用于检测子宫内膜癌的DNA探针、基因芯片及其应用
技术领域t
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测子宫内膜癌的DNA探针、基因芯片及其应用。 t
背景技术t
子宫内膜癌,又称为子宫体癌,是指原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,多数起源于内膜腺体,称子宫内膜腺癌或子宫内膜样腺癌,是女性生殖道最常见的三大恶性肿瘤之一，占女性全身恶性肿瘤7％,占女性生殖道恶性肿瘤的20％～30％,多见于老年妇女。近年来发病率在世界范围内有上升趋势,仅次于子宫颈癌,而5年生存率却逐年下降。子宫内膜癌主要是根据病史、临床检查、病理检查及各种辅助检查结果确定诊断及临床分期，现今主要检测方法包括B超检查、诊断性刮宫、宫腔镜检查和淋巴造影，检出率不高，而且容易给病人造成痛苦。目前，子宫内膜癌尚没有有效早期诊断与预后指标。 t
基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借助核苷酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。 t
基因芯片起源于20世纪80年代，近年来得到了迅猛的发展，但主要是应用于医药和研究领域，应用于子宫内膜癌的早期检测在我国尚属首次，这将会极大促进子宫内膜癌早期诊断的发展。 t
发明内容t
本发明提供了用于检测子宫内膜癌的DNA探针、基因芯片及其应用，应用该探针和基因芯片检测子宫内膜癌特异性好、灵敏度高、准确率高。 t
本发明的用于检测子宫内膜癌的DNA探针包括27个基因片段，参见序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.27所示序列,其中第27种基因片段为质控基因。这27个基因片段是 针对子宫内膜癌的27个指标而设计的，利用27个基因片段共同来检测子宫内膜癌基因表达谱的改变，进而对子宫内膜癌进行侦检和预后监控。表1为27个基因片段的名称以及对应的特异性引物。 t
表1 27个基因片段及其对应的特异性引物 t
本发明所述DNA探针可应用于生物芯片技术(包括基因芯片技术、蛋白芯片技术、组织芯片技术、细胞芯片技术等)、聚合酶链反应(PCR)、核酸分子杂交技术以及其他病原体基因诊断技术。 t
本发明结合基因芯片技术，可实现小样本、高通量、特异、快速、自动化检测子宫内膜癌的目的。 t
本发明提供一种用于子宫内膜癌检测的基因芯片，，通过将特异性寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成，所述寡核苷酸探针包含具有SEQ ID No.1-SEQ ID No.26所示序列的DNA探针。 t
作为优选，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒或塑料片。 t
本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相载体经不同的化学修饰后，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团，这些基团包括但不限于氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。 t
本发明所述基因芯片在所述固相载体上连接针对子宫内膜癌的特异性核酸探针，所述探针可以为单链或双链DNA分子，其在适当的条件下可以与子宫内膜癌基因特异性杂交。所述探针可以通过DNA自动合成或PCR扩增而获得。 t
作为优选，所述固相载体表面还固定有阳性对照探针、阴性对照探针。 t
其中，阳性对照探针为人的GAPDH，ACTIN基因片段。 t
阴性对照探针不含任何基因序列。 t
本发明还提供一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒，包括：与子宫内膜癌特异性结合的探针，所述探针具有序列表SEQ ID No.1-SEQ ID No.26所示的核苷酸序列。本发明所述试剂盒优选还包含用于对子宫内膜癌基因扩增的引物。 t
本发明还提供一种对可能患子宫内膜癌的样品进行检测的方法，包含以下步骤： t
步骤1：提取并扩增样品的核酸序列，所述扩增将分子信标到扩增产物； t
步骤2：取步骤1所得扩增产物与固定于所述基因芯片上的探针进行杂交； t
步骤3：根据所述信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析。 t
可用于该基因芯片中的探针标记技术有:放射性核素标记、生物素标记、地高辛标记、荧光素标记、胶体铁标记、胶体金标记、联合标记及其他可用的标记技术。 t
作为优选，步骤1扩增步骤所用的引物为5’-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GT-3’。 t
本基因芯片的检测样本可以为子宫内膜癌新鲜组织，也可以为子宫内膜癌患者的宫腔脱落细胞。 t
为保证基因芯片的质量，应注意以下事项： t
1、样品核酸的提取：提取的核酸必须具有较高的纯度(OD260/0D280比值应大于1.50)和一定的量(应为10ng-100ng)，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后面的杂交出现非特异点。 t
2、样品核酸的标记：掺入的标记物必须达到一定的浓度(每个反应掺入的标记物为0.1-1μg)，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性。 t
3、同源核酸杂交：应掌握杂交温度控制在42℃左右，温度过低，会出现非特异杂交点，使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。 t
本发明的有益效果为： t
1、特异性好：现有的子宫内膜癌的诊断仅是检测一个或几个指标缺乏特异性，所以容易引起误诊，尤其是早期子宫内膜癌的误诊率更是高达70％以上。本发明用于检测子宫内膜癌的DNA探针和基因芯片可同时检测子宫内膜癌病原体的26个指标，特异性高达95％。 t
2、灵敏度和准确率高：敏感性达95％，临床符合率(准确率)达95％。 t
3、可对子宫内膜癌进行快速侦检和预后监控。 t
4、可用于各种类型的子宫内膜癌的诊断和预后监控，尤其可用于早期子宫内膜癌的诊断。 t
5、基因芯片设有阳性和阴性对照，可避免环境和人为因素造成的错误的诊断，准确率高。 t
6、常规检测需要一周的时间，而本发明的基因芯片只需8个小时左右。 t
7、本发明的基因芯片的灵敏性比PCR技术高1000倍，为0.1pg。 t
8、信息量大：PCR一次只检一种指标，而芯片一次可检测20～30种指标。 t
附图说明t
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： t
图1为基因芯片样式设计图； t
图2为基因芯片检测结果(左侧图中为正常样本检测结果，右侧图中为肿瘤样本检测结果)； t
图3为基因芯片重复性检测结果(图中每列检测不同基因，每行为同一基因的重复)。 t
具体实施方式t
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 t
实施例1 t
1、材料和方法 t
1.1 材料 t
1.1.1 试剂 t
主要试剂RNA提取试剂(Trizol Reagent)、饱和酚、DEPC、DNA marker、Oligod(T)18购自上海生工。逆转录酶M-MLV(RNase H-)、Taq酶、Agarose Gel,RNA酶抑制剂、琼脂糖(Agarose)均购自大连宝生物公司。DNA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司；DIG DNA标记试剂盒、地高辛杂交检测试剂盒购自购自深圳依诺金生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成；其他试剂均为国产分析纯。 t
预杂交液的配制：(6×SSC，5×Denhardt’s试剂，0.5％SDS，50％(v/v)甲酰胺，ddH2O，100μg/ml鲑鱼精在DNA变性后加入。注：每平方厘米尼龙膜需预杂交液0.2ml。 t
杂交液的配制：在上述预杂交液中加入探针，探针终浓度为25ng/ml。 t
1.1.2 临床资料 t
(1)子宫内膜癌新鲜组织样本：组织标本取自兰州大学第二临床医院在2011年10月-2012年4月期间手术切除的新鲜子宫内膜癌标本,前均未做化疗或放疗,术后经病理证实,同时距肿瘤边缘5－10cm以上切取正常组织(术后病理证实无癌细胞侵润)作为对照。标本离体后5min内即投入液氮罐内冻存。 t
(2)子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本：检测样本为甘肃省兰州大学第二临床医院在2012年4月-2012年10月期间子宫内膜癌及正常人宫腔脱落细胞样本的100例细胞检测样本(其中子宫内膜癌样本50例)分别用潜血和芯片方法进行对比检测，保存于-80℃。 t
1.1.3 仪器和设备 t
仪器和设备：PCR仪购自杭州郎基；点样器和杂交仪购自博奥生物集团有限公司；扫描仪为欣康基因数码科技有限公司制造。 t
2.引物设计 t
确定子宫内膜癌肿瘤标志物数条序列，然后使用DNAStar分析设计出这些引物。具体引物见表1。 t
1.3 基因芯片的制作 t
1.3.1 子宫内膜癌核酸的提取(子宫内膜癌新鲜组织样本) t
(1)从液氮中取出冻存的新鲜组织200mg,在液氮预冷的研钵中研碎组织,采用Trizol法提取组织总RNA,测定总RNA纯度并用Oligo dT纤维素层析法纯化mRNA。 t
(2)使用逆转录酶M-MLV反转录合成cDNA的第一链,用于制备探针模板。 t
1.3.2 核酸探针的扩增 t
(1)以1.3.1所获得的核酸为模板，使用表1所设计的引物，分别扩增出片断，以作为探针；扩增片段具体序列为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.27所示序列。 t
(2)PCR反应体系50.0μL,包括10×Buffer 5.0μL,25mmol dNTPmixture0.5μL,TaqDNA酶1.0μL,目的引物上下游各1.0μL,cDNA模板1.0μL,三蒸水40.5μL，反应条件:94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环；72℃10min后终止反应。 t
(3)利用小片段DNA纯化试剂盒对获得的27种基因片段PCR产物进行纯化。 t
上述核酸探针还可以通过DNA自动合成的方式获得。 t
1.3.3 点膜 t
通过微量点样器将所获得的探针点在预处理的尼龙膜上。 t
根据图1所示芯片样式设计图，用手动点样仪进行芯片点样。操作程序:(1)GAPDH,ACTIN,CYCLIND1等27种基因的点样液在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(2)尼龙膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干。(3)每点1μl把上述探针片段点在尼龙膜上(每张尼龙膜面积大约20cm2)。(4)湿膜在紫外灯下照5min，取出让膜自然干燥。 t
1.4 样品的处理 t
1.4.1 样品核酸的提取(子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本) t
(1)子宫内膜癌新鲜组织样本：从液氮中取出冻存的新鲜组织200mg,在液氮预冷的研钵中研碎组织,采用Trizol法提取组织总RNA,测定总RNA纯度并用Oligo dT纤维素层析法纯化mRNA。使用引物5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CGC GGG-3’和5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3，反转录合成cDNA的第一链。 t
(2)采用Trizol法提取子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本总RNA,使用引物5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CGC GGG-3’和5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3，反转录合成cDNA的第一链。 t
1.4.2 样品核酸的扩增 t
(1)以1.4.1所获得的核酸为模板，使用设计的通用引物5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GT-3扩增出基因片段，以作为检测样品。 t
(2)PCR反应体系25.0μL,包括10×Buffer 2.5μL,10mmol dNTPmixture 0.5ul,地高辛-11-dUTP 0.5ul，TaqDNA酶0.5μL,通用引物上下游各0.5μL,cDNA模板5.0μL,三蒸水15μL，反应条件:94℃预变性5min；94℃变性30s,65℃退火30s,68℃延伸500s,30个循环；72℃10min后终止反应，产物不需要纯化。 t
1.5 利用本发明所述探针进行样品的检测 t
本发明中所述的杂交条件和方法是本领域中已知的。具体为：加500μl预杂交液(6×SSC，5×Denhardt’s试剂，0.5％SDS，50％(v/v)甲酰胺，ddH2O，100μg/ml鲑鱼精DNA变性后加入)于基因芯片上，42℃处理40min。取20μl 1.4.2的产物于1.5ml的离心管内,100℃变性10min，-20℃冷却5min，加杂交液(在上述预杂交液中加入探针，探针终浓度为25ng/ml)450μl,混匀,于基因芯片上,42℃杂交1h。分别用2×SSC,0.1×SDS 和0.1×SSC,0.1×SDS各洗三次，加400μl3％BSA,42℃封闭30min，450μl缓冲液中加1.6μlAV-AP,42℃酶联20min，先用洗涤液洗膜三次,后加入显色液(450μl底物液+1.6μlBCIP+1.6μlNBT),常温或42℃显色3～5min。用蒸馏水或自来水冲洗,终止显色。 t
1.6 杂交结果的分析 t
将杂交完毕晾干的DNA阵列用芯片扫描仪进行扫描分析，根据大量样品的分析，阴性对照灰度值小于0.05，阳性对照GAPDH灰度值大于0.3判为数据有效；通过其余26个基因灰度值变化对样本结果进行判断。 t
将样品同时进行PCR或RT-PCR和其他检测方法以进行比较。结果参见表2。 t
表2 应用本发明的基因芯片和荧光定量PCR同时检测样品结果 t
其中，阳性对照为人的GAPDH，ACTIN基因片段；阴性对照不含任何基因序列,加入反应系统,以监视标记和杂交、显色系统是否有效。 t
2 结果 t
2.1 准确率检测的结果 t
我们针对性的分别对GAPDH,ACTIN等27种基因进行了检测，杂交结果：30张芯片分别出现GAPDH,ACTIN等27种基因特异性杂交点,检测结果如图2，没有非特异性杂交点的出现。 t
2.2 重复性检测结果 t
同时各取1个样本进行3次重复性检测。结果如图3。 t
2.3 检出率的检测结果 t
利用我们研制的子宫内膜癌基因诊断芯片对50例患者的宫腔脱落细胞进行检测，发现48例检测为肿瘤，1例为可疑，1例为正常；其特异性达95％、敏感性达95％、临床符合率(准确率)达95％，基本上达到设计要求。 t
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 t
序列表t
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<110> 兰州百源基因技术有限公司t
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<120> 用于检测子宫内膜癌的DNA探针、基因芯片及其应用t
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<170> PatentIn version 3.5t
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agaccagacc agcaggagat agaaccttcc agaagtgggc agctgtggtg gtgccttctg 60t
t
gagaagagca gagatacaca tgccatgtac agcatgaggg gctgccgaag cccctcaccc 120t
t
tgagatggga gccgtcttcc cagtccaccg tccccatcgt gggcattgtt gctggcctgg 180t
t
ctgtcctagc agttgtggtc atcggagctg tggtcgctgc tgtgat 226t
t
t
<210> 21t
<211> 173t
<212> DNAt
<213> CD151t
t
<400> 21t
gtatcctcgc ctacgcctac taccagcagc tgaacacgga gctcaaggag aacctgaagg 60t
t
acaccatgac caagcgctac caccagccgg gccatgaggc tgtgaccagc gctgtggacc 120t
t
agctgcagca ggagttccac tgctgtggca gcaacaactc acaggactgg cga 173t
t
t
<210> 22t
<211> 186t
<212> DNAt
<213> klf9t
t
<400> 22t
ccctgtcctc tcatccataa ctcaaattta ctaccagcaa cacaaaatac aaagatgtgt 60t
t
ccagtttcac tacagctctt cgcgtttaca agtgtcgagc gcttgctttc ggaacgccct 120t
t
tgtgattggc cgagccaatg ccagtgacat caaccaactt acttttgatt ggaaggctgg 180t
t
ttgctg 186t
t
t
<210> 23t
<211> 210t
<212> DNAt
<213> IGF-It
t
<400> 23t
tctctgaatc ttggctgctg gagccattca ttcagcaacc ttgtctaagt ggtttatgaa 60t
t
ttgtttcctt atttgcactt ctttctacac aactcgggct gtttgtttta cagtgtctga 120t
t
taatcttgtt agtctatacc caccacctcc cttcataacc tttatatttg ccgaatttgg 180t
t
cctcctcaaa agcagcagca agtcgtcaag 210t
t
t
<210> 24t
<211> 204t
<212> DNAt
<213> CCND1t
t
<400> 24t
ttgctgctat tggaggatca gttttttgtt ttacaatgtc atatactgcc atgtactagt 60t
t
tttagttttc tcttagaaca ttgtattaca gatgcctttt ttgtagtttt tttttttttt 120t
t
atgtgatcaa ttttgactta atgtgattac tgctctattc caaaaaggtt gctgtttcac 180t
t
aatacctcat gcttcactta gcca 204t
t
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<210> 25t
<211> 193t
<212> DNAt
<213> VEGFAt
t
<400> 25t
ggcgaagaga agagacacat tgttggaaga agcagcccat gacagctccc cttcctggga 60t
t
ctcgccctca tcctcttcct gctccccttc ctggggtgca gcctaaaagg acctatgtcc 120t
t
tcacaccatt gaaaccacta gttctgtccc cccaggagac ctggttgtgt gtgtgtgagt 180t
t
ggttgacctt cct 193t
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t
<210> 26t
<211> 188t
<212> DNAt
<213> HLA-Et
t
<400> 26t
cccacagaga gcctccacta gagtgatgct aagtggaaat gtgaggtgca gctgccacag 60t
t
agggccccca ccagggaaat gtctagtgtc tagtggatcc aggccacagg agagagtgcc 120t
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ttgtggagcg ctgggagcag gacctgacca ccaccaggac cccagaactg tggagtcagt 180t
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ggcagcat 188t
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<210> 27t
<211> 138t
<212> DNAt
<213> GAPDHt
t
<400> 27t
gcaccgtcaa ggctgagaac gggaagcttg tcatcaatgg aaatcccatc accatcttcc 60t
t
aggagcgaga tccctccaaa atcaagtggg gcgatgctgg cgctgagtac gtcgtggagt 120t
t
ccactggcgt cttcacca 138t
