一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法
技术领域t
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用定点切割系统对猪H11位点定点插入方法以及所设计的打靶载体。t
背景技术t
已知在生物技术研究中，将目的基因插入到染色体基因组中，可以采用同源重组的办法或使用转座子的办法，但实践表明，同源重组的效率较低，操作麻烦，并且由于目的基因的插入而使原有的基因遭受破坏；使用转座子的方法，也存在插入到染色体的部位是随机的，而且使用的操作转座酶价格昂贵。t
因此，由于上述技术使用的局限性，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，相应的使用该技术得到的重组体是后续的繁育与表型分析非常繁琐。t
2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。实验证实Hipp11位点定点基因修饰的小鼠与野生型小鼠生长发育无区别。目前类似的还有Rosa26位点，但是该位点为一个基因，其启动子为全身性广谱表达，难以做到组织特异性表达，然而H11位点则不存在类似的困难，由于其位于两基因之间，并且不存在启动子，所以可以选择实验所需的启动子完成目的基因的时空特异性表达，更好的达到任务目标。如果在猪的基因组中定位hipp11这样安全有效的基因修饰位点，将有利于稳定转基因猪培育的技术体系。t
ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有 一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。t
发明内容t
本发明的一个目的是提供了一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，以解决目前的技术随机插入、步骤繁琐、价格昂贵等缺陷。t
为实现上述目的，本发明所提供的方法包括以下步骤：1)设计被敲除基因的5’端同源臂和3’端同源臂以及相应的通用引物；2)将上述同源臂、通用引物和/或欲插入的基因引入到载体中，得到打靶载体；3)转染细胞；4)PCR扩增鉴定插入结果。t
其中，上述的5’端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。t
其中，上述的5’端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列2所示。t
其中，上述的3’端同源臂的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。t
其中，上述的3’端同源臂的通用引物核苷酸序列如序列表中序列4所示。t
其中，上述步骤4)中所用到的PCR扩增引物的核苷酸序列如序列表中序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10所示。t
本发明的另一个目的是提供了一种打靶载体，该载体是依托CRISPR/Cas9打靶系统所设计，它能够将外源基因精确的引入到猪的H11位点中，以解决传统打靶技术效率低下，PCR检测引物不便设计，检测难度大的问题。t
为实现上述目的，本发明提供的打靶载体序列包括上述的5’端同源臂序列、5’端同源臂通用引物序列、欲插入的基因序列、3’端同源臂通用引物序列、3’端同源臂序列。t
可进一步优化为，上述打靶载体还可以包括筛选元件Neo基因序列和/或DTA基因序列。t
上述打靶载体中还可以不包含筛选元件。t
进一步的，其核苷酸序列如序列表中的序列11所示。t
本发明的再一个目的是将上述重组质粒应用到构建猪定点突变库的构建上。t
本发明提供的一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，实现 了简单、快捷、高效的基因定点插入。本发明依托切割系统对猪H11位点设计的打靶载体，它能够将外源基因精确的引入到猪的H11位点中，以解决传统打靶技术效率低下，PCR检测引物不便设计，检测难度大的问题，且效率高，同时通过针对该位点设计的通用检测引物，使筛选检测难度大大降低。t
此外通过实施例可知，所述打靶载体转染细胞,通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆,得到的阳性克隆富集效率高,细胞筛选方法简单,不需大量人力物力,极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定,大大降低了基因打靶的成本，同时能让外源基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。t
附图说明t
图1为本发明的打靶载体结构示意图；t
图2为PCR扩增鉴定结果图；以及t
图3A和图3B为阳性克隆的荧光激发图；其中图3A为可见光下的细胞显微观察图，图3B为紫外光下的细胞显微观察图。t
具体实施方式t
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。t
如背景技术中所提到的，在培育猪的优良品种时，主要采用随机整合的方式使外源基因随机插入猪基因组中，为后续分析带来个麻烦，为了克服上述缺陷，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种借助定点切割系统对猪H11位点定点插入的方法，该方法的关键之处是依据切割系统对猪H11位点设计了一种打靶载体，该打靶载体是将两端连有被敲除基因的同源臂以及相应通用引物的欲插入基因引入到PLHG-4中获得的。上述的同源臂是依据要敲出的基因设计得到的，其中5’端同源臂的序列如序列表中的序列1所示，相应的通用引物序列如序列表中的序列2所示；3’端同源臂的序列如序列表中的序列3所示，相应的通用引物序列如序列表中的序列4所示。将上述同源臂分别插入到载体PLHG-4中，得到打靶载体，该打靶载体中还含有筛选元件Neo基因序列和/或DTA基因序列。 将上述打靶载体转染细胞即可得到重组细胞，利用该方法构建定点基因突变库时我们只需要将我们感兴趣的基因插入到同源臂间就可以完成我们欲插入基因的定点插入。t
上述方法获得的打靶载体中含有通用引物，大大降低了筛选检测的难度与工作量。并且设计的两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子,在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。上述打靶载体转染细胞,通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆,得到的阳性克隆富集效率高,细胞筛选方法简单,不需大量人力物力,极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定,大大降低了基因打靶的成本，同时能让外源基因稳定在H11表达，为转基因搭建了稳定的平台。下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。t
实施例1t
借助定点切割系统对猪H11位点定点插入绿色荧光蛋白的方法，包括如下步骤：t
1、打靶载体构建t
(1)合成片段t
依据猪H11位点的DNA序列设计3’端同源臂(序列3所示)、相应的通用引物(序列4所示)以及在两端分别加酶切位点：MluI(ACGCGT)与FseI(GGCCGGCC)加入，合成片段如下：t
ACGCGTttcccgaggctGagttagttgGtccagccagtgattgagttgcgtgcggagggcttcttatcttagTTTTATAGGCTACACTGTTAACACTCAGGCTGTTTTCTACCGTTTAGTCAAAATATAGTCACCTTGCCTGCTTCACCTGTCCATCAGAGAATGGCCTCATTAATTGACTCTCTAGTATGAAGTCAAAGTAGCTTTGGTGGCCCTAAATGGACAAGTATCAAGAGACTGGGTGAATTGAGGAGCTTGAGACTGTCACCTCAGATCGAAAAGACTGAAAAATCACCTCAGATCAAAAAGACTGAAAAATCTTCAGTCTGGAAAGGGGACTCAAAACCATAATTAGAGTATTCTGGTAGAATCCTTTTCTCCACTGTTATTCATACAGTTAAGGTGAATAACTAAAAGTAATTGTGAGCTGAGGAGTAAGATACAACACACAAGGAATCAGTTAACAGAGTCTCGAGTGAAATTATAAATGGAAAGAATTATGACTTGAATCATAACTCTGAGGCCCCATTTTCCCTAACAACTTTTGTCCCAAT AAACGTGGGTATTTGTTTGGGAGAAACTATCATATACATGATTACCCAGTAAACAGACTGTTTACTAAGTGGGTTTAATTTTAGAAATTGCGCGCTGCAATCTGGTATTAACCATACAACTACCTACCTATAGGGTCAGCCCAGCCTGAACTATCCCATTGGGGTCTTTATTAAGGCTCAAGAAACGGCCATAGCTTCTTCCTTTAAAATGAGTGTTTATTTCTATGAGCTTTAAAGAAAAAAACAGATAATTTCCCTCAACCTACTGAAGAGGAAGGGATTCAGGAAGAAATAAACACAACAATGCCATTCACTTCAGGCCGGCC t
(2)用MluI(ACGCGT)与FseI(GGCCGGCC)酶切连入载体pLHG-4(回收9kb左右大小片段，pLHG-4序列见序列表中序列12所示)中(pLHG4构建步骤参见李和刚博士学位论文)，得载体命名为pLHG-H11-AR，序列如下：CTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGC GTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTACTTAAGGGCGCGCCATGAGATGAACTGCTCTGGGATGCCTAGGTAAATTTCTCTGCATTTCAGTTTCTTTTTAGGAAAGTCAGAACTGTTCCTTGCAAGATGAGTTCTGAGAACAGAATGTGTTGCAGAAAGTACTGGAGTCTTTCTAAAAATTTATCCTATGATATTTCCAAGAGACATGGTCACCCTTAAGCAAAGTTATACAAGTATTCATGGTCAATTAATACCATTTGGGGGGGTGTCTTTTTTCTAGGGCTGCACCCATAGCATAAGGAGGTTCCCAGGAGGTGTGGCCGTCAGCTTATGCCACAACCACAGAAACACCAGATCCAAGCGGCATCTGTGACCTATACCACAGCTCATAGCAACGCCAGATCCTTAGCCCCCTTGATTAAAGCCAGGGATCAAACCTGCCTCCTCAAGGATGCTAGTCAGACTCGTTTACTCTGAGCCACGACAGGAACTCCAAGTAATACCATTTTTAATCTGGAAAAAAATCTAAATATCATTAAATCCAACCTTGTTATTATAAAAGAAGGTACCCCATAGCAAAGGTAGCTAATTCATTCAACTAATGTGCAGCTCATTAAGGGTGGAGCTGGGAAGTGAGATCTCCTACTTAGCGTCACATGCCACCTTGCCTAATAATGATGTATTTGTCTATCAAATGCCTACAAAGACATACAGAGTCTCTCCCTGGACAGTTTTCATTTTATTATGTGATCGTTACTACCCCAAAGATTTCTTTCTTGATTTTATTTTGTCCCTCATATTCTGTCTGTCATCCCTACATTCAGATATCAGAGGTGGGGGTATTGGGGAGGGGGAGATGAGGAGAGGAAAAGGATTGGTTGGTGCATGGCCAGTCAAGTTGAAGATGACTGCAACAATCACGAGAAATCTCTGCAAAACTATAAAAGCTTCCTGGGGTGCCTTCTGAAAAAGTCTGATCCAAGTTGCTTTATTAGGGCCTGGACCATTTCTAGAAGTAGATGAATGCATTCCTTTCATTGGCTAGGAGGTGGGGATGGGGCAGAGAGCATACTTCTGTTTCTGCAGCTGAGACCTGGACATGGTGAACCTGGAGTAGCTACCCATATGGCATGGACAGGTCCAACTGCTGCCCCCTCCTTTGTCCCCCAAGAAGCCAGCAGGGGCAGGATGAAGGCCACCTTGGGGCTGCCCTGAGCCTCCTGCAGTATGCCTGGCAACTACTTTCTTAGCCATCTTTAAGGCCCAATCTTGGGTAAAATACTACTCAACCCATTCTTTAGCCACCTTCTCCAAATGCTTCTAGAAAGCGGCCCCCACAAGTAGGTTCTCTGCAGCAGCACAGTGCAAATGGAGGAACACGACCTCAGTAATTATTTTGTCACTGCAAAGTATCTACAACCTTTGCTATAAAAATTAACACCTTGCTTTCCCTGAAAAATAGCCCAGTCATATCCAGCATTTTCCAGCATCCAGGGCAGAGTGCTTGCTCCTCCCCCAGTCAA CAGGACTGTTCATACCGAGGAAATGATTTGAGGGTTCTTTAAGCATTTACGCTGTTAATGCTAAAGCTTTCACGACTTCTACCTGAGGGGGGCTTGAGGGAGGGGGGAGGTTTATGTCCCTGCACCGCCAGGAGCCTGGTCTTTGGTAGGAACGCAGAGGCAGCCGGCGACCTTCCACCCTCAGTGTGTCCTTCCCCAGGAGTTTAGGGAAGTGAATCCCTAGATCCAGCCAACATTTCCACTCCCATTTTCAAGAGATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGAAAGCATCGGCAGGTCAGCAAACCAGCAGTTCTCCATCCTTGGGATCTTAGCAGCCGACGACCTTAATTAAACGCGGTGGCGGCCGCATTACCCTGTTATCCCTAGAATTCGATGCTGAAGTTCCTATAGTTTCTAGAGTATAGGAACTTCGGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCCGGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATGCTAGCTTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCACGTCCCCGTGGTTCGGGGGGCCTAGACGTTTTTTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGCACCGAGGCCCCAGATCAGATCCCATACAATGGGGTACCTTCTGGGCATCCTTCAGCCCCTTGTTGAATACGCTTGAGGAGAGCCATTTGACTCTTTCCACAACTATCCAACTCACAACGTGGCACTGGGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATCTTATACACGTGGCTTTTGGCCGCAGAGGCACCTGTCGCCAGGTGGGGGGTTCCGCTGCCTGCAAAGGGTCGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGCTTCCAGAGGAACTGCTTCCTTCACGACATTCAACAGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAGGGGAAAGACCCCTAGGAATGCTCGTCAAGAAGACAGGGCCAGGTTTCCGGGCCCTCACATTGCCAAAAGACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGGGGGGGGAGAGGGGCGGAATTGGATCCGATATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCG AACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATCTTAAGGATCTGACGGTTCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTATTGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGAGATCTGAAGTTCCTATAGTTTCTAGAGTATAGGAACTTCGGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTttcccgaggctGagttagttgGtccagccagtgattgagttgcgtgcggagggcttcttatcttagTTTTATAGGCTACACTGTTAACACTCAGGCTGTTTTCTACCGTTTAGTCAAAATATAGTCACCTTGCCTGCTTCACCTGTCCATCAGAGAATGGCCTCATTAATTGACTCTCTAGTATGAAGTCAAAGTAGCTTTGGTGGCCCTAAATGGACAAGTATCAAGAGACTGGGTGAATTGAGGAGCTTGAGACTGTCACCTCAGATCGAAAAGACTGAAAAATCACCTCAGATCAAAAAGACTGAAAAATCTTCAGTCTGGAAAGGGGACTCAAAACCATAATTAGAGTATTCTGGTAGAATCCTTTTCTCCACTGTTATTCATACAGTTAAGGTGAATAACTAAAAGTAATTGTGAGCTGAGGAGTAAGATACAACACACAAGGAATCAGTTAACAGAGTCTCGAGTGAAATTATAAATGGAAAGAATTATGACTTGAATCATAACTCTGAGGCCCCATTTTCCCTAACAACTTTTGTCCCAATAAACGTGGGTATTTGTTTGGGAGAAACTATCATATACATGATTACCCAGTAAACAGACTGTTTACTAAGTGGGTTTAATTTTAGAAATTGCGCGCTGCAATCTGGTATTAACCATACAACTACCTACCTATAGGGTCAGCCCAGCCTGAACTATCCCATTGGGGTCTTTATTAAGGCTCAAGAAACGGCCATAGCTTCTTCCTTTAAAATGAGTGTTTATTTCTATGAGCTTTAAAGAAAAAAACAGATAATTTCCCTCAACCTACTGAAGAGGAAGGGATTCAGGAAGAAATAAACACAACAATGCCATTCACTTCAGGCCGGCCTCTAGAATGCATGTTTAAACAGGCCGCGGGAATTCGATTATCGAATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGGTCCTCGCCATGGATCCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATT GGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCTCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCAGATCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTATTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCC t
(3)合成片段t
依据猪H11位点的DNA序列设计5’同源臂(序列1所示)、相应的通用引物(序列2所示)加入RFP编码序列、polyA序列以及在两端分别加入酶切位点：AscⅠ(GGCGCGCC)、PacⅠ(TTAATTAA)，合成片段如下：t
GGCGCGCCCATTGAGCCACGAACAGAACTCCCTCTTACCAACTTATTACTACTAACTTCCCAAGTACTGGCTGCTCAGCTGCTTCCTTGGGCATGGGGGAGGGAGCACTATTTTTTCCTCTCCTGACTTCATCCTCTTCCTTTTAATTTCCATAAGGTTCCCTGTGGCCCTGTGCTTTTTTATTTTGAGGCCTTGCACATCCTTCTGGCCCTGATTGCTTCTCAACTCATCTTGTGCCTGCTGGACTTCCACCGTTGTTTCATGTATCTCGTTAGCTGAGATAGCACTTCCTCCTGCCCTTACCCTTTATCTGGCTCTTAGCTCCTGAAAACTGCATTATTAGCTTCCTCTTTTGCCTCTACTCTTACTCAACCAAAATTGTTTTAAGATCTGTGGATCTAGCTTCTGCTGTGCTATTCTTAGGAACACTTTTATTTCCTCTTAGCTCCATCTCACCAGTTATTGGCTAATGGCTTTGCTTGGTACCTACATCTGTACATTTCTTTCGTACTAGCTTCTAGACTGAAAAAGGACTGTTGGTTCAACATGAAAGGGAAGGAGGTAAAAGAGGACACACAGGAAAGATGGATTGGGATTCAGGTCTCTGCTGTTGTTACTTGAGATTGCTTTCTAGATTCTACTTGTGGAAACAAAAAGCCTTTGCGAGAATTCTAAACTGGAGTATTTCTGTAATTGAGGAGTCTTGCTCAGCAAATCCCACTTAGGGGACTAATGAAGTACCAGGAAGAGACAGACCATGCTCAATCCACAAAGCCAGGTTTTACTGAAATGTGACCTACTTTCTTAT GCGATCGCCTgccgaaagagtaatgTtggCCgagataggagaagacGatgatatcacgctacgacggaaac AGTACTATGGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCG TAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTCAAGACCACCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAGACCGACATCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAAGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA TTAATTAA t
(4)用AscⅠ(GGCGCGCC)、PacⅠ(TTAATTAA)双酶切上载体与pLHG-H11-AR(回收8kb大小片段)，并连接，得终载体pLHG-H11，(用BclI(TGATCA)进行线性化酶切)序列如序列表中的序列11所示：t
2、载体效率验证t
(1)分离猪胎儿成纤维细胞。t
从流产的猪胎儿中分离得到PEF细胞，具体分离方法参见文献：李红，魏红江，许成盛，汪霞，卿玉波，曾养志；版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特征。t
(2)线性化t
利用BclI(NEB,R0160S)对pLHG-H11酶切线性化，利用天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209)，回收片段用于下一步实验，具体操作方法参见试剂盒说明书。t
(3)核转染t
将重组质粒Cas9/gRNA-H11-g1与线性化的pLHG-H11各2.5μg通过电转化的方式共同转染PEF细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤是：使用核转仪(Amaxa，型号：AAD-1001S)及配套的哺乳动物成纤维细胞转染试剂盒(Amaxa，货号：VPI-1002)进行转染。首先使用0.1％胰蛋白酶(Gibco，货号：610-5300AG)消化贴壁细胞，用胎牛血清(Gibco，货号：16000-044)终止消化，磷酸盐缓冲液(Gibco，货号：10010-023)洗涤细胞两次，添加转染试剂，使用程序T-016转染细胞。t
(4)细胞筛选t
电转后，将得到的重组细胞30℃培养72小时，然后收集细胞。对细胞进行 稀释，每个10cm培养皿铺一定数量的细胞，每2-3天换一次培养基。t
铺板约10天后，细胞单克隆开始形成，收集每个单克隆一半的细胞量用于基因组提取，剩下的细胞继续培养。一共收集克隆132个。t
(5)细胞阳性鉴定 t
利用下列通用引物进行PCR扩增，扩增序列为：t
表一：PCR扩增所使用的引物t
请补充做电泳的步骤，电泳结果见图2，图2中P1表示引物H11-L-F1与H11-L-R1扩增出片段，大小为1.2kb，P2表示H11-L-F2与H11-L-R2扩增片段，P3表示H11-R-F3与H11-R-R3扩增片段。t
通过经PCR鉴定可得出，132个克隆中得到阳性克隆31个(3对引物均扩出)，所得阳性率为23％，将筛选出的阳性克隆置于紫外光下激发，结果见图3A和图3B，从图3A和图3B可见筛选出的阳性克隆均能激发绿色荧光，由此可见该载体能很好的用于H11位点的定点敲入。t
实施例2t
用实施例1中相同的方法构建不含有筛选元件DTA的基因序列的打靶载体，将该载体与CRISPR/Cas9系统共转PEF细胞(转染体系与方法与前相同)，在37℃下培养3天后，按以下方法进行筛选：t
筛选方法与有DTA的方法相同，具体操作参见实施例1。该方法也能筛出阳性克隆，其中共挑取192个克隆，其中有104个阳性克隆，效率为54％，该实验证明无DTA的情况下也能够获得阳性克隆。t
用实施例1中相同的方法构建不含有筛选元件DTA和Neo的基因序列的打靶载体，将该载体与CRISPR/Cas9系统共转PEF细胞，转染体系与具体方法参 见实施例1。无DTA与Neo基因筛选方法如下:在上述转染3天后，每板100个细胞铺于10cm培养皿中，在完全培养基条件下培养10天后，挑取克隆，共挑取362个克隆，得到22个阳性克隆，具体操作参见实施例1，阳性率为6％，该实验结果表明在没有筛选基因DTA和Neo存在的情况下也是能够进行有效的阳性克隆的筛选的。t
