一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及用途
技术领域tt
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种天然的双峰驼源噬菌体展tt示纳米抗体文库、构建方法及用途。tt
背景技术tt
从免疫文库筛选纳米抗体是获得纳米抗体最为广用的方法。由免疫过的骆驼产生的tt纳米抗体文库能够保持完整的多样性。尽管高亲和力的纳米抗体可以在短时间内筛选获tt得，但在某些情况下，无法实现骆驼免疫，例如免疫原具有高毒性、致病性或传染性，tt蛋白错误折叠形成包涵体而无法得到可溶性抗原，抗原自免疫性以及当抗原是不具有免tt疫性的小分子化合物等。tt
降钙素原(Procalcitonin，PCT)，是一种蛋白质，体内参考值为<0.5ug/L。当严重细tt菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免tt疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不tt会导致其升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。另外，PCT只是在少数患者的大tt型外科术后1～4d可以测到。PCT水平的升高出现在严重休克、全身性炎症反应综合征和tt多器官功能紊乱综合征，即使没有细菌感染或细菌性病灶。但是，在这些病例中PCT水tt平通常低于那些有细菌性病灶的患者。tt
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase associated lipocalin，ttNGAL)，是lipocalin家族的新成员，是脂质运载蛋白家族的一个新成员，它是肾功能损tt伤早期的生物标志物。NGAL是铁粒子鳌和/转运体，急性肾小管损伤早期表达。虽然结tt构尚不清，但被认为参与缺血再灌注损伤修复过程，可能与肾小管内皮再生有关。最近tt研究表明NGAL是肾损伤的敏感指标。对肾移植病人的研究表明尿中NGAL增加可预测tt移植肾功能恢复延迟，而且比血清肌酐增加的预测作用快近24小时。对心脏手术病人前tt瞻性研究发现术后1小时尿NGAL明显增加。研究表明NGAL可能与炎症反应、肿瘤发展、tt肾脏疾病有一定关系。tt
发明内容tt
本发明目的是提供一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库、构建方法及在筛tt选针对PCT和NAGL的纳米抗体方面的应用。tt
本发明采用以下技术方案：tt
本发明的第一方面，提供了一种天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，由以下tt制备步骤得到：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，提取总的mRNA，反转tt录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH；使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECStt噬菌体展示载体及VHH并连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构tt建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库。tt
优选地，所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，由以下制备步骤得到：采tt取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取100mL，另外取1只未经免疫任何tt抗原的双峰驼的脾脏，提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH；tt使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切96μg pMECS噬菌体展示载体及32μg VHH并tt连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体tt展示纳米抗体文库，其库容的大小为6.86×1011CFU/mL。tt
本发明第二方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法，tt操作步骤如下：采取未经免疫任何抗原的双峰驼的血样和脾脏，血样中分离淋巴细胞并tt碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾磨的脾脏中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式ttPCR扩增VHH；使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切pMECS噬菌体展示载体及VHHtt并连接两个片段；将连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌tt体展示纳米抗体文库。tt
优选地，所述的天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建方法，操作步骤如tt下：采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取100mL，另外取1只未经免tt疫任何抗原的双峰驼的脾脏，血样中分离淋巴细胞并碾磨脾脏，从淋巴细胞和碾磨的脾tt脏中提取总的mRNA，反转录成cDNA，利用套式PCR扩增VHH；使用限制性的内切tt酶Pst I及Not I酶切96μg pMECS噬菌体展示载体及32μg VHH并连接两个片段；将tt连接产物电转化至感受态细胞TG1中，构建天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库，tt其库容的大小为6.86×1011CFU/mL。tt
优选地，所述套式PCR扩增VHH其第一步PCR的正向引物如SEQ ID NO：1所tt示，反向引物如SEQ ID NO：2所示；其第二步PCR的正向引物1如SEQ ID NO：3tt所示，正向引物2如SEQ ID NO：4所示，反向引物如SEQ ID NO：5所示。tt
本发明第三方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展tttttt示方法筛选PCT或NGAL纳米抗体中的应用。tt
优选地，所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛选PCTtt或NGAL纳米抗体中的应用，其筛选出的PCT纳米抗体的VHH链其氨基酸序列如SEQ ttID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示；筛选出的NGAL纳米抗体的VHHtt链其氨基酸序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示或SEQ ID NO：tt12所示。tt
本发明第四方面，提供了所述天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库在噬菌体展tt示方法筛选出的PCT或NGAL纳米抗体在检测PCT或NGAL方面的应用。tt
本发明的有益效果：tt
本发明采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血清获取骆驼淋巴血细胞和另1只tt未经免疫任何抗原的双峰驼的脾脏，提取总的mRNA，从而建立天然的纳米抗体基因库。tt同时，试验中将PCT和NGAL分别偶联在酶标板上，以此形式的PCT和NGAL利用噬tt菌体展示技术筛选构建纳米抗体基因库，从而获得了针对PCT和NGAL特异性纳米抗tt体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。tt本发明构建的天然噬菌体展示文库能够筛选获得具有特异性和检测功能的纳米抗体，可tt以解决由于抗原因素造成无法免疫骆驼导致无法构建相应噬菌体展示文库而无法得到tt纳米抗体的问题，同时这样的文库也能解决免疫骆驼耗时较长的问题。这样的噬菌体展tt示文库的库容为6.86×1011CFU/mL，质量很好，多样性丰富，将作为纳米抗体获得的有tt力资源。tt
附图说明tt
图1是天然的纳米抗体文库构建的模式图。tt
图2是纳米抗体的基因电泳图。tt
图3是对所建文库的库容大小进行鉴定的梯度稀释涂板图。tt
图4是是对于所构建的文库进行插入率检测的菌落PCR电泳图。tt
图5是表达的针对PCT的纳米抗体。tt
图6是表达的针对NGAL的纳米抗体。tt
具体实施方式tt
实施例1：天然的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体文库的构建：tt
(1)采取20只未经免疫任何抗原的双峰驼的血样，每只取100mL，同时，杀死tttttt另1只未经免疫任何抗原的双峰驼，将其脾脏取下。从血样中分离淋巴细胞，同时将脾tt脏碾磨。再从淋巴细胞和碾磨的脾脏中提取总的mRNA。(2)合成cDNA并利用套式PCRtt扩增VHH,结果如图2显示。(3)使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切96μg pMECStt噬菌体展示载体(Biovector供应)及32μg VHH并连接两个片段。(5)将连接产物电tt转化至感受态细胞TG1(北京神州红叶科技有限公司)中，构建天然的双峰驼源噬菌体tt展示纳米抗体文库并测定库容，库容的大小为6.86×1011CFU/mL，图3显示当稀释倍数tt为108时，克隆数量约为98颗；与此同时，随机挑取24颗克隆，通过菌落PCR检测所tt建文库的插入率检测结果插入率为100％，图4显示菌落PCR结果。tt
利用套式PCR扩增VHH的具体条件如下：tt
第一步PCR程序：tt
第一步PCR的体系：tt
引物序列：tt
正向引物CALL001如SEQ ID NO：1所示：tt
5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′tt
反向引物CALL002如SEQ ID NO：2所示：tt
5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′tt
第二步PCR程序：tt
第一步PCR的体系：tt
引物序列：tt
正向引物1BACK-1如SEQ ID NO：3所示：tt
5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3′tt
正向引物2BACK-2如SEQ ID NO：4所示：tt
5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3′tt
反向引物PMCF如SEQ ID NO：5所示：tt
5’-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3′tt
实施例2：针对降钙素原PCT或中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL的纳tt米抗体的筛选过程：tt
(1)取200μL转化TG1细胞加入到100mL 2×TY培养基中，37℃培养3h。(2)tt加入40μL VCSM13辅助噬菌体，室温静置30min。(3)离心10min，将离心沉淀下来tt的细胞重悬接入250mL 2×TY培养基，37℃培养过夜；(4)将培养液8000rpm离心30min，tt取上清液，用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并将沉淀后的噬菌体溶解在PBS溶液中。tttttt(5)将溶解在100mM pH 8.2NaHCO3中的10μg PCT和10μg NGAL分别偶联在ttNUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(26)第二天各个孔中分别加入100ttμL 0.1％酪蛋白，室温封闭2h。(7)2h后，加入100μL收集的噬菌体(5×1011tfu天然tt的双峰驼源噬菌体展示纳米抗体基因库)，在室温下作用1h。(8)用PBST(PBS中含tt有0.05％Tween-20)洗5遍，洗去不结合的噬菌体。(9)用三乙基胺(100mM)将与ttPCT或NGAL特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，tt产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复4轮。在不断地筛选的过程中，tt阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中PCT或ttNGAL特异抗体的目的。tt
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：tt
(1)从上述4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于tt含有100ug/mL氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52gtt磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加入终tt浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜。(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移tt到经相应抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结合的抗体，tt加入一抗mouse anti-HA tag antibody(鼠源抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有tt限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline ttphosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，tt在室温下放置1h。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISAtt仪上，在405nm波长读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值2倍以上时，tt判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆接种至5mL含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体中tt以便提取质粒并进行测序。tt
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把互补决定区序列高度tt相似的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株。最终PCT纳米抗体共tt有3株抗体，其VHH链氨基酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：tt8所示；NGAL纳米抗体共有4株，其VHH链氨基酸序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：tt10、SEQ ID NO：11所示或SEQ ID NO：12所示。tt
实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：tt
(1)将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其tttttt涂布在含有100ug/mL的氨苄青霉素和2％葡萄糖LB固体培养基的板上，37℃过夜，(2)tt挑选单个菌落接种在15mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，(3)tt接种1mL的过夜菌种至330mL TB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6～tt1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，(4)第二天，离心收菌，(5)将菌体利用渗透法tt使菌体蛋白释放出来以获得抗体粗提液，(6)经镍柱亲和层析纯化抗体蛋白，7株纳米tt抗体的纯度均达90％。图5是表达的针对PCT的纳米抗体，图6是表达的针对NGALtt的纳米抗体。tt
实施例5：PCT纳米抗体或NGAL纳米抗体检测特异性分析tt
将PCT，NGAL分别用100mM NaHCO3(pH 8.2)透析后包被在酶标板上，同时直tt接加入100mM NaHCO3(pH 8.2)作为空白对照，各包被三个孔，将纳米抗体加入到包tt被有PCT或NGAL的孔和空白对照的孔中，在室温下放置1h。(3)用PBST洗去未结tt合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪tt生物科技有限公司)，在室温下放置1h。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗goatttanti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷tt科技有限公司)，在室温下放置1h。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶tt显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值，并计算平均值。结果显示PCTtt纳米抗体能特异性的识别PCT，NGAL纳米抗体能特异性的识别NGAL。结果如下：tt
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员tt来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也tt应视为本发明的保护范围。tt
