一种检测胆汁淤积性黄疸致病基因的DNA文库及其应用
技术领域
本发明涉及一种通过高通量测序技术检测胆汁淤积性黄疸致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据胆汁淤积性黄疸致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确胆汁淤积性黄疸的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术
胆汁淤积性黄疸是婴儿期常见的临床症状，其发生率约是活产新生儿的4/10000。引起婴儿胆汁淤积性黄疸的病因较多，预后悬殊，故早期诊断和治疗极为重要。研究显示超过25％的胆汁淤积性黄疸是由遗传缺陷造成的，许多遗传疾病的临床表型都包括婴幼儿时期的胆汁淤积性肝病。人们最初从α1抗胰蛋白酶缺乏性黄疸导致的新生儿胆汁淤积的研究中，逐渐认识到多种遗传疾病都会导致胆汁淤积。随着分子医学的发展，一系列的遗传因素引起的婴儿肝内胆汁淤积症性黄疸其相关基因突变在世界范围内被发现和认识，包括进行性家族性肝内胆汁淤积性黄疸(progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC)1型(定位于染色体18q21的ATP8B1基因突变)、2型(定位于染色体2q24的ABCB11基因突变)和3型(定位于染色体7q21.1的ABCB4基因突变)、Alagille综合征(定位于染色体20p12的JAG1基因突变)、Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁淤积症(neonatal intrahepaticcholestasis caused by Citrin defi-ciency，NICCD)(定位于染色体7q21.3的SLC25A13基因突变)、各种胆汁酸合成缺陷病(HSD3B7，AKR1D1，CYP7B1等基因突变)等。
现有的诊断技术，包括肝脏病理检查等可以结合临床特征对Alagille综合征等临床疾病进行确诊，但肝脏病理需要肝穿刺，属于创伤性检查；而PFIC1型及PFIC2型临床表型相似，药物治疗效果欠佳，部分胆汁转流术和(或)肝移植是治疗的选择之一。然而最新研究发现许多PFIC1型患者进行活体肝移植后，移植肝可出现严重肝脏病变，因此PFIC1型患者并不像PFIC2型患者那样适合肝脏移植。同时PFIC1型患者有可能发生耳聋，因此需要定期检查，了解有无听力障碍发生。但目前仅结合临床症状、生化及病理检测有时不能将两者很好区分；同时，基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。
因此，有必要寻求一种新的检测胆汁淤积性黄疸致病基因的方法，能避免创伤性检查、提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种包含60个遗传性病理性黄疸相关疾病的致病基因的DNA文库。其中60个基因如下：
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断胆汁淤积性黄疸相关疾病。
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断胆汁淤积性黄疸相关疾病。优选的，所述诊断装置是测序芯片。
进一步，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部60个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如通过基因检测鉴别诊断PFIC1型患者和PFIC2型患者，从而确定患者是否适合肝脏移植等治疗。
本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含60个遗传性病理性黄疸相关疾病的致病基因的DNA文库。
本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含60个遗传性病理性黄疸相关疾病的致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的DNA文库从Ion TorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部60个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如通过基因检测鉴别诊断PFIC1型患者和PFIC2型患者，从而确定患者是否适合肝脏移植等治疗。
采用本发明的DNA文库对胆汁淤积性黄疸患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：
1.可避免创伤性检查或治疗：Alagille综合征单凭临床特征以及肝脏病理检查也可以确诊，但肝脏病理需要肝穿刺。现在已知90％以上的Alagille综合征由JAG1基因突变引起。通过基因诊断，则患者可免受肝穿刺的痛苦；
2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案和针对性随访计划：PFIC1型及PFIC2型临床表型相似，结合生化和病理检测并不能将其区分。对于其治疗方案，之前认为部分胆汁转流术和(或)肝移植是治疗的选择之一。然而最新研究发现许多PFIC1型患者进行活体肝移植后，移植肝可出现严重肝脏病变，因此PFIC1型患者并不像PFIC2型患者那样适合肝脏移植。同时PFIC1型患者有可能发生耳聋，因此需要定期检查，了解有无听力障碍发生。通过本发明的DNA文库对患者进行检测后，可以将PFIC1型及PFIC2型患者进行鉴别诊断，从而进一步指导患者是否适合肝脏移植，并指导是否需要跟踪随访，定期检查听力；
3.本申请的DNA文库是申请人从众多的胆汁淤积性黄疸致病基因中选择的60个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测；
4.本发明的DNA文库能够检测常见的造成胆汁淤积性黄疸的遗传缺陷，包括进行性家族性肝内胆汁淤积症1型、2型和3型、Alagille综合征、Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁淤积症、各种胆汁酸合成缺陷病、半乳糖血症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、新生儿鱼鳞病及胆管炎、A/B型尼曼匹克病、关节弯曲肾功能障碍胆汁淤积、SMITH-LEMLI-OPITZ综合征、胆道闭锁、Dubin-Johnson综合征等多种导致胆汁淤积性肝病的遗传缺陷。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测超过15种胆汁淤积遗传缺陷；
5.本发明中采用基于Ion TorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的60个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到160人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到98.09％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；
6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因部分胆汁淤积性黄疸患儿面临肝硬化及死亡的风险，家长非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患儿基因确诊及父母基因验证了解父母遗传或新发突变可以为第二胎提供明确的遗传咨询服务。遗传性胆汁淤积性黄疸多数为常染色隐性遗传病，患儿兄弟姐妹有25％的发病和50％的携带致病突变可能性。对无症状兄弟姐妹进行致病基因检测不但有助于早期发现疾病、早期治疗，而且对家庭提供详尽的遗传咨询服务。
综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对胆汁淤积型黄疸具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1一次Ion TorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图
图2一次对60个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息
图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量
图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施方式
1.该方法中所用到的试剂：
Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0，Ion PGMTM Template OT2200Kit v3，Ion
2.标本采集和保存
(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。
3.检测步骤和结果分析：
(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。
(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的60个基因全外显子为检测区域，基于Ion AmpliSeqTM Designer自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下：
a.目标区域的扩增：
反应条件：
b.扩增产物二合一，酶切：
反应条件：
c.连接接头：
反应条件：
22℃ 30min
72℃ 10min
10℃ Up to 1h
d.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照Ion Ampliseq Library Preparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：
反应条件：
e.片段选择：片段选择步骤按照Ion Ampliseq Library Preparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit 2.0Fluorometer定量后即建库完成。
(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照Ion PGMTM Template OT2200Kit v3及Ion
a.油包水PCR反应：
将上述反应体系加入Ion OneTouch 2中进行油包水PCR反应。
b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的Ion PGM Template OT2200Ion SphereParticles经过Ion Onetouch ES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：
室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上Ion TorrentTM高通量测序进行测序。
(4)数据分析：测序数据经过coverage analysis和variant caller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过Ion Reporter在线注释后，得到对胆汁淤积疾病诊断有意义的突变位点。
(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。
结果说明及分析
通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对11个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为1.1G(Total Base)，能够总共得到6991649的片段数据(Total Reads)，每个片段的平均读长为165bp。11个标本平均能够被测到504521(397843-642953)个片段Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variantCaller分析，每个标本平均有160个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过Ion Reporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，图4箭头所指处分别显示c.640C＞Tp.G1n214X杂合突变以及c.1709_1710insAp.Ile570fs573X杂合突变，最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。
本发明的临床应用例证
利用本发明所提供的方法，对197名患有胆汁淤积性黄疸但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出进行性家族性肝内胆汁淤积症1型2例、2型4例、Alagille综合征13例、Citrin缺陷引起的新生儿肝内胆汁淤积症15例、胆汁酸合成缺陷病2例、半乳糖血症5例、Dubin-Johnson综合征6例。该方法对遗传性胆汁淤积性黄疸检出的总阳性率达到23.85％，结合临床生理生化检验及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度300×为例，所覆盖的98.09％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据197名受测患者的临床诊疗结果分析，未发现临床表型明显符合某一遗传性胆汁淤积性黄疸，而本方法未能给出阳性诊断的情况，即197名本方法的受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对胆汁淤积性肝病的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。
