一种无创人肝癌早期检测与鉴别诊断方法及系统
技术领域tt
本发明涉及对离体血液检测实现无创肝癌早期检测与鉴别诊断的分子检测tt方法，属于临床医学领域。tt
背景技术tt
肝癌是世界上第五常见肿瘤，第二常见肿瘤死因。小肝癌手术后生存率可以tt达80％以上，但一般病人诊断时已经属晚期，生存率往往不到6个月，因此及时tt准确尽早诊断肝癌是提高肝癌病人生存率的首要工作。由于肝癌常常发生在慢性tt肝炎肝硬化的基础上，早期区分一般不容易，因此传统的检测方法在肝癌的早期tt检测，鉴别诊断，早期治疗上存在很多缺陷，尤其是无法准确的区分慢性肝炎肝tt硬化与肝癌。tt
肿瘤检测常规使用血清学检测，影像学检查，及病理检查等手段。血清学检tt测往往缺乏特异性，影像学检查有时也不能做早期诊断，或性质诊断，病理检查tt是有创检查，一般也不能做早期诊断。tt
发明内容tt
申请人对肝癌的早期检测进行了深入研究，将肝癌与肿瘤细胞在染色体水平tt上在基因水平上的异常改变进行关联分析从而发明了一种无需在人体上进行有tt创检查的肝癌早期检测与鉴别诊断方法。tt
具体地说，本发明是通过下述技术方案实现的：tt
一种无创人肝癌早期检测与鉴别诊断方法，包括下述步骤：tt
1)从离体血浆中提取血浆游离DNA，构建基因组测序文库；tt
2)对其进行测序，测定基因组DNA顺序并与人基因组参考顺序进行序列比tt对；tt
3)以不同的基因组顺序长度为基本分析单元，进行染色体拷贝数变异CNVtt分析并构建染色体CNV图观察是否有目视可观察到的拷贝数改变。tt
4)以不同的基因组顺序长度为基本分析单元，进行染色体拷贝数变异Z分tt值CNV的分析。tt
其中，上述的离体血浆，通常是外周血血浆。tt
其中，基本分析单元为0.05-5.0M的基因组顺序长度，优选是0.05-3.0Mbtttttt之间或0.1-5.0Mb之间，最优选为150kb或1Mb。tt
其中，上述所用的测序方法可以是本领域任意可用的方法，为了提高灵敏度、tt准确率和速度，优选为高通量基因组测序。tt
在本发明中，涉及到的基因文库构建、测序、比对等都可从市场上采购相应tt的产品，例如NEB公司的试剂盒构建基因组测序文库、Illumina Hiseq2500SR41tt方法做基因组DNA测序、BWA软件做测序顺序比对等。tt
其中，步骤3)的操作为使用基因组测序数据测得的小片段数，按核酸GCtt含量做标准化处理，计算每个染色体上每个基本分析单元测得的相对片段数，再tt与正常人对照组比较，计算CNV比值；将各染色体各基本分析单元的CNV比值与tt染色体位置作CNV图。tt
其中，步骤4)是为了进一步提高微小CNV的检出率，其具体操作为将样品tt每个基本分析单元与正常人对照组相比，以均数差与对照组标准差之间的比例关tt系，计算样品基本分析单元测得顺序片段数的偏离正常群体的程度从而进行Ztt分值CNV分析。tt
Z分值CNV改变的判断标准为：一条染色体的长臂或短臂有两个或两个以上tt的基本分析单元Z分值或都大于4.0或都小于负4.0，或一个基本分析单元Z分tt值大于4.0或小于负4.0同时有其它4个基本分析单元Z分值或都大于3.0或都tt小于负3.0(同向)。上述界定值4.0也可以是3.0到6.0之间的其它数值。符tt合这个标准的Z分值CNV改变出现在人染色体1q或7q或19q，表现为拷贝数tt增加，或同时出现在人染色体1p，9q，14q，表现为拷贝数减少。tt
申请人进行的大量研究发现，上述特有性的染色体CNV改变常见于肝癌病人tt及早期肝癌病人的样品中，包括一些血清AFP正常或比较低的肝癌病人的样品中，tt而在慢性肝炎，肝硬化病人的样品中没有或极少见，因此本发明可用于在慢性肝tt炎，肝硬化病人中筛查，作为肝癌的早期检测及鉴别诊断方法。CNV综合评分高tt提示病人肝癌的存在的可能性高，特别是在慢性肝炎肝硬化的基础上，需要密切tt追踪观察，结合其它方法验证肝癌的存在，以达到早期诊断，早期治疗的目的。tt
最后，为了提高上述整个过程的自动化程度，降低人为的操作误差，本发明tt还公开了一种无创人肝癌早期检测与鉴别诊断系统，包括试剂盒、DNA测序仪和tt计算机，所述试剂盒用来对提取的血浆游离DNA构建基因组测序文库，所述DNAtt测序仪进行基因组DNA测序；所述计算机基于测序数据进行CNV分析并构建染色tttttt体CNV图和进行Z分值CNV分析并输出分析结果。tt
具体的说，计算机是使用DNA测序仪进行基因组测序测得的小片段数，按核tt酸GC含量做标准化处理，计算每个染色体上每个基本分析单元测得的相对片段tt数，再与正常人对照组比较，计算CNV比值；将各染色体各基本分析单元的CNVtt比值与染色体位置作CNV图；并将样品每个基本分析单元与正常人对照组相比，tt以均数差与对照组标准差之间的比例关系，计算样品基本分析单元测得顺序片段tt数的偏离正常群体的程度从而进行Z分值CNV分析。tt
附图说明tt
图1为不同病人血浆游离DNA检测出的染色体CNV改变图(基本分析单元150kb)。tt图2为CNV综合评分与肿瘤大小的相关分析(肝癌病人以肿瘤较大直径为依据tt分为10-30mm，31-60mm，60mm以上三组)。tt
图3为CNV综合评分用于临床肝癌检测，早期检测，及鉴别诊断的特异性及灵敏tt度(ROC图)。tt
具体实施方式tt
实施例1：外周血游离DNA基因组CNV分析tt
取临床诊断明确的肝癌病人的离体血浆31例，慢性肝炎肝硬化病人的离体tt血浆8例，提取血浆中的游离DNA，用NEB公司的试剂盒构建基因组测序文库，tt每个文库DNA起始用量为3-5ng。用Illumina Hiseq2500SR41方法做基因组ttDNA测序，每个样品有效测序数为10M。BWA软件做测序顺序比对，然后根据本tt发明的步骤进行CNV分析，其中所用的CNV正常对照数据来自于250例正常人。tt
测定结果发现，部分肝癌病人(41.9％，13/31)在染色体CNV图上有可观察tt到的异常改变，慢性肝炎与肝硬化组，没有可见CNV改变。结果见图1。tt
实施例2：Z分值CNV综合评分方法的建立tt
按照如下原则进行评分：染色体CNV图上有目视可观察到的拷贝数改变4tt分，上述Z分值CNV改变中，1q或7q或19q拷贝数增加为2分，上述1p或9qtt或14q CNV拷贝数减少为0.5分，以1.5分为临界值，高于等于1.5为肝癌高tt危，低于1.5为肝癌低危。tt
肝癌高危提示肝癌的存在的可能性高，特别是在慢性肝炎肝硬化的基础上，tt需要密切追踪，用其它方法验证肝癌的存在，以达到早期诊断，早期治疗的目的。ttttttCNV综合评分与肝癌大小有相关性，见图2。tt
实施例3：CNV综合评分在肝癌早期检测与鉴别诊断方面的应用tt
上述CNV综合评分方法分析肝癌，慢性肝炎肝硬化测定数据，结果肝癌组阳tt性率为83.9％(26/31)，50mm以下的肝癌组阳性率为68.8％(11/16)，30mmtt以下的肝癌组阳性率为57.1％(4/7)，在血清AFP阴性或较低水平(低于50ng/ml)tt的肝癌组阳性率为70％(7/10)，肝炎肝硬化组全部阴性(0/8)，总体灵敏度tt84％，特异性100％。ROC图见图3。tt
实施例4：本发明的具体个案应用tt
一肝癌病人，血清AFP正常，无HBV感染，肿瘤最大直径35mm，CNV图上无tt可见CNV改变，Z分值CNV分析发现其7q拷贝数增加，9q拷贝数减少，综合评tt分2.5，符合肝癌高危判断标准。该患者达到标准的CNV Z分值如下：7q22.1tt(+4.19)，7q36.2(+4.03)，9q31.2(-4.33)，9q34.3(-7.13)，以上数据是基于tt基本分析单元为1M的Z分值CNV分析。tt
