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跨越血-脑脊液屏障的肽

2022-12-10 13:51:15

跨越血-脑脊液屏障的肽

  技术领域tt

  本发明属于蛋白质多肽技术领域,涉及能跨越血-脑脊液屏障的多肽,包括所述肽的分tt子结构及其在制备脑靶向制剂中的应用。tt

  背景技术tt

  随着人类社会的老龄化,脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势,正严重危害着人类tt的生命和健康。通常脑部疾病包括中枢神经系统疾病(帕金森病、老年性痴呆)、脑肿瘤、tt脑血管病变、脑部病毒和细菌感染等疾病。tt

  血-脑屏障(BBB)是存在于血液与脑组织间的屏障系统,它能将脑组织非必需或是有tt害的物质隔离在外,起到保护脑组织的作用。血脑屏障上的脑毛细血管内皮细胞和胶质细tt胞共同构成了紧密连接,即是一道BBB的机械屏障。研究显示,脑毛细血管内皮细胞膜tt上还存在一些特殊的酶系统,能使某些药物降解,如多巴胺脱羧酶能使L-多巴和L-5-羟色tt胺酸脱羧生成不易透过BBB的L-多巴胺和L-5-羟色胺,从而构成BBB的酶屏障;脑毛细tt血管内皮细胞膜上的P-糖蛋白等还起着外排泵的作用,它能选择性地将脑内有害物质或过tt剩物质泵出脑外,限制物质的脑内递送。血脑屏障的上述功能维持了正常生理状态下脑组tt织内环境的恒定,但在疾病治疗过程中却限制了药物的透过。据有关统计,目前临床常规tt制剂给药后,大约有98%的化学药物和几乎100%的蛋白多肽或基因药物由于血脑屏障的tt作用而难以入脑,很大程度上限制了脑部疾病的治疗。tt

  血-脑脊液屏障(BCSFB)位于脑室脉络丛的毛细血管和脑脊液之间,其结构基础是脉tt络丛上皮细胞间隙的顶部有闭锁小带。脉络丛的毛细血管内皮细胞上有窗孔,并且也没有tt形成如BBB一般的紧密连接,因此该屏障与血脑屏障相比具有一定的通透性,这也为药tt物入脑发挥疗效提供的可能性。tt

  目前已有通过瞬时开放血-脑脊液屏障来增加药物入脑的策略,但该方法不具备选择性tt并且常具有侵入性,并且有可能导致大量潜在的神经毒素和其他化学物质进入脑内,这将tt对CNS的稳态产生不利影响,并产生不希望出现的副作用。相比之下,纳米载体,例如脂tt质体和纳米粒,可以提供更好的选择。已经有越来越多种类的纳米位和脂质体可供选择以tt用于治疗。这些脂质体或纳米粒的表面通常被修饰,使得该构建体可以通过特定的机制靶tt向中枢神经系统。筛选可以穿过血-脑脊液屏障的肽,可以帮助药物更具有选择性,从而提tttttt供更好的治疗效果,同时降低全身毒性。tt

  噬菌体展示肽库技术是一种筛选功能性多肽的生物技术,它将随机多肽文库表达于丝tt状噬菌体的表面,通过多轮的“亲和-洗脱-扩增”步骤,实现高通量亲和筛选。有研究通tt过噬菌体展示技术筛选出与内皮细胞特异性结合的多肽,其中最具代表性的是可与肿瘤血tt管内皮细胞特异结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列,RGD结合的长循环纳tt米载药系统表现出良好的肿瘤靶向性。Pasqualini等获得一种与肺细胞特异性结合的肽,通tt过与抗腺病毒抗体连接而靶向于细胞膜上二肽酶的递药系统。Wan Xiaomei等也获得一种tt能经鼻腔嗅粘膜入脑的七肽序列。研究显示,经噬菌体展示筛选获得的多肽亲和力高、特tt异性强、安全性好、生物降解和生物相容性优良、合成方便,并易于在末端进行修饰。tt

  与本发明相关的现有技术还有:Ito,et al.The effect of RGD peptide-conjugated magnetite ttcationic liposomes on cell growth and cell sheet harvesting.Biomaterials,2005,26:6185;Trepel ttM,et al.Molecular adaptors for vascular-targeted adenoviral gene delivery.Hum Gene Ther,tt2000,11:1971;Xiao-Mei Wan et al.Identification of nose-to-brain homing peptide through ttphage display.Peptides,2009,30:343。tt

  但目前为止,尚未见通过噬菌体展示技术筛选经血液循环跨越血脑脊液屏障的靶向功tt能基的相关研究和报道。tt

  发明内容tt

  本发明的一方面涉及一种能跨越血-脑脊液屏障的肽,其中所述肽的氨基酸序列为ttTPSYDTYAAELR。所述肽是利用噬菌体展示十二肽库(Ph.D.-12TM Phage display peptide ttlibrary),筛选出的能跨越血-脑脊液屏障的多肽序列。tt

  本发明另一方面涉及一种获得跨越血-脑脊液屏障的肽的方法,所述方法包括i)静脉tt给予噬菌体随机展示肽库,随后从脑脊液中回收噬菌体;ii)将回收到的噬菌体进行扩增并tt再次重复i)的步骤,直至获得能跨越血-脑脊液屏障的共有肽序列。tt

  本发明的另一方面涉及所述肽在制备靶向制剂中的应用。所述靶向制剂如,载药纳米tt粒、脂质体、泡囊或胶束等。所述多肽可修饰于上述纳米粒、脂质体、泡囊或胶束表面,tt从而获得修饰由本发明所述肽的靶向制剂。将多肽修饰于这些制剂表面可通过静电吸附、tt亲和连接或共价连接等,均为本领域技术人员所熟知。tt

  本发明的目的通过下述技术方案予以实现:tt

  首先,采用噬菌体展示肽库逐轮筛选出能跨越血-脑脊液屏障的肽,其包括步骤:采用tttttt体内筛选方法,静脉给予噬菌体随机展示肽库,一定时间后,从脑脊液中回收噬菌体,扩tt增后再次重复一轮体内筛选过程,并进行多轮体内筛选,最终获得能跨越血-脑脊液屏障的tt噬菌体单克隆;测序后即可获得肽的氨基酸序列。噬菌体体内筛选方法,以及噬菌体单克tt隆的测序方法为本领域技术人员所熟知。tt

  所述噬菌体随机展示肽库可以是市售的噬菌体随机展示肽库,例如噬菌体展示环七肽tt库,噬菌体展示七肽库,噬菌体展示十二肽库,或其他适当的噬菌体展示随机肽库。tt

  所述噬菌体随机展示肽库可以静脉给予适当的动物,例如,大鼠、小鼠、兔子、狗、tt羊、猴、鸡等。从脑脊液中回收噬菌体可以通过抽取适当体积的脑脊液,随后与处于对数tt生长期的噬菌体宿主菌大肠杆菌共孵育,从而达到回收噬菌体的目的。脑脊液的抽取方法tt为本领域技术人员所熟知。噬菌体的回收为本领域技术人员所熟知,并将在下文中进一步tt详细描述。tt

  经体内外实验评价,结果证实,本发明所述多肽具有跨越血-脑脊液屏障并富集于脑脊tt液中的特性。本发明所述多肽可用于修饰载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束,构建成脑靶tt向递药系统,该递药系统能够提高药物的脑内递送,增强对于脑部疾病的治疗效果,降低tt全身性的毒副作用。tt

  本发明筛选获得的SEQ ID NO:1的多肽,经过生物信息学分析比对显示,与美国国立tt生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知tt基因和蛋白无同源性。tt

  与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:tt

  1、本发明筛选得到的多肽,分子量小,生物相容性好,合成方便,成本低廉。tt

  2、本发明筛选得到的多肽可以用于脑部疾病靶向治疗载体的构建。tt

  附图说明tt

  图1显示了噬菌体体内筛选第一轮至第三轮筛选回收率。tt

  图2显示了经尾静脉注射后,噬菌体单克隆12-1与随机肽库噬菌体在大鼠CSF中的tt富集效果。tt

  图3显示了TPS肽在裸鼠体内的活体分布。裸鼠尾静脉注射FITC标记的TPS肽,以tt含FITC的PBS尾静脉注射给予对照组裸鼠作为对照。tt

  具体实施方式tt

  下文所述实施例是为了帮助本发明的内容能被更容易地理解,仅为了进一步说明本发tt明,而不意在限定本发明的范围。tt

  下文所述实施例中所用的缓冲液、培养基等说明如下:tt

  LB液体培养基:10g/L细菌培养用胰蛋白胨(Oxford),5g/L细菌培养用酵母提取物tt(Oxford),5g/L NaCl(Sigma)。tt

  顶层琼脂糖培养基:LB培养基+7g/L琼脂糖(Sigma)。tt

  LB/IPTG/Xgal琼脂平板:0.05g/L IPTG,0.04g/L Xgal,15g/L琼脂粉(sigma)。tt

  TBS缓冲液:50mmol/L Tris-HCl与150mmol/L NaCl加去离子水定容,0.103×106Patt高压灭菌30min。tt

  IPTG/X-gal:1.25g IPTG和1g X-gal溶于25mL N,N-二甲基甲酰胺。溶液-20℃避光tt保存。tt

  PEG/NaCl:20%(w/v)PEG-8000,5mol/L NaCl,热压灭菌,室温贮存。tt

  PBS:分别配制0.2mol/L的Na2HP04溶液和0.2mol/L NaH2PO4溶液,常规方法灭菌,tt然后每次取81mL Na2HPO4溶液和19mL NaH2PO4溶液混匀,即得pH7.4的PBS溶液100ttmL;0.2mol/L PBS(4℃下贮存),加入0.85g NaCl,即为0.2mol/L PBS。如配制0.01mol/L ttPBS则取50mL0.2mol/L PBS,加8.5g NaCl,用双蒸水定容至1L即为0.01mol/L PBS。tt

  TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl,pH8.0mmol/L EDTA。tt

  实施例1噬菌体展示随机十二肽库的体内筛选tt

  选用NEW ENGLAND Biolabs的Ph.D-12TM肽库。第一轮筛选方法如下:将NEW ttENGLAND Biolabs的Ph.D-12TM肽库稀释至1×1012pfu滴度,稀释液为TBS缓冲液(三tt羟甲基胺基甲烷,Tris;50mM Tris,150mM氯化钠),大鼠尾静脉注射。12小时后将大tt鼠麻醉,无菌条件下抽取脑脊液50μL。取适量脑脊液用LB液体培养基培养的处于对数生tt长期的ER2738大肠杆菌通过滴定法确定噬菌体的滴度,其余的扩增后用于下一轮筛选。tt以此进行三轮筛选,测定每一轮筛选获得的噬菌体滴度,并从最后一轮结果中随机挑取出tt噬菌体单克隆备用。tt

  实施例2噬菌体滴度的测定tt

  将实施例1中每轮筛选获得的噬菌体用LB液体培养基进行10倍比的稀释,取10μLtt稀释后的噬菌体与200μL对数生长期的大肠杆菌ER2738菌液混匀,加入到50℃预热的ttttttLB顶层琼脂(顶层琼脂:每升含10g胰蛋白胨,5g酵母提取物,5g氯化钠,1g氯化镁tt和7g琼脂粉,高压灭菌后备用)后迅速倒入含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-tt吲哚半乳糖苷(IPTG/Xgal)的LB板,过夜,通过噬菌体蓝斑数来计数。tt

  滴度计算公式:噬菌体滴度(pfu)=100×噬菌斑数×稀释倍数,即每1mL中噬菌体tt形成单位。tt

  展示脑靶向性多肽噬菌体的富集:如图1所示,经过三轮筛选后,由十二肽库筛选得tt到的噬菌体的回收率均比第一轮有了显著提高(p<0.01),表明回收得到的噬菌体得到了明tt显的富集。tt

  实施例3噬菌体DNA提取及测序tt

  从实施例1的第三轮筛选结果中,分别随机挑选出多个噬菌体单克隆,通过DNA提tt取后测序获知展示肽的序列。tt

  将噬菌体单克隆各自进行扩增:将ER2738过夜培养物按1:100稀释后接种于LB培养tt基,分出1mL到培养管中,将需要鉴定的噬菌体单克隆按每管一个克隆接种,37℃摇床培tt养5h。培养液离心后将500μL上清转入干净离心管内,得扩增噬菌体贮液。每个管内加tt入200μL聚乙二醇/氯化钠(PEG/NaCl),颠倒混匀后室温放置15min;离心10min,弃去tt上清液。将沉淀物重悬于100μL碘化物缓冲液中(碘化物缓冲液:10mM Tris-HCl pH8.0,tt1mM乙二胺四乙酸-EDTA,4M NaI)。加入250μL乙醇;室温温育10min。短时间的tt室温温育使单链噬菌体DNA沉淀,而大多数噬菌体蛋白可以保持在溶液中。离心10min,tt弃上清,用70%乙醇洗沉淀,短暂真空干燥。沉淀重悬于30μL TE(10Mm Tris-HCl pH8.0,tt1mM EDTA)中。tt

  取5μL上述模板溶液以进行自动循环双脱氧测序,以-96作为自动测序的引物。(-tt96gIII测序引物:5’-OH CCC TCA T AG TTA GCG TAA CG-3’,100pmol/μL,1pmol/mL)。该tt引物距目的片段相距96bp,测序结果如表1中SEQ ID NO:1~10所示。tt

  表1.SEQ ID NO:1~10噬菌体展示肽的氨基酸序列测序结果。tt

  *加粗部分显示的是噬菌体展示的共有序列tt

  从表1可以看出,通过三轮体内筛选获得了一条共有肽序列:TPSYDTYAAELR,将该tt肽命名为TPS肽,将展示该肽的噬菌体单克隆命名为单克隆12-1。tt

  实施例4单克隆噬菌体的扩增及脑脊液中的回收率tt

  将实施例1中所得的噬菌体单克隆12-1进行扩增。取单克隆12-1的感染菌液1mL加tt入200mL LB培养液中,37℃摇床内过夜培养。8000rpm离心20min,沉淀菌体后获得含tt噬菌体的上清,加入1/6体积的PEG/NaCl,4℃沉淀过夜。12000rpm离心20min,取沉淀,tt以TBS缓冲液稀释,5000rpm离心15min后取上清。再次加入1/6体积的PEG/NaCl,冰tt浴1h,12000rpm离心20min,沉淀用TBS重悬后即得噬菌体单克隆的扩增液,用实施tt例2的方法测定噬菌体的滴度。tt

  用TBS混合1012pfu的噬菌体单克隆12-1,通过SD大鼠尾静脉注射,此外将噬菌体tt十二肽库的噬菌体作为对照,同样以1012pfu的滴度给予对照组大鼠。1h后将大鼠麻醉,tt抽取适量脑脊液并以10倍倍比稀释后按照实施例2的方法进行滴度测定。计算单位重量tt脑脊液中噬菌体的回收率(pfu/g)。由图2结果可知,噬菌体单克隆12-1所展示的肽在大tt鼠脑脊液中得到了十分显著的富集,说明TPS肽能够协助噬菌体跨越血-脑脊液屏障。tt

  实施例5噬菌体展示肽的活体分布观察tt

  利用FITC标记TPS肽以考察所述肽在裸鼠体内的动态分布情况。任意选取一只裸鼠,tt尾静脉注入上述FITC标记的TPS肽,所述肽分散于PBS中。选取1只裸鼠作为对照,尾tt静脉注入含有等量FITC的PBS。注射1h后,利用小动物活体成像仪进行观察并拍照。选tt择695nm作为发射光波长,固定每次爆光时间为60ms。结果显示,经TPS肽在脑部的荧tt光强度显著优于对照,表明本发明筛选获得的噬菌体展示肽具有良好的脑内递药性能(如tt图3所示)。tt

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