一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。
背景技术
倏逝波检测技术是一种新型的检测技术，它是利用光波在基质内以全反射方式传输时在基质表面产生倏逝波，可以激发连接在基质表面标记有荧光分子的生物物质，从而实现对待测目标物定量或定性的检测。由于其具有不直接与待测物发生作用，穿透深度仅有数百纳米的特点，因而可有效降低噪音，消除体相中杂质的干扰，特别适合复杂环境中待测目标物的检测。近年来，发明人所在课题组开发出多种基于倏逝波检测技术的方法和仪器（如：专利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）并将其成功用于水体中藻毒素、2、4-D等化合物的检测之中，取得了较好的效果。
现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些小分子（如金属离子、农药等）可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为这类小分子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。上述能够发生特异结构变化的DNA或RNA链，被称为功能核酸（Functional Nucleic Acids，FNAs）。2008年M A.Shannon等在《Nature》上发表文章“Science and technology for water purificationin the coming decades”指出未来二十年，功能核酸（如核酸酶、核酸适体等）为代表的检测技术在环境污染物的分析上具有广阔的应用前景。
利用先前开发的修饰方法，很难消除由于功能核酸在表面的非特异吸附，造成的固定效率差信号、背景噪音大、重复性不好等问题，因而急需开发功能核酸的固定化方法。鉴于检测的需要，该方法形成的修饰层应该满足以下条件：（1）能与倏逝波检测芯片共价结合，不影响芯片的物化性质；（2）能与不同基团（氨基、巯基和羧基等）修饰的寡聚核苷酸形成共价连接；（3）修饰的寡聚核苷酸数量可控；（4）非特异吸附小，背景信号低；（5）稳定性好，可多次重复使用，降低使用成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。
本发明提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：
（1）将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；
（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min（如90min-120min、90min或120min）后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时（具体可200℃烘烤12小或130℃烘烤1小时）；
（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。
所述步骤（1）中，所述基片可为硅片、石英片、玻璃片或光纤。所述步骤（1）中，所述SiO2膜的厚度可为20nm以上（如50nm）。所述步骤（1）中，所述“进行表面羟基活化”的方法如下：将表面具有SiO2膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-110℃静置45-90分钟（具体可90℃静置60分钟）后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120℃静置3-12h（具体可110℃静置8小时）。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1体积份30%过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体具体如下：将3体积份浓硫酸（即质量分数为98.3%的硫酸溶液）和1体积份30%过氧化氢（即质量分数为30%的过氧化氢溶液）混合。
所述步骤（2）中，所述硅烷化剂具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧基，优选为APTES或MTS。所述步骤（2）中，所述硅烷化剂溶液可由硅烷化剂和有机溶剂组成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为（0.4-5）：100，优选为2：100、0.4：100、5：100或4：100。所述有机溶剂可为甲苯或二甲苯。
所述步骤（3）中，所述偶联剂为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）戊二醛；（b）GBMS；（c）EDC和NHS；（d）PIDTC。所述步骤（3）中，所述“通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面”的方法如下：将步骤（2）得到的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置30-120min(如60-90min、90-120min、60min、90min或120min)后取出基片，洗涤并干燥，然后在表面滴加核酸分子溶液，室温静置（具体可为48小时），洗涤后用蛋白（如牛血清蛋白）进行封闭。所述偶联剂溶液中，每种偶联剂的体积百分浓度可为0.4%-5%，如0.4%-2%，2%-2.5%、2.5%-4%、4%-5%。所述偶联剂溶液的溶剂可为PBS缓冲液（如pH7.4的PBS缓冲液）、乙醇、MES缓冲液（如pH4-6的MES缓冲液，优选为pH5的MES缓冲液）或DMF。所述偶联剂溶液具体可为含5%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含0.4%（体积比）GBMS的乙醇溶液。所述偶联剂溶液具体可为含4％（体积比）EDC和4％（体积比）NHS的pH5、0.1M的MES缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含2.5%PIDTC的DMF。所述偶联剂溶液具体可为含2%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。
所述核酸可为脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。
以上任一所述方法制备得到的核酸芯片也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述核酸芯片在倏逝波检测中的应用。
本发明中通过预处理－硅烷化－高温烘烤－偶联化－固定寡聚核苷酸的工艺流程，在SiO2芯片表面有效的固定了核酸，得到了核酸芯片，固定密度可达108－1013个/cm2。在倏逝波激发下，可实时监测核酸芯片表面固定的核酸与互补核酸的杂交情况，同时该核酸芯片还可洗脱再生，实现重复使用（可重复使用50次以上）。
附图说明
图1为实施例1的结果。
图2为实施例2的结果。
图3为实施例3的结果。
图4为对比例的结果。
图5为实施例4的结果。
图6为实施例5的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
APTES：购自sigma-aldrich；中文名称为“3-氨丙基三乙氧基硅烷”，分子式为“H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3”，CAS号为“919-30-2”，结构式如下：
MTS：购自Acros；英文全称为（3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane，中文名称为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，分子式为“HS(CH2)3Si(OCH3)3”，CAS号为“4420-74-0”，结构式如下：
MES：购自sigma-aldrich；英文全称为morpholineethanesulfonic acid，中文名称为2-吗啉乙磺酸，分子式为“C6H13NO4S”，CAS号为“4432-31-9”，结构式如下：
DMF：购自sigma-aldrich；英文名称为N,N-Dimethyl Formamide，中文名称为二甲基甲酰胺，分子式为“C3H7NO”，CAS号为“68-12-2”。
NHS：购自sigma-aldrich；英文名称为N-Hydroxysuccinimide，中文名称为N-羟基琥珀酼亚胺，分子式为“C4H5NO3”，CAS号为“6066-82-6”，结构式如下：
EDC：购自sigma-aldrich；英文名称为1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，中文名称为二甲基氨基丙基乙基碳酰胺，CAS号为“22572-40-3”，结构式如下：
GMBS：购自sigma-aldrich；英文名称为N-(4-maleimidobutyryloxy)succinimide,中文名称为4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯,CAS号为“80307-12-6”，结构式为：
PIDTC：购自sigma-aldrich；英文名称为1,4-phenylene diisothiocyanate，中文名称为1,4-二异硫氰酸亚苯酯，CAS号为“4044-65-9”，结构式为：
玻璃基片：材质为BK7光学玻璃，折射率为1.51680；购自北京京冀光学玻璃加工中心。光纤：购自南京春辉科技实业有限公司，型号HCS。
实施例中所用的PBS缓冲液的制备方法：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.63g、KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
以下实施例中所用的Tris-HCl缓冲液，如无特殊说明均为pH7.4、50mM的Tris-HCl缓冲液。
实施例1、DNA芯片的制备和应用
一、制备DNA芯片
1、采用化学气相沉积法在玻璃基片表面镀50nm厚度的SiO2膜。
2、表面羟基活化
将步骤1得到的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，90℃静置60分钟，取出基片，用超纯水冲洗3次后用N2吹干，然后110℃静置8小时，然后将基片置于干燥器中冷却和保存。
硫酸-过氧化氢溶液的制备方法：将3体积份浓硫酸（即质量分数为98.3%的硫酸溶液）和1体积份30%过氧化氢（即质量分数为30%的过氧化氢溶液）混合。
3、表面硅烷化
将步骤2得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置90min，取出基片，依次用二甲苯、乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后200℃烘烤12小时，然后将基片置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将APTES溶解于二甲苯（每5ml APTES溶于100mL二甲苯），形成混合均匀的硅烷化剂溶液。
4、表面偶联化
将步骤3得到的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置90min，取出基片，依次用PBS缓冲液和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后将基片置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含5%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。
5、寡聚核苷酸的固定
将探针溶液滴在步骤4得到的基片的表面，然后放入湿度为65％（实际应用中，55-75％均可）的密闭环境中室温静置48小时，依次用Tris-HCl缓冲液、超纯水各冲洗3次，然后用含2mM牛血清蛋白的PBS缓冲液进行封闭1小时，随后再用0.2％（质量比）SDS水溶液、超纯水各冲洗3次，每次1min，然后用N2吹干，得到DNA芯片。
探针溶液的制备方法：将探针和NaCl溶于Tris-HCl缓冲液，使探针的浓度为10μM，NaCl的浓度为100mM。
探针（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-CATCTCTTCAGTGAGTCAGACATA-T12-NH2-3’。
二、DNA芯片的应用
用于本实施例的倏逝波检测仪器见专利ZL 200610089497.4（CN1873450A）。
靶标溶液的制备方法：将靶标和NaCl溶于Tris-HCl缓冲液，使靶标的浓度为10μM，NaCl的浓度为1M。
靶标（单链DNA）：5’-TATGTCTGACTCACTGAAGAGATG-荧光淬灭基团BHQ3-3’。
非靶标溶液的制备方法：将非靶标和NaCl溶于Tris-HCl缓冲液，使靶标的浓度为10μM，NaCl的浓度为1M。
非靶标（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-ACAAACAT-3’。
依次进行如下步骤：
1、将步骤一制备的DNA芯片装入倏逝波检测仪器。
2、将靶标溶液加入倏逝波检测仪器中，室温反应10min，用超纯水洗涤芯片后检测光信号，检测完成后用0.2%（质量比）SDS水溶液洗涤DNA芯片以去除靶标（本步骤为DNA芯片的再生步骤）。
3、将靶标溶液通入倏逝波检测仪器中，室温反应10min，用超纯水洗涤芯片后检测光信号，检测完成后用0.2%（质量比）SDS水溶液洗涤DNA芯片以去除靶标。
4、将靶标溶液通入倏逝波检测仪器中，室温反应10min，用超纯水洗涤芯片后检测光信号，检测完成后用0.2%（质量比）SDS水溶液洗涤DNA芯片以去除靶标（本步骤为DNA芯片的再生步骤）。
5、将非靶标溶液通入倏逝波检测仪器中，室温反应10min，用超纯水洗涤芯片后检测光信号，检测完成后用0.2%（质量比）SDS水溶液洗涤DNA芯片以去除靶标。
倏逝波检测仪器在以上步骤2、步骤3、步骤4和步骤5中输出的光信号曲线见图1。
实施例2、DNA芯片的制备和应用
一、制备DNA芯片
1、光纤表面羟基活化
用光纤代替玻璃基片，其它同实施例1的步骤2。
2、表面硅烷化
将步骤2得到的光纤浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置120min，取出光纤，依次用甲苯、乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后130℃烘烤1小时，然后置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将MTS溶解于甲苯（每0.4ml MTS溶于100mL甲苯），形成混合均匀的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤3得到的光纤浸泡于偶联剂溶液，室温静置60min，取出基片，依次用乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含0.4%（体积比）GBMS的乙醇溶液。
4、寡聚核苷酸的固定
方法同实施例1的步骤一的5。
探针（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-CATCTCTTCAGTGAGTCAGACATA-T12-NH2-3’。
二、DNA芯片的应用
用于本实施例的倏逝波检测仪器见专利ZL 200610089497.4（CN1873450A）。
靶标溶液的制备方法：将靶标和NaCl溶于Tris-HCl缓冲液，使靶标的浓度为10μM，NaCl的浓度为1M。
靶标（单链DNA）：5’-TATGTCTGACTCACTGAAGAGATG-荧光淬灭基团BHQ3-3’。
依次进行如下步骤：
1、同实施例1的步骤二的1。
2、同实施例1的步骤二的2。
3、同实施例1的步骤二的3。
4、同实施例1的步骤二的4。
倏逝波检测仪器在以上步骤2、步骤3和步骤4中输出的光信号曲线见图2。
实施例3、DNA芯片的制备和应用
一、制备DNA芯片
1、光纤表面羟基活化
用光纤代替玻璃基片，其它同实施例1的步骤2。
2、表面硅烷化
将步骤2得到的光纤浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置120min，取出光纤，依次用甲苯、乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后200℃烘烤12小时，然后置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将APTES溶解于甲苯（每4ml APTES溶于100mL甲苯），形成混合均匀的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤3得到的光纤浸泡于偶联剂溶液，室温静置120min，取出基片，依次用MES、乙醇和PBS各冲洗3次，然后用N2吹干，然后置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含4％（体积比）EDC和4％（体积比）NHS的pH5、0.1M的MES缓冲液（实际应用中，pH4-6的缓冲液均可）。
4、寡聚核苷酸的固定
方法同实施例1的步骤一的5。
探针（单链DNA）：5’-NH2-(CH2)6-ATGTTTGTTTGTTGGCCCCCCTTCTTTCTTA-3’。
二、DNA芯片的应用
用于本实施例的倏逝波检测仪器见专利ZL 200610089497.4（CN1873450A）。
靶标溶液的制备方法同实施例1中的靶标溶液的制备方法。
靶标（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-ACAAACAT-3’。
依次进行如下步骤：
1、同实施例1的步骤二的1。
2、同实施例1的步骤二的2。
3、同实施例1的步骤二的3。
4、同实施例1的步骤二的4。
倏逝波检测仪器在以上步骤2、步骤3和步骤4中输出的光信号曲线见图3。
对比例、
对比例与实施例1的区别仅在于步骤3中没有进行“200℃烘烤12小时”。
基片第一次杂交、再生均正常，但是再次杂交和再生，信号显著变差，难以重复，同时基线显著上升，表明非特异吸附增加。曲线见图4。
实施例4、DNA芯片的制备和应用
一、制备DNA芯片
1、光纤表面羟基活化
用光纤代替玻璃基片，其它同实施例1的步骤2。
2、表面硅烷化
将步骤2得到的光纤浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置120min，取出光纤，依次用二甲苯、乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后200℃烘烤12小时，然后置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将APTES溶解于二甲苯（每2ml APTES溶于100mL二甲苯），形成混合均匀的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤3得到的光纤浸泡于偶联剂溶液，室温避光静置120min，取出光纤，依次用DMF、乙醇和PBS各冲洗3次，然后用N2吹干，然后置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含2.5%（体积比）PIDTC的DMF。
4、寡聚核苷酸的固定
同实施例3的步骤4。
二、DNA芯片的应用
用于本实施例的倏逝波检测仪器见专利ZL 200610089497.4（CN1873450A）。
靶标溶液的制备方法同实施例1中的靶标溶液的制备方法。
靶标（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-ACAAACAT-3’。
依次进行如下步骤：
1、同实施例1的步骤二的1。
2、同实施例1的步骤二的2。
3、同实施例1的步骤二的3。
4、同实施例1的步骤二的4。
倏逝波检测仪器在以上步骤2、步骤3和步骤4中输出的光信号曲线见图5。
实施例5、DNA芯片的制备和应用
一、制备DNA芯片
1、光纤表面羟基活化
用光纤代替玻璃基片，其它同实施例1的步骤2。
2、表面硅烷化
将步骤2得到的光纤浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置120min，取出光纤，依次用二甲苯、乙醇和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后200℃烘烤12小时，然后置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将APTES溶解于二甲苯（每2ml APTES溶于100mL二甲苯），形成混合均匀的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将表面硅烷化后的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置90min，取出基片，依次用PBS缓冲液和水各冲洗3次，然后用N2吹干，然后将基片置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含2%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。
4、寡聚核苷酸的固定
方法同实施例1的步骤一的5。
探针（单链DNA）：5’-NH2-(CH2)6-ATGTTTGTTTGTTGGCCCCCCTTCTTTCTTA-3’。
二、DNA芯片的应用
用于本实施例的倏逝波检测仪器见专利ZL 200610089497.4（CN1873450A）。
靶标溶液的制备方法同实施例1中的靶标溶液的制备方法。
靶标（单链DNA）：5’-荧光素基团Cy5.5-ACAAACAT-3’。
依次进行如下步骤：
1、同实施例1的步骤二的1。
2、同实施例1的步骤二的2。
3、同实施例1的步骤二的3。
重复进行步骤2和3，共进行56次。倏逝波检测仪器输出的光信号曲线见图6。
