当前位置：首页 > 化学技术 > 组合技术> 幽门螺杆菌血清型分型方法及其生物芯片的构建方法独创技术24227字

幽门螺杆菌血清型分型方法及其生物芯片的构建方法

2021-03-13 09:03:00

幽门螺杆菌血清型分型方法及其生物芯片的构建方法

　　技术领域tt

　　本发明涉及一种细菌的血清学分型方法，特别涉及一种幽门螺杆菌血tt清型分型方法，本发明还涉及幽门螺杆菌生物芯片的构建方法。本发明属tt于生物技术领域。tt

　　背景技术tt

　　1983年，Warren和Marshall成功地从慢性胃炎患者胃粘膜活检组织中tt分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)。经进一步研究发现，Hp感tt染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃MALT淋巴瘤等疾病的发生密切相tt关，1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)又将幽门螺杆tt菌定为Ⅰ类致癌原。随着对Hp广泛深入研究，有的学者认为Hp感染还与tt过敏性紫癜、冠心病、糖尿病并发症、帕金森氏症和老年痴呆症等疾病的tt发病有关。因此，对幽门螺杆菌的诊断和积极治疗可有效降低上述疾病的tt发病率。tt

　　目前对于幽门螺杆菌的诊断多采用呼气试验，胃镜咬检组织进行幽门tt螺杆菌培养等方法。呼气试验只是简单定性；通过胃镜咬检组织做幽门螺tt杆菌培养虽是鉴定的金标准，但其培养条件高，培养技术难，同时对病人tt有一定的创伤，因此不易推行。如果利用血清诊断检测幽门螺杆菌，既可tt以弥补上述检测方法的不足，同时操作简单，准确性高，重复性强。tt

　　幽门螺杆菌的基因分型主要是基于两个毒素基因：细胞空泡毒素(vacA)tt和细胞毒素相关蛋白(cagA)。根据cagA把临床菌株分为cagA阳性和cagAtt阴性两种菌株。幽门螺杆菌vacA基因由s区和m区两部分组成，vacA基tt因的5’有s1和s2两种类型，其中s2型中含有12个氨基酸氨基末端疏水tt性片段，而sl型没有该片段，据此sl又可分为sla型和slb型。根据其中间tttttt区基因差异又可分为ml、mla、mlb、mlc、mlb-m2、m2a、m2b等类型。tt因而，这些等位基因理论上应该有多种基因组合(不同的s与m组合)，不tt同菌株可能有不同基因组合。随着对Hp菌株vacA基因分型工作的不断深tt入，vacA基因的遗传多态性及不同地区优势基因型的分布逐渐开始明朗，tt例如研究发现东欧和北欧是以sla型为主，北美以sla和slb型为主，二者tt比例接近；而在南美主要以slb/ml型为主；日本和韩国以sla-ml型为主，tt占90％以上；而在国内不同地区vacA基因型的分布也存在差异，例如西tt安地区以sla/ml居多，南京地区主要分布sla/ml和sla/m2型，湖北地tt区则以sla-m2型为主。由于不同基因组合的幽门螺杆菌毒力不同，致病能tt力不同，感染后的临床结果也不同，因此需要建立幽门螺杆菌区域毒力流tt行株。tt

　　目前幽门螺杆菌血清分型基于脂多糖的重复寡糖结构，分为O1-O6，tt见图1。和其他革兰阴性菌相比，幽门螺杆菌脂多糖结构比较独特，与哺tt乳动物组织和血型抗原的O型链的PS区域具有同源性。1998年,Ilver等用tt亲和标记技术找到了幽门螺杆菌体表面能够与Leb发生特异性结合的蛋白,tt将其命名为血型抗原结合粘附素(blood group antigen binding adhesion,ttBabA)。BabA是迄今为止发现的唯一确定特异性结合于血型抗原-Leb抗原tt的粘附素。Lewis血型抗原是一组可溶性抗原,它是在组织细胞(如消化道上tt皮细胞)上合成并分泌到血浆、分泌液等处，进一步通过血液循环粘附到红tt细胞表面而形成红细胞Lewis血型。Lewis血型抗原分为I型和II型,I型tt包括Lea、Leb，II型抗原包括Lex、Ley,是I型抗原的同分异构体。Lewistt及ABO血型的基因产物来自同一种前身物质H抗原。ABO血型物质的基tt础是Hh血型系统,H抗原是A抗原和B抗原的前身物质,然后由ABO基因tt决定产生相应的A抗原和B抗原,红细胞表面H抗原的控制基因是FUT1,tt但H抗原不是FUT1基因的直接产物,H抗原唯一依赖的是FUT1的直接产tt物-α(l,2)岩藻糖基转移酶(αl,2fucosyltransferase,αl,2FT),该酶负责将岩藻tt糖连接到糖链前身而形成H抗原。在此基础上,A、B基因的产物分别使N-tt乙酰半乳糖和D-半乳糖连接到H抗原的第一个半乳糖上,于是H抗原转变tttttt为A、B抗原；O型血的血型抗原即为H抗原。ABO血型抗原是在不同糖tt基转移酶作用下合成的寡聚糖分子,经典的观点认为这些寡聚糖分子是红tt细胞的多态抗原,仅表现在红细胞表面,而随后的深入研究表明:有些人的唾tt液或其它形式的分泌液中也可以检测出可溶性的HAB血型物质,称为分泌tt型(secretor),有些人则为非分泌型(nonsecretor)。tt

　　红细胞Lewis表型受ABH分泌状态影响,虽然Lewis基因和分泌基因tt是独立遗传的；遗传Le基因的人,如果为非分泌者(sese),则红细胞表型为ttLe(a+b-),如果为分泌者(Sese或seSe),则表型为Le(a-b+),SaraLinde等提供的tt关于Lewis血型物质结构图表,清晰的展示了Lewis血型与ABO血型的关tt系，见图2。ABO血型的分泌型产生可溶性ABH抗原的能力由基因座ttSE(FUT2)决定。FUT1和FUT2两个基因都编码α(l,2)岩藻糖基转移酶,两tt种α(l,2)岩藻糖转移酶均可表达在胃粘液腺和唾液腺中,H位点决定的H抗tt原还可以表达在红细胞系、表皮的上皮细胞,以及血管内皮细胞,无活性的ttFUT1基因在纯合子状态下不能表达H抗原。而SE位点仅限制性表达在内tt胚层起源的胃肠上皮和唾液腺,不表达在红白细胞系中,无活性的FUT2基因tt不会影响红细胞表面H抗原的表达,只会影响分泌腺和消化液中H抗原的表tt达。研究表明，大约85％的幽门螺杆菌脂多糖也有Lewis血型结构，见图tt3，由于幽门螺杆菌的脂多糖和宿主共同拥有Lewis血型抗原是导致幽门螺tt杆菌诱导自身免疫反应的基础，同时幽门螺杆菌通过Lewis抗原模拟达到tt免疫逃逸进而持续定植。鉴于幽门螺杆菌的脂多糖结构和Lewis血型结构tt具有同源性，同时Lewis血型结构与幽门螺杆菌的定植密切相关，因此应tt根据脂多糖的Lewis血型结构和重复寡糖结构建立血清学的分型方法，见tt图4。同时鞭毛的血清型分型还未见报道，因此目前的分型远不能满足临tt床诊断、特异治疗和流行病调查的需要，因此需要对幽门螺杆菌的脂多糖tt和鞭毛做更多、更细的分型。tt

　　随着人类基因组计划的开展而逐步发展，基因芯片技术作为全新的分tt析检测手段，综合运用了分子生物学、集成电路，计算机，半导体，共聚tt焦激光扫描，荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高，特异性强，大tttttt规模集成化，自动化，操作简便快捷，效率高等特点，在基因表达相关研tt究和生物制药研究等方面得到普遍应用。虽然基因芯片技术迎来了迅猛的tt发展，但随后研究发现许多基因并不表达功能蛋白，这在幽门螺杆菌基因tt组中尤为突出，因此随着蛋白组学时代的来临，蛋白芯片技术将逐渐取代tt基因芯片技术，用于高通量的检测。tt

　　发明人检索到以下相关专利文献：CN103290115A公开了一种肺炎链tt球菌血清型分型的检测方法，该方法首先提取待测肺炎链球菌样本基因组ttDNA，使用PCR预扩增引物对提取的基因组DNA进行预扩增，使用MLPAtt探针对因组DNA的预扩增产物进行杂交，同时在反应体系中加入相应的荧tt光检测探针，用连接酶连接已杂交的MLPA探针,并以MLPA通用扩增引物ttPCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针，使用多色荧光溶解曲线分析PCRtt产物，即可实现对肺炎链球菌进行血清型分型。本发明的检测方特异性、tt灵敏度高、可同时对10种血清型进行分型，CN101979664A公开了一种ttK88大肠杆菌不同血清型的PCR特异性检测和分型鉴别方法，该方法是先tt对待测样本进行PCR特异性检测，出现750bp条带的为待测样本为K88tt大肠杆菌，再分别用3对特异性引物对K88大肠杆菌DNA进行PCR扩增，tt根据扩增产物的500bp条带判断血清型。CN102482646A公开了一种幽门tt螺杆菌脂多糖外部核心表位，涉及含有α1，6-葡聚糖的幽门螺杆菌tt(Helicobacter pylori)化合物。tt

　　以上这些技术对于如何提供幽门螺杆菌血清型分型方法及其生物芯片tt的构建方法，并未给出具体的指导方案。tt

　　发明内容tt

　　本发明所要解决的技术问题在于，提供一种幽门螺杆菌血清型分型方tt法，该分型方法能满足对幽门螺杆菌的临床诊断、特异性治疗和流行病调tt查的需要。tt

　　本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种幽门螺杆菌生物芯片的tt构建方法，所述的方法能大大简化检测手段，提高检测速度，具有高准确tt性、高灵敏度、高通量、可重复性强的特点，能满足对幽门螺杆菌的临床tttttt诊断、治疗和流行病调查的需要。tt

　　为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：tt

　　一种幽门螺杆菌血清型分型方法，其技术方案在于它是根据某一区域tt幽门螺杆菌的毒力基因和幽门螺杆菌结构建立幽门螺杆菌血清型分型方tt法，所述的幽门螺杆菌的毒力基因指cagA和vacA，所述的幽门螺杆菌结tt构指的是鞭毛和脂多糖的寡糖和Lewis血型结构，所述的血清型分型方法tt包括如下步骤：(1)从幽门螺杆菌患者中分离出幽门螺杆菌；(2)对分离出tt的幽门螺杆菌做cagA和vacA的PCR并测序；(3)对幽门螺杆菌毒力基因ttcagA和vacA测序完成后，根据基因组合，筛出区域毒力流行株，并进行tt流行株的命名；(4)提取毒力流行株脂多糖和鞭毛，分析结构，根据毒力基tt因、鞭毛、脂多糖的重复寡糖和Lewis血型结构对所得毒力流行株进行血tt清型命名。tt

　　一种幽门螺杆菌生物芯片的构建方法(即制备方法)，其技术方案在于tt所述的构建方法是提取某个区域的幽门螺杆菌毒力流行株的脂多糖和鞭毛tt制备生物芯片，所述的幽门螺杆菌毒力流行株是根据幽门螺杆菌的毒力基tt因(cagA和vacA)、幽门螺杆菌鞭毛和脂多糖的结构筛选出来的毒力流行tt株，所述的生物芯片包括固相载体和固定在该载体上的根据血清型命名菌tt株的脂多糖和鞭毛蛋白探针、抗人IgG和IgM的标记二抗以及结果判读系tt统，所述的构建方法具体包括如下步骤：(1)从幽门螺杆菌患者中分离出tt幽门螺杆菌；(2)对分离出的幽门螺杆菌做cagA和vacA的PCR并测序；tt(3)对幽门螺杆菌毒力基因cagA和vacA测序完成后，根据基因组合，筛tt出区域毒力流行株，并进行流行株的命名；(4)提取该区域的幽门螺杆菌毒tt力流行株的脂多糖和鞭毛，并进行结构分析，根据毒力基因、鞭毛、脂多tt糖和重复寡糖和Lewis血型结构进行血清型命名，(5)提取已命名好的菌株tt的脂多糖和鞭毛构建生物芯片。tt

　　上述技术方案中所述的某一区域最好为某一行政地级市区域。tt

　　本发明与已有技术相比，具有以下优点：本发明建立了依据幽门螺杆tt菌毒力基因、鞭毛蛋白结构、脂多糖重复寡糖结构和Lewis血型结构的幽tttttt门螺杆菌分型方法，尤其是利用脂多糖的Lewis血型结构进行的血清学分tt型，尽可能多地补充了幽门螺杆菌的血清分型方法；同时提供一种利用生tt物芯片，用于快速，准确，灵敏的检测幽门螺杆菌血清型；提供一种利用tt上述芯片和检测方法来检测幽门杆菌的试剂盒。tt

　　本发明依据毒素基因、鞭毛结构、脂多糖重复寡糖和Lewis血型结构tt对幽门螺杆菌的血清型做了新的分型方法，其分型方法能满足对幽门螺杆tt菌的临床诊断、流行病调查，尤其是进行特异性治疗的需要。tt

　　本发明利用血清学分型方法、免疫凝集技术和芯片技术，提取并纯化tt幽门螺杆菌的脂多糖、鞭毛蛋白，制备成生物芯片后检测患者血清抗体，tt结合信号判断幽门螺杆菌的血清型，大大简化了检测手段，提高了检测速tt度，具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强的特点，对幽门螺杆tt菌的诊断、特异性治疗、流行病监测以及预防起到了良好的效果。tt

　　附图说明tt

　　图1为根据脂多糖重复寡糖进行的血清学分型示意图。tt

　　图2为Lewis血型与ABO血型的关系图。tt

　　图3为幽门螺杆菌脂多糖Lewis血型结构示意图。tt

　　图4为根据脂多糖重复寡糖和Lewis血型结构进行的血清学分型示意tt图。tt

　　具体实施方式tt

　　如图1所示，图1是根据脂多糖重复寡糖进行的血清学分型示意图。tt如图3所示，图3是幽门螺杆菌脂多糖Lewis血型结构示意图。如图4所tt示，图4是根据脂多糖重复寡糖和Lewis血型结构进行的血清学分型示意tt图。如图2所示，图2显示了Lewis血型抗原及相关分泌型，其中：tt

　　(A)а(l,2)岩藻糖基化的H抗原和Leb抗原定义为O型血,A、B型血是tt在H抗原基础上分别加上N-乙酰半乳糖和D-半乳糖,Ley和Leb都是岩藻糖tt基化的。SLea和sLex是唾液酸化Lewis血型抗原。tt

　　(B)血型抗原合成途径与相关的Se表型:Se0个体表达Lea抗原,Sew个tt体胃粘膜同时表达Lea和Leb抗原。tt

　　(C)按照唾液、乳汁和胃肠道粘膜分泌ABH及lewis抗原的情况分为ttSe、Se0和Sew表型。tt

　　(D)Sew个体是由于岩藻糖基转移酶的弱化阻碍了а(l,2)岩藻糖基化,而ttSe0个体缺乏岩藻糖基转移酶活性。tt

　　下面对发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前tt提下进行实施，给出了详细的实施方法和具体的操作过程，但本发明的保tt护范围不限于下述的各实施例。tt

　　实施例1：本发明的幽门螺杆菌血清型分型方法是根据某一区域(某tt一行政地级市区域)幽门螺杆菌的毒力基因和幽门螺杆菌结构建立幽门螺tt杆菌血清型分型方法，所述的幽门螺杆菌的毒力基因指cagA和vacA，所tt述的幽门螺杆菌结构指的是鞭毛和脂多糖重复寡糖和Lewis血型结构，所tt述的血清型分型方法包括如下步骤：tt

　　(1)从幽门螺杆菌患者中分离出幽门螺杆菌，分离培养(与鉴定)方tt法见方法一。tt

　　方法一、胃幽门螺杆菌的分离培养与鉴定方法：通过胃镜咬检幽门螺tt杆菌感染者的胃粘膜组织，然后将胃粘膜组织置于含有0.5ml布氏肉汤的tt玻璃研磨器中研磨成浆,吸取100μl涂布于歌伦比亚选择培养基平板上(含tt8％的脱纤维羊血，5mg/LTMP，5mg/L多粘菌素B，5mg/L两性霉素B，tt10mg/L万古霉素)，然后把平板放置于三气培养箱中培养(10％CO2，tt85％N2，5％O2),37℃培养3-7天，对培养出的可疑菌落进行革兰染色镜检、tt脲素酶、触酶、氧化酶实验。结果是革兰阴性，S型或弧型,三酶实验阳tt性可初步鉴定为Hp，然后进一步做16sRNA的PCR验证。tt

　　(2)对分离出的幽门螺杆菌做cagA和vacA的PCR并测序，PCR方tt法和引物如下(幽门螺杆菌的毒力基因PCR方法见方法二，PCR的引物及tt其反应条件见表1)：tt

　　方法二、幽门螺杆菌的毒力基因PCR方法(具体包括如下步骤)tt

　　(一)细菌DNA的提取方法，按DNA提取试剂盒说明操作。tt

　　1)从幽门螺杆菌培养基上刮取新鲜的菌苔(黄豆大小)，置于1.5ml EPtttttt管壁上。加入0.9％生理盐水，震荡混匀，离心10000rpm2min,弃上清，tt如此重复3次。tt

　　2)加入180μl ATL(将细菌裂解，溶开沉淀)。tt

　　3)加入20μl蛋白酶K，震荡混匀，56℃金属浴，300rpm1-3小时，短tt暂离心。tt

　　4)加入200μl AL震荡混匀，70℃金属浴10min，短暂离心。tt

　　5)加入200μl无水乙醇，轻柔上下颠倒15秒，混匀至澄清，短暂离tt心。tt

　　6)加入500μl AW1，离心8000rpm1min弃管留柱，换上新收集管。tt

　　7)加入500μl AW2,离心14000rpm3min弃管留柱，换上新收集管，tt离心14000rpm1min。tt

　　8)将吸附柱置于经高压灭菌处理的1.5ml EP管中，放置5min让酒精tt挥发。tt

　　9)加入200μl ddH2O，室温放置5min，离心8000rpm1min。tt

　　10)测定OD260/280，OD260/230。tt

　　(二)PCR的引物及其反应条件见(尾页的)表1。tt

　　(3)对幽门螺杆菌毒力基因cagA和vacA测序完成后，根据基因组合，tt筛出区域毒力流行株，并进行流行株的命名。(4)提取毒力流行株脂多糖和tt鞭毛，分析结构，见方法三、方法四。根据毒力基因组合、鞭毛结构、脂tt多糖的Lewis血型结构和重复寡糖结构对所得毒力流行株进行血清型命名。tt

　　方法三、鞭毛的提取和结构分析tt

　　(一)幽门螺杆菌鞭毛的提取(具体包括如下步骤)tt

　　1)幽门螺杆菌的固体培养：菌株分别接种于歌伦比亚选择培养基平板tt上(含8％的脱纤维羊血，5mg/LTMP，5mg/L多粘菌素B，5mg/L两性霉tt素B，10mg/L万古霉素)，然后把平板放置于三气培养箱中培养(10％CO2，tt85％N2，5％O2),37℃培养48h转为液体培养：将已培养48h的平板取出刮tt取菌苔，转种于装有10ml液体培养基(脑心浸液肉汤，含10％小牛血清、tttttt100mg/L的万古霉素和2500U/L的多粘菌素B)的100ml组织培养瓶，轻微tt塞上棉塞，放置于三气培养箱中的振荡培养器上，37℃振荡培养(100r/min)。tt

　　2)细菌培养48-72小时后，离心收集细菌，离心洗涤3次，然后加入tt2mg/ml溶菌酶，轻轻混合，并在室温下放置10分钟。tt

　　3)通过针头反复吹吸5次，然后16000g离心2次，每次10分钟，去tt沉淀，保留上清。tt

　　4)将上清液再次50000g离心1小时，上清液弃去，留沉淀。tt

　　5)50000g离心1小时再次洗涤沉淀物，最后将沉淀物与100μl水混合。tt使用SDS-PAGE进行纯度检测。tt

　　(二)鞭毛的结构分析方法tt

　　通过蛋白质飞行质谱仪分析幽门螺杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列。tt

　　方法四、脂多糖的提取和结构分析tt

　　(一)脂多糖的提取(具体包括如下步骤)tt

　　1)配置2×SDS缓冲液，终浓度为0.1M的Tris-HCl、4％的β-巯基乙tt醇(BME)、4％SDS、20％甘油，pH值6.8。tt

　　2)加入溴酚蓝。2×SDS缓冲液1：1稀释成1×SDS缓冲液，室温下tt储存。tt

　　3)分别用无菌蒸馏水溶解三个酶管，分别是10毫克/毫升的DNA酶I、ttRNA酶和蛋白酶K。tt

　　4)将幽门螺杆菌悬浮于200μl的1×SDS-缓冲液，轻柔缓慢吹吸重悬tt细菌，使其均匀。tt

　　5)悬浮细菌水浴煮沸15分钟，之后室温下冷却15分钟。tt

　　6)冷却后的悬浮细菌中，加入DNA酶和RNA酶共5μl，37℃孵育30tt分钟。tt

　　7)加入10μl蛋白酶K，孵育的样品在59℃孵育3小时，也可孵育过tt夜。tt

　　8)样品中加入200μl冰冷Tris-饱和的苯酚。管子的瓶盖拧紧，旋涡振tt荡5到10秒。tt

　　9)样品65℃孵育15分钟，间歇涡旋混匀。冷却至室温后，再加入1mltt室温的乙醚，涡旋混合5到10秒。tt

　　10)样品20600g离心10分钟。小心提取底部的蓝色层，尽量避免上清tt液的混入。tt

　　11)提取的蓝色层即为幽门螺杆菌脂多糖。tt

　　(二)脂多糖的结构分析方法tt

　　在4M三氟乙酸中于100℃进行4小时水解，或在2M三氟乙酸中于tt100℃进行16小时水解。之后在含有NaBH4的水中还原，随后用乙酸酐/tt吡啶乙酰化，最后通过气相液相层析-质量光谱法(GLC-MS)分析甲基化tt的乙酸糖纯衍生物。tt

　　实施例2：本发明的幽门螺杆菌生物芯片的构建方法是提取某个区域tt的幽门螺杆菌毒力流行株的脂多糖和鞭毛制备生物芯片，所述的幽门螺杆tt菌毒力流行株是根据幽门螺杆菌的毒力基因(cagA和vacA)、幽门螺杆菌tt鞭毛和脂多糖的结构筛选出来的毒力流行株，所述的生物芯片包括固相载tt体和固定在该载体上的根据血清型命名菌株的脂多糖和鞭毛蛋白探针、抗tt人IgG和IgM的标记二抗以及结果判读系统，所述的构建方法具体包括如tt下步骤：(1)从幽门螺杆菌患者中分离出幽门螺杆菌，分离培养(与鉴定)tt方法见实施例1的方法一。(2)对分离出的幽门螺杆菌做cagA和vacA的ttPCR并测序，PCR方法和引物见实施例1的方法二和表1。(3)对幽门螺杆tt菌毒力基因cagA和vacA测序完成后，根据基因组合，筛出区域毒力流行tt株，并进行流行株的命名。(4)提取该区域的幽门螺杆菌毒力流行株的脂多tt糖和鞭毛，并进行结构分析，见实施例1的方法三、方法四，根据毒力基tt因、鞭毛、脂多糖和的结构进行血清型命名。(5)提取已命名好的菌株的脂tt多糖和鞭毛构建生物芯片，见方法五。tt

　　方法五、生物芯片的制备过程，它包括的步骤(一)提取纯化各个血tttttt清型幽门螺杆菌的脂多糖和鞭毛蛋白；(二)芯片点样。tt

　　(一)提取纯化各个血清型幽门螺杆菌的脂多糖和鞭毛蛋白，方法见前tt述的方法三、方法四。tt

　　(二)芯片点样，具体包括如下步骤：tt

　　1)将提取纯化的脂多糖和鞭毛蛋白室温放置5分钟。tt

　　2)点样:将醛基化玻片放到芯片点样仪的载物台上，使用控制软件，tt运行程序，在醛基化的玻片上4.5×4.5的区域内点样，构成中低密度蛋白tt的微矩阵，玻片上的四个点样区内阵列排布规律相同。tt

　　3)干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃的烘箱干燥2tt小时。tt

　　4)交联：用交联仪交联2次，将交联好的芯片放回到洁净的芯片盒中，tt备用。tt

　　幽门螺杆菌感染者血清抗体的检测方法包括如下步骤：tt

　　1)提取病人的血清:抽取病人静脉血3毫升，3000转/分钟离心5分钟，tt将上层血清放入洁净的EP管，-20℃保存。tt

　　2)检测前先取出生物芯片在室温下放置20min,使其平衡至室温。tt

　　3)加待检血清50μl。待血清完全渗入后,再滴加HRP标记的二抗tt50μl。tt

　　4)37℃反应1小时，充分洗涤6次。tt