选为15h。tt
完成所述硅烷化处理后，本发明优选将表面硅烷化的载体进行清洗、干tt燥，完成对所述载体表面的活化。tt
本发明提供的生物芯片可用于生物检测和生物合成。本发明对所述生物tt检测和生物合成的技术方案没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的生tt物芯片在生物检测和生物合成中应用的技术方案即可。tt
本发明提供了一种用于微阵列生物芯片的载体，包括聚合物基底和设置tt在所述聚合物基底上的多块二氧化硅膜；所述多块二氧化硅膜在所述聚合物tt基底上呈阵列分布。本发明提供的载体，以聚合物材料为基底，在聚合物基tt底上设置呈阵列分布的多个二氧化硅膜，从而使得聚合物材料载体的表面能tt够采用通用的活化方法处理，如硅烷化处理，避免了聚合物材料载体活化处tt理的个体差异性，简化了载体表面活化处理。而且，本发明提供的载体表面tt具有良好的反应活性，方便进行进一步的功能化修饰。tt
本发明提供的制备用于微阵列生物芯片载体的制备方法，采用光刻的方tt法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通过物tt理气相沉积的方法沉积二氧化硅膜；剥离掩膜后，得到载体。本发明提供的tt制备方法工艺简单，且显著提高了芯片形状和结构的多样性。tt
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于微阵列生tt物芯片的载体、其制备方法及微阵列生物芯片进行详细地描述，但不能将它tt们理解为对本发明保护范围的限定。tt
在下述实施例中，所用试剂均为市售商品。实施例中使用的PBS-T溶液tttttt规格：0.1mol/L PBS+0.5％Tween 20，pH值＝7.4。tt
实施例1tt
(1)将环烯烃共聚物(购自美国Topas公司)经塑料热压成型机加工成tt76mm×26mm的长方形基底；tt
(2)采用体积比为1:1:5的NH4OH:H2O2:H2O混合溶液将步骤(1)得到tt的环烯烃共聚物基底于80℃下清洗15min。氮气流吹干基底后在110℃下真tt空干燥1小时；tt
(3)以4000rpm的速率旋转30s，将一薄层正性光刻胶Shipley 1813(购tt自美国MicroChem公司)旋涂到步骤(2)得到的基底上，于80℃下干燥2min。tt采用Karl-Suss光刻机(购自德国Karl Suss公司)进行光刻，经MF 319显影tt剂(购自美国MicroChem公司)显影；tt
(4)采用Kurt Lesker PVD 75射频磁控溅射系统(购自美国Kurt J.Leskertt公司)在步骤(3)得到的基底上沉积二氧化硅薄膜：将基底固定在靶子顶端tt的固定器上，固定器匀速转动以均匀沉积。舱室的真空度降至10-3Pa后，打tt开气阀充入高纯氩气和氧气的混合气体，使气压达到1.0Pa后稳定。以10ttW/min的速率逐渐提高射频能量到300W后开始溅射，溅射时间为3min；tt
(5)剥离掩膜：将步骤(4)得到的基底依次在丙酮和乙醇中超声清洗，tt在体积比为1:1的硫酸与过氧化氢混合溶液中浸泡15min，用去离子水冲洗并tt吹干，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明将得到的用于微阵列生物芯片的载体沉积二氧化硅膜前后表面进tt行光电子能谱表征。采用分析型axis ultra-X-ray光电子能谱仪(购自英国ttKratos Analytical Inc.公司)，AL KR X-射线单色光源辐射能量为1486.6eV，tt测定5次取平均值，通能为160eV，分辨率为1eV，驻留时间为200ms。C 1s、ttO 1s和Si 1p的高分辨率局部谱图的为10次扫描的平均值，通能为20eV，分tt辨率为1eV，驻留时间为200ms。结果显示，在沉积二氧化硅膜以前，得到tt的电子能谱图中出现了C(1s)峰和O(1s)峰，这是由于环烯烃共聚物为tt饱和烃；在沉积二氧化硅膜后，载体表面的电子能谱图中C(1s)峰峰高减弱，ttO(1s)峰峰高增强，并且出现了Si(2p)峰，这说明在环烯烃共聚物基底上tt实现了二氧化硅膜的沉积，得到的用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明对得到的用于微阵列生物芯片的载体表面进行扫描电镜表征，采tt用的扫描电镜型号为XL30(购自美国FEI公司)，标准结果如图2所示，图2tttttt为本发明实施例1得到的用于微阵列生物芯片的载体表面的扫描电镜图片，tt由图2可以看出，本实施例得到的载体中，二氧化硅膜在环烯烃共聚物基底tt上呈点阵列分布。tt
实施例2tt
(1)将聚碳酸酯(购自国药化学)经塑料热压成型机加工成76mm×26mmtt的长方形基底；tt
(2)依次用乙醇、去离子水超声波清洗步骤(1)得到的基底5min和tt10min，氮气流吹干基底后在80℃下真空干燥0.5小时；tt
(3)以4000rpm的速率旋转30s，将一薄层正性光刻胶Shipley 1813(购tt自美国MicroChem公司)旋涂到步骤(2)得到的基底上，于80℃下干燥2min。tt采用Karl-Suss光刻机(购自德国Karl Suss公司)进行光刻，经MF 319显影tt剂(购自美国MicroChem公司)显影；tt
(4)采用真空离子溅射镀膜机(Sputter Coating SCD005，购自芬兰ttBAL-TEC公司)在步骤(3)得到的基底上溅射沉积二氧化硅薄膜：离子溅tt射仪工作距离为50mm，真空度为5Pa，电流控制在20mA，溅射时间为150tts；tt
(5)剥离掩膜：将步骤(4)得到的基底依次在丙酮和乙醇中超声清洗，tt在体积比为1:1的硫酸与过氧化氢混合溶液中浸泡15min，用去离子水冲洗并tt吹干，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明采用实施例1的方法，对本实施例得到的用于微阵列生物芯片的tt载体沉积二氧化硅膜前后表面进行光电子能谱表征，结果显示，在沉积二氧tt化硅膜以前，得到的电子能谱图中出现了C(1s)峰和O(1s)峰，这是由tt于环烯烃共聚物为饱和烃；在沉积二氧化硅膜后，载体表面的电子能谱图中Ctt(1s)峰峰高减弱，O(1s)峰峰高增强，并且出现了Si(2p)峰，这说明在tt环烯烃共聚物基底上实现了二氧化硅膜的沉积，得到的用于微阵列生物芯片tt的载体。tt
本发明采用实施例1的方法，对得到的用于微阵列生物芯片的载体表面tt进行扫描电镜表征，结果显示，本实施例得到的载体中，二氧化硅膜在聚甲tt基丙烯酸甲酯基底上呈点阵列分布。tt
实施例3tt
(1)将聚碳酸酯(购自国药化学)经塑料热压成型机加工成76mm×26mmtttttt的长方形基底；tt
(2)依次用乙醇、去离子水超声波清洗步骤(1)得到的基底6min和9ttmin，氮气流吹干基底后在80℃下真空干燥0.5小时；tt
(3)以4000rpm的速率旋转30s，将一薄层正性光刻胶Shipley 1813(购tt自美国MicroChem公司)旋涂到步骤(2)得到的基底上，于80℃下干燥2min。tt采用Karl-Suss光刻机(购自德国Karl Suss公司)进行光刻，经MF 319显影tt剂(购自美国MicroChem公司)显影；tt
(4)采用VAKIA-OEC真空光学(电子枪)镀膜机(购自上海VAKIAtt公司)在步骤(3)得到的基底上进行二氧化硅膜的沉积：电子枪加速电压为tt6kV，束流为40mA～50mA，沉积时间为5min：tt
(5)剥离掩膜：将步骤(4)得到的基底依次在丙酮和乙醇中超声清洗，tt在体积比为1:1的硫酸与过氧化氢混合溶液中浸泡15min，用去离子水冲洗并tt吹干，得到用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明按照实施例1的方法，对本实施例得到的载体表面进行光电子能tt谱表征，结果如图3所示，图3为本发明实施例3得到的载体沉积二氧化硅tt膜前后的光电子能谱，其中图3A是载体沉积二氧化硅前的光电子能谱，由图tt3A可以看出，在284.5eV和529.5eV处有两个特征峰，分别归属C(1s)峰tt和O(1s)峰，这是由于所有高分子均为饱和烃；图3B为载体沉积二氧化硅tt膜后的光电子能谱，由图3B可以看出，C(1s)峰峰高减弱，O(1s)峰峰高tt增强，并且出现了Si(2p)峰，这说明在聚碳酸酯基底上实现了二氧化硅膜tt的沉积，得到的用于微阵列生物芯片的载体。tt
本发明按照实施例1的方法，对本实施例得到的载体表面进行扫描电镜tt表征，结果显示，本实施例得到的载体中，二氧化硅膜在聚甲基丙烯酸甲酯tt基底上呈点阵列分布。tt
实施例4～6tt
对芯片进行硅烷化：将3-氨基丙基三乙氧基硅烷(购自国药化学公司)tt溶于体积比为95:5的甲醇和去离子水的混合液中，得到浓度为1％(v/v)的tt3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液。将实施例1、2和3中所得到的用于微阵列生tt物芯片的载体置于此溶液中，室温下浸泡15小时；再用体积比为95:5的甲醇tt和去离子水的混合液清洗，通氮气干燥后，于100℃下烘干2小时；tt
生物素酰化：将磺基-生物素-NHS(购自Pierce Biotech)溶于1×PBS-Ttttttt溶液(0.1mol/L PBS+0.5％Tween 20，pH值＝7.4)中，得到1mg/mL的生物tt素溶液；用移液器将200μL此生物素溶液加到硅烷后的载体上，并加盖一块tt与载体聚合物基底相同材质的盖玻片，以确保液体能够覆盖住二氧化硅膜阵tt列沉积的整块表面区域，室温下在圆周振荡器上以40rpm摇动1小时。之后tt按以下次序充分清洗芯片：PBS-T洗三次，每次5分钟；PBS(50mM，pH＝7.4)tt洗5分钟和去离子水洗5分钟；tt
亲和素修饰：将亲和素(NeutrAvidin，1mL，购自Pierce Biotech)，用上tt述1×PBS-T溶液稀释至浓度为1mg/mL，用移液器将200μL得到的亲和素溶tt液加到已完成生物素酰化的载体上，在振荡器上于室温下以40rpm摇动1小tt时。如前所述方法，依次用PBS-T，PBS和去离子水清洗载体，然后将清洗tt后的载体浸于3％(w/v)Pluronic F108NF溶液(购自德国BASF公司)中10tt分钟，最后氮气吹干载体。tt
抗原固定：定制合成了生物素化的人白细胞介素-13抗原肽A(序列为ttVPPSTALRELIEELVNITQ，20mg，购自上海吉尔生化)，将该多肽溶于1×ttPBS-T得到浓度为为0.1mg/mL的溶液。用移液器将200μL上述多肽溶液加tt到覆有亲和素层的载体上，于4℃下孵育1小时，再按以下顺序清洗：PBS-Ttt溶液洗三次，每次洗5分钟，PBS洗5分钟。tt
抗体检测：从免疫了人白细胞介素-13抗原肽A的兔血清中获得了多克隆tt抗体，经Protein G亲和色谱柱(购自美国GE Healthcare公司)纯化、PBS溶tt液洗脱，通过滴定法确定浓度为0.1mg/mL；tt
取0.1μL上述多克隆抗体用PBS稀释到200μL与固定有抗原的微阵列生tt物芯片在定轨摇床上于室温下40rpm摇动孵育3小时，芯片上加盖盖玻片。tt用PBS-T洗三次，每次5分钟。将DyLight 549山羊抗兔IgG抗体(1.5mg，tt购自美国Vector Lab公司)用PBS-T稀释至0.3mg/mL,取200μL上述二抗tt溶液加到微阵列生物芯片上，其上加盖盖玻片，在摇床上于室温40rpm摇动tt1小时。按以下顺序清洗芯片：PBS-T(每次5分钟，洗三次)，PBS(5分tt钟)，之后在氮气流下干燥。tt
在Genepix 4000B微阵列生物芯片扫描仪(Molecular Devices)上对微阵tt列生物芯片进行扫描，测定波长为549nm，结果如图4所示，图4为本发明tt实施例4得到的微阵列生物芯片进行生物分子检测的荧光分析结果，由图4tt可以看出，通过光刻，在芯片表面形成了200μm、100μm和50μm三种不同tttttt直径的微点阵列，各微点上完成二氧化硅沉积、硅烷化后，连接上生物素修tt饰的抗原肽A，在抗体检测反应中，抗原肽A上首先结合上兔血清中的多克tt隆抗体，之后DyLight 549山羊抗兔IgG抗体又结合到多克隆抗体上，使连接tt了抗原肽A的位点在549nm光照下可观察到荧光。tt
实施例7tt
对载体进行硅烷化：将实施例1得到的载体置于2％(v/v)N-(3-三乙氧tt基甲硅烷基丙基)-4-羟基-丁酰胺(购自国药公司)溶液(溶剂为95％乙醇溶tt液)中，在氮气保护下搅拌过夜；浸于乙醇中超声30s清洗芯片后，于110tt℃下烘干3h；tt
原位合成寡核苷酸：基于经典的亚磷酰胺合成法，在微阵列生物芯片上tt合成寡核苷酸库，85％的寡核苷酸长度为32-mer，其余长度为36-mer，序列tt各不相同。以体积比为1:1的甲基戊二腈与3-甲氧基丙腈的混合物作为溶剂，tt每个合成循环包括：加入单体及活化剂(0.25M 5-乙硫基-1H-四唑的乙腈溶液)tt并反应2min、清洗2s、盖帽30s、清洗2s、氧化30s、清洗2s、脱保护10tts和清洗4s。除加入单体这一步以外，每步之后都用氮气吹干芯片。合成完tt毕，将芯片依次用乙腈和95％乙醇清洗。室温下置于体积比为1:1的无水乙二tt胺与无水乙醇混合液中浸泡2h，除去碱基保护基团。用去离子水洗5次、干tt燥；tt
染色：将芯片置于3％(w/v)Pluronic F108(购自美国BASF公司)溶液tt中封闭10min，吹干。将1μL of SYBR Gold(购自美国Invitrogen公司)染tt料溶于10mL TBE溶液中(购自上海生工)，得到染色液。将芯片置于染色液tt中15min，去除后用去离子水冲洗三次，每次5min，完成。tt
将染色后微阵列生物芯片在凝胶成像仪(购自美国Bio-Rad公司)上拍照，tt结果如图5A所示，图5A为本发明实施例7得到的微阵列生物芯片经SYBR ttGold染色后的照片，由图5A可以看出，微阵列生物芯片上各个微点均可观tt察到清晰稳定的荧光，这说明了各点上均实现了寡核苷酸的有效合成。tt
裂解及洗脱：将染色后的微阵列生物芯片置于可抽气的微型密封反应舱tt(购自美国Bio-Rad公司)内，加入300μL氨水，反应舱再被置于气动夹钳tt(购于美国biolytic Lab Performance公司)中，保持气压为80psi，室温下反tt应18小时。tt
从微阵列生物芯片上收集洗脱液，将洗脱液在真空离心机(购自德国ttttttEppendorf公司)上抽干，用超纯水重悬沉淀(来自三块芯片的沉淀用5μLtt水重悬)。tt
本发明将裂解并洗脱下来的沉淀进行电泳检测，泳道M为10bp分子量tt标准物，泳道Sample为所合成的寡核苷酸产物，结果如图5B所示，图5B为tt本发明实施例7得到的从微阵列生物芯片上裂解并洗脱下来的寡核苷酸的电tt泳结果，由图5B中可以看到两条条带，下方条带指示分子量为32-mer的产tt物，约占总质量的85％，上方条带指示为36-mer产物，约占总质量的15％，tt与预期相符。tt
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于微阵列生物芯片的载体，包tt括聚合物基底和设置在所述聚合物基底上的多块二氧化硅膜；所述多块二氧tt化硅膜在所述聚合物基底上呈阵列分布。本发明提供的载体，以聚合物材料tt为基底，在聚合物基底上设置呈阵列分布的多个二氧化硅膜，从而使得聚合tt物材料载体的表面能够采用通用的活化方法处理，如本发明实施例用到的硅tt烷化处理，避免了聚合物材料载体活化处理的个体差异性，简化了载体表面tt活化处理。而且，本发明提供的载体表面具有良好的反应活性，方便进行进tt一步的功能化修饰。tt
本发明提供的制备用于微阵列生物芯片载体的制备方法，采用光刻的方tt法，在聚合物基底表面覆加掩膜；再在覆加掩膜后的聚合物基底表面通过物tt理气相沉积的方法沉积二氧化硅膜；剥离掩膜后，得到载体。本发明提供的tt制备方法工艺简单，且显著提高了芯片形状和结构的多样性。tt
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普tt通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润tt饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。tt
