利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测
技术领域t
本发明属于生物医药检测领域，更具体地，涉及一种利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测方法。t
背景技术t
目前，在结核病诊断医疗中，结核菌耐药性试验还是一项重要的技术，但是传统的结核耐药相关基因的检测方法还存在一些问题：t
1.传统的结核耐药相关基因的检测方法只能同时检测少量的特定位点，并且无法判定其突变性质。t
2.在实际的临床样本中的耐药菌株很多是耐药性的，并且菌株群里可能存在几种耐不同药物的菌株。并且，由于菌株的分布比例不均一，传统的耐药位点检测方法能够检测到突变信号较高的突变位点，即菌株中的优势群体，这种情况下，基于传统方法检测提供药物治疗前期会有明显的病情好转，但是随着优势菌株的下降，劣势菌株群体会慢慢转化为优势菌株，治疗后期会出现显著的病情恶化。不能科学、安全、准确的指导结核病人用药。t
发明内容t
针对现有技术中的上述缺陷，本发明提供了一种针对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测方法，该方法能够一次性检测出耐多药菌株的多个突变位点，并且能够更加科学、安全、准确的指导结核病人用药。t
本发明提供一种利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测方法，其包括以下几步：t
（1）设计覆盖gyrA、lnhA 、katG、rpoB基因全长的引物；t
（2）将步骤（1）中的4种基因引物合并形成primer pool；t
（3）利用步骤（2）中primer pool扩增出能够覆盖耐药相关基因全长的扩增子；t
（4）进一步对步骤（3）中所述的扩增子进行末端修复、添加接头、文库扩增和定量，建立完整SV-MTB文库；t
（5）通过一次接触的方法使SV-MTB文库形成油包水的结构，再用ionPGM进行测序，检测出耐药位点。t
步骤（5）中所述的耐药位点是SV-MTB同时检测到不同药物的耐药位点，所述耐药位点包括：GyrA-_94、GyrA-_88、GyrA-_89、GyrA-_90、GyrA-_91 、rpoB_516、rpoB_511、rpoB_513、rpoB_522、rpoB_526、rpoB_531、rpoB_533、katG_315、inhA_-15、inhA_-8等耐药相关热点。t
优选地，进行菌株耐药位点检测包括以下几步：t
A:通过质控符合标准的样品DNA，获得四个基因的Ampliseq PCR产物；t
B:将步骤A中所述的Ampliseq-PCR产物与步骤（3）中所述的的扩增子进行末端修复、添加接头、文库扩增和定量，建立完整SV-MTB文库；t
E：（5）通过一次接触的方法使SV-MTB文库形成油包水的结构，再用ion PGM进行测序，检测出耐药位点。t
优选地，在步骤A中PCR所用的引物包括：t
gyrA的引物编号分别为：gyrA_8.1.75513、gyrA_8.1.51886、gyrA_8.1.82296、gyrA_8.2.58628、gyrA_8.2.29245、gyrA_8.2.49325、gyrA_8.2.94533、gyrA_8.2.1239、gyrA_8.3.158404、gyrA_8.3.159760、gyrA_8.3.104094、gyrA_8.3.113730、gyrA_8.4.22908、gyrA_8.4.67530、gyrA_8.4.47561、gyrA_8.4.24855、gyrA_8.5.10674、gyrA_8.5.14302；t
InhA的引物编号分别为：InhA_5.1.57946、InhA_5.1.69702、InhA_5.1.55270、InhA_5.1.88153、InhA_5.2.101468、InhA_5.2.77605、InhA_5.2.4266；t
katG 的引物编号分别为：katG_2.1.99813、katG_2.1.50357、katG_2.1.1237 .3.130345、katG_2.3.100427、katG_2.4.25702、katG_2.4.39974、katG_2.4.116783、katG_2.4.112440；t
rpoB 的引物编号分别为：rpoB_1.1.113180、rpoB_1.1.148688、rpoB_1.1.81682、rpoB_1.2.113638、rpoB_1.2.37694、rpoB_1.2.19193、rpoB_1.2.142863、rpoB_1.2.128222、rpoB_1.3.65890、rpoB_1.3.48836、rpoB_1.3.50710、rpoB_1.4.72080、rpoB_1.4.86222、rpoB_1.4.9838、rpoB_1.4.125079、rpoB_1.4.112057、rpoB_1.5.99561、rpoB_1.5.102258、rpoB_1.5.104523、rpoB_1.5.30503、rpoB_1.6.138705、rpoB_1.6.142676、rpoB_1.6.123078、rpoB_1.6.43945、rpoB_1.6.91215。t
优选地，建立完整SV-MTB文库的步骤包括以下几步：t
a:目标区域扩增：引物分为两份，同一样品分两管单独扩增；t
b：部分除去引物：将步骤a中同一样品不同的primer pool的PCR产物合并为一管，进行去除引物；t
c:加接头：在反应体系中得到未扩增的文库，再将未扩增的文库纯化；t
d：对c中得到的文库进行扩增和定量。t
本发明中gyrA的序列为：GyrA(7295…9847)t
atgacagacacgacgttgccgcctgacgactcgctcgaccggatcgaaccggttgacatcgagcaggagatgcagcgcagctacatcgactatgcgatgagcgtgatcgtcggccgcgcgctgccggaggtgcgcgacgggctcaagcccgtgcatcgccgggtgctctatgcaatgttcgattccggcttccgcccggaccgcagccacgccaagtcggcccggtcggttgccgagaccatgggcaactaccacccgcacggcgacgcgtcgatctacgacagcctggtgcgcatggcccagccctggtcgctgcgctacccgctggtggacggccagggcaacttcggctcgccaggcaatgacccaccggcggcgatgaggtacaccgaagcccggctgaccccgttggcgatggagatgctgagggaaatcgacgaggagacagtcgatttcatccctaactacgacggccgggtgcaagagccgacggtgctacccagccggttccccaacctgctggccaacgggtcaggcggcatcgcggtcggcatggcaaccaatatcccgccgcacaacctgcgtgagctggccgacgcggtgttctgggcgctggagaatcacgacgccgacgaagaggagaccctggccgcggtcatggggcgggttaaaggcccggacttcccgaccgccggactgatcgtcggatcccagggcaccgctgatgcctacaaaactggccgcggctccattcgaatgcgcggagttgttgaggtagaagaggattcccgcggtcgtacctcgctggtgatcaccgagttgccgtatcaggtcaaccacgacaacttcatcacttcgatcgccgaacaggtccgagacggcaagctggccggcatttccaacattgaggaccagtctagcgatcgggtcggtttacgcatcgtcatcgagatcaagcgcgatgcggtggccaaggtggtgatcaataacctttacaagcacacccagctgcagaccagctttggcgccaacatgctagcgatcgtcgacggggtgccgcgcacgctgcggctggaccagctgatccgctattacgttgaccaccaactcgacgtcattgtgcggcgcaccacctaccggctgcgcaaggcaaacgagcgagcccacattctgcgcggcctggttaaagcgctcgacgcgctggacgaggtcattgcactgatccgggcgtcggagaccgtcgatatcgcccgggccggactgatcgagctgctcgacatcgacgagatccaggcccaggcaatcctggacatgcagttgcggcgcctggccgcactggaacgccagcgcatcatcgacgacctggccaaaatcgaggccgagatcgccgatctggaagacatcctggcaaaacccgagcggcagcgtgggatcgtgcgcgacgaactcgccgaaatcgtggacaggcacggcgacgaccggcgtacccggatcatcgcggccgacggagacgtcagcgacgaggatttgatcgcccgcgaggacgtcgttgtcactatcaccgaaacgggatacgccaagcgcaccaagaccgatctgtatcgcagccagaaacgcggcggcaagggcgtgcagggtgcggggttgaagcaggacgacatcgtcgcgcacttcttcgtgtgctccacccacgatttgatcctgttcttcaccacccagggacgggtttatcgggccaaggcctacgacttgcccgaggcctcccggacggcgcgcgggcagcacgtggccaacctgttagccttccagcccgaggaacgcatcgcccaggtcatccagattcgcggctacaccgacgccccgtacctggtgctggccactcgcaacgggctggtgaaaaagtccaagctgaccgacttcgactccaatcgctcgggcggaatcgtggcggtcaacctgcgcgacaacgacgagctggtcggtgcggtgctgtgttcggccggcgacgacctgctgctggtctcggccaacgggcagtccatcaggttctcggcgaccgacgaggcgctgcggccaatgggtcgtgccacctcgggtgtgcagggcatgcggttcaatatcgacgaccggctgctgtcgctgaacgtcgtgcgtgaaggcacctatctgctggtggcgacgtcagggggctatgcgaaacgtaccgcgatcgaggaatacccggtacagggccgcggcggtaaaggtgtgctgacggtcatgtacgaccgccggcgcggcaggttggttggggcgttgattgtcgacgacgacagcgagctgtatgccgtcacttccggcggtggcgtgatccgcaccgcggcacgccaggttcgcaaggcgggacggcagaccaagggtgttcggttgatgaatctgggcgagggcgacacactgttggccatcgcgcgcaacgccgaagaaagtggcgacgataatgccgtggacgccaacggcgcagaccagacgggcaattaa t
gyrA的引物信息具体如下表中所示：t
本发明中所涉及的lnhA的序列为：InhA(1674134…1675154)t
atgacaggactgctggacggcaaacggattctggttagcggaatcatcaccgactcgtcgatcgcgtttcacatcgcacgggtagcccaggagcagggcgcccagctggtgctcaccgggttcgaccggctgcggctgattcagcgcatcaccgaccggctgccggcaaaggccccgctgctcgaactcgacgtgcaaaacgaggagcacctggccagcttggccggccgggtgaccgaggcgatcggggcgggcaacaagctcgacggggtggtgcattcgattgggttcatgccgcagaccgggatgggcatcaacccgttcttcgacgcgccctacgcggatgtgtccaagggcatccacatctcggcgtattcgtatgcttcgatggccaaggcgctgctgccgatcatgaaccccggaggttccatcgtcggcatggacttcgacccgagccgggcgatgccggcctacaactggatgacggtcgccaagagcgcgttggagtcggtcaacaggttcgtggcgcgcgaggccggcaagtacggtgtgcgttcgaatctcgttgccgcaggccctatccggacgctggcgatgagtgcgatcgtcggcggtgcgctcggcgaggaggccggcgcccagatccagctgctcgaggagggctgggatcagcgcgctccgatcggctggaacatgaaggatgcgacgccggtcgccaagacggtgtgcgcgctgctgtctgactggctgccggcgaccacgggtgacatcatctacgccgacggcggcgcgcacacccaattgctctag t
lnhA的引物信息如下表中所示：t
本发明所涉及的katG的序列为：katG(2153864…2156128)t
gtgcccgagcaacacccacccattacagaaaccaccaccggagccgctagcaacggctgtcccgtcgtgggtcatatgaaataccccgtcgagggcggcggaaaccaggactggtggcccaaccggctcaatctgaaggtactgcaccaaaacccggccgtcgctgacccgatgggtgcggcgttcgactatgccgcggaggtcgcgaccatcgacgttgacgccctgacgcgggacatcgaggaagtgatgaccacctcgcagccgtggtggcccgccgactacggccactacgggccgctgtttatccggatggcgtggcacgctgccggcacctaccgcatccacgacggccgcggcggcgccgggggcggcatgcagcggttcgcgccgcttaacagctggcccgacaacgccagcttggacaaggcgcgccggctgctgtggccggtcaagaagaagtacggcaagaagctctcatgggcggacctgattgttttcgccggcaactgcgcgctggaatcgatgggcttcaagacgttcgggttcggcttcggccgggtcgaccagtgggagcccgatgaggtctattggggcaaggaagccacctggctcggcgatgagcgttacagcggtaagcgggatctggagaacccgctggccgcggtgcagatggggctgatctacgtgaacccggaggggccgaacggcaacccggaccccatggccgcggcggtcgacattcgcgagacgtttcggcgcatggccatgaacgacgtcgaaacagcggcgctgatcgtcggcggtcacactttcggtaagacccatggcgccggcccggccgatctggtcggccccgaacccgaggctgctccgctggagcagatgggcttgggctggaagagctcgtatggcaccggaaccggtaaggacgcgatcaccagcggcatcgaggtcgtatggacgaacaccccgacgaaatgggacaacagtttcctcgagatcctgtacggctacgagtgggagctgacgaagagccctgctggcgcttggcaatacaccgccaaggacggcgccggtgccggcaccatcccggacccgttcggcgggccagggcgctccccgacgatgctggccactgacctctcgctgcgggtggatccgatctatgagcggatcacgcgtcgctggctggaacaccccgaggaattggccgacgagttcgccaaggcctggtacaagctgatccaccgagacatgggtcccgttgcgagataccttgggccgctggtccccaagcagaccctgctgtggcaggatccggtccctgcggtcagccacgacctcgtcggcgaagccgagattgccagccttaagagccagatccgggcatcgggattgactgtctcacagctagtttcgaccgcatgggcggcggcgtcgtcgttccgtggtagcgacaagcgcggcggcgccaacggtggtcgcatccgcctgcagccacaagtcgggtgggaggtcaacgaccccgacggggatctgcgcaaggtcattcgcaccctggaagagatccaggagtcattcaactccgcggcgccggggaacatcaaagtgtccttcgccgacctcgtcgtgctcggtggctgtgccgccatagagaaagcagcaaaggcggctggccacaacatcacggtgcccttcaccccgggccgcacggatgcgtcgcaggaacaaaccgacgtggaatcctttgccgtgctggagcccaaggcagatggcttccgaaactacctcggaaagggcaacccgttgccggccgagtacatgctgctcgacaaggcgaacctgcttacgctcagtgcccctgagatgacggtgctggtaggtggcctgcgcgtcctcggcgcaaactacaagcgcttaccgctgggcgtgttcaccgaggcctccgagtcactgaccaacgacttcttcgtgaacctgctcgacatgggtatcacctgggagccctcgccagcagatgacgggacctaccagggcaaggatggcagtggcaaggtgaagtggaccggcagccgcgtggacctggtcttcgggtccaactcggagttgcgggcgcttgtcgaggtctatggcgccgatgacgcgcagccgaagttcgtgcaggacttcgtcgctgcctgggacaaggtgatgaacctcgacaggttcgacgtgcgctga t
katG的引物信息如下表中所示：t
本发明所涉及的rpoB序列为：t
ttggcagattcccgccagagcaaaacagccgctagtcctagtccgagtcgcccgcaaagttcctcgaataactccgtacccggagcgccaaaccgggtctccttcgctaagctgcgcgaaccacttgaggttccgggactccttgacgtccagaccgattcgttcgagtggctgatcggttcgccgcgctggcgcgaatccgccgccgagcggggtgatgtcaacccagtgggtggcctggaagaggtgctctacgagctgtctccgatcgaggacttctccgggtcgatgtcgttgtcgttctctgaccctcgtttcgacgatgtcaaggcacccgtcgacgagtgcaaagacaaggacatgacgtacgcggctccactgttcgtcaccgccgagttcatcaacaacaacaccggtgagatcaagagtcagacggtgttcatgggtgacttcccgatgatgaccgagaagggcacgttcatcatcaacgggaccgagcgtgtggtggtcagccagctggtgcggtcgcccggggtgtacttcgacgagaccattgacaagtccaccgacaagacgctgcacagcgtcaaggtgatcccgagccgcggcgcgtggctcgagtttgacgtcgacaagcgcgacaccgtcggcgtgcgcatcgaccgcaaacgccggcaaccggtcaccgtgctgctcaaggcgctgggctggaccagcgagcagattgtcgagcggttcgggttctccgagatcatgcgatcgacgctggagaaggacaacaccgtcggcaccgacgaggcgctgttggacatctaccgcaagctgcgtccgggcgagcccccgaccaaagagtcagcgcagacgctgttggaaaacttgttcttcaaggagaagcgctacgacctggcccgcgtcggtcgctataaggtcaacaagaagctcgggctgcatgtcggcgagcccatcacgtcgtcgacgctgaccgaagaagacgtcgtggccaccatcgaatatctggtccgcttgcacgagggtcagaccacgatgaccgttccgggcggcgtcgaggtgccggtggaaaccgacgacatcgaccacttcggcaaccgccgcctgcgtacggtcggcgagctgatccaaaaccagatccgggtcggcatgtcgcggatggagcgggtggtccgggagcggatgaccacccaggacgtggaggcgatcacaccgcagacgttgatcaacatccggccggtggtcgccgcgatcaaggagttcttcggcaccagccagctgagccaattcatggaccagaacaacccgctgtcggggttgacccacaagcgccgactgtcggcgctggggcccggcggtctgtcacgtgagcgtgccgggctggaggtccgcgacgtgcacccgtcgcactacggccggatgtgcccgatcgaaacccctgaggggcccaacatcggtctgatcggctcgctgtcggtgtacgcgcgggtcaacccgttcgggttcatcgaaacgccgtaccgcaaggtggtcgacggcgtggttagcgacgagatcgtgtacctgaccgccgacgaggaggaccgccacgtggtggcacaggccaattcgccgatcgatgcggacggtcgcttcgtcgagccgcgcgtgctggtccgccgcaaggcgggcgaggtggagtacgtgccctcgtctgaggtggactacatggacgtctcgccccgccagatg t
rpoB的引物信息如下表中所示：t
本发明解决了现有技术中的不足，达到的有益效果：t
1.一次检测多个耐药基因。本发明可以一次检测出多个位点，包括同一药物的不同耐药点和不同药物的耐药位点，并能判定其突变性质，即能检测出耐多药菌株的多个突变位点。t
2.检测完整耐药基因，可发现全新耐药突变位点，本发明覆盖GyrA、lnhA 、katG、rpoB等四个基因的全长，能够检测出该基因范围内所有位点的突变，能够检测出已公开报道的耐药位点和全新突变位点，有利于全新耐药位点的发现。t
3.本发明能同时检测出菌株中的高频突变和低频突变(低至百分之一)，以及优势耐药菌株突变位点和劣势耐药菌株突变位点，能更科学、更安全、更准确的指导结合病人用药。t
4.本发明对实验方法进行优化，在本发明的实验过程中对DNA纯化过程中的MPure磁珠用量，文库构建过程中模板的使用量以及上级文库的量等进行优化，使的检测结果达到最优。 t
附图说明t
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。t
图1多位点检测结果示意图。t
图2新的耐药位点结果示意图。t
图3 SV-MIB检测到的耐药位点的低频突变示意图。t
图4 DNA纯化过程中优化后的检测结果。t
具体实施方式t
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例及实施例附图对本发明作进一步详细的说明。t
本发明实施例1中的针对针对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测方法包括以下几步：t
一、 DNA质检t
1)用Qubit对DNA浓度进行检测。t
2）浓度过低的DNA用agilent进行片段大小检测DNA是否降解。t
3）测定DNA的260/280值，要求大于1.6，在本实施例中的DNA的260/280值大于1.6；如果在实际实验时，不达标的DNA经过0.5X Mpure磁珠纯化后再测定260/280值。t
二、构建文库 t
1）目的区域扩增t
a.将引物分为pool1、pool2,同一样品分两管单独扩增；扩增各组分量（共10μl）；基因组用量为0.1ng/pool。试剂如表1所示。t
表1
b.PCR条件如表2所示：t
表2t
将以上扩增好的PCR产物可以直接进行下一步操作，也可置于-20℃保存。t
2）部分去除引物t
将上一步中同一样品的不同primer pool的PCR产物合并为一管，加入2μl的fupa,用10μl移液器（量程调至10μl）吸打混匀10次；再将混合物放入ABI96孔PCR扩增仪中反应，反应条件如下表3。t
表3
以上酶切后的产物需要马上进行下一步操作。t
3）连接Barcode接头t
a．反应体系如表4（共30μl）：t
表4t
反应条件：如表5。t
表5
b.反应完成后纯化未扩增的文库（1.5 x Agencourt AMPure XP Reagent）t
4)文库扩增和定量t
A：Q-PCRt
反应体系（总量20μl）如表6所示。t
表6
将表6中的反应体系加入文库标准品建立标准曲线，文库标准品的浓度为：30pmol、3 pmol、0.3 pmol、0.03 pmol、0.003 pmol。t
反应条件如表7中所示。t
表7t
得到Ct值之后，用标准品的Ct值和lgC（浓度对数）做标准曲线，根据标准曲线得出各种样品的浓度，稀释至16pmol。t
B：Equalizert
a.将2）b中（反应完成后纯化未扩增的文库）这步中，用70%乙醇洗两次后，beads用50μl 偶发platinumPCR Super Mix High Fidelity 重悬，加入2μl的Equalizer Primers；t
b.吸打混匀后置于磁力架上静置2min,收集上清于PCR管中进行扩增，扩增条件如表8中所示。t
表8
c.扩增后的文库加入25μl（0.5X）的Agencourt AMPure XP Reagent，混合均匀后静置5分钟。t
d．取上清液加入到60μl的Agencourt AMPure XP Reagent，混合均匀后静置5分钟。t
e．静置后置于磁力架上，待液体澄清后，除去上清，用150μl70%乙醇洗2次。t
f.静置2min待70%的乙醇挥发完全后，加入30μl的LTE或ddH2O重悬beads，静置5分钟。t
g.将产物置于磁力架上，上清为得到的扩增后的文库。t
h.取2μl扩增的文库与198μl稀释后的reagent（buffer: reagent=200:1）混合后，用Qubit测定文库浓度。t
三．文库乳化PCR及富集t
1、打开Ion One Touch 2Instrument ,点击屏上“Open Lid”。t
2、将试剂盒中的收集管放入相应离心管槽中，将收集管桥架在相应的槽中，关闭离心盖。t
3、将Ion One Touch 2Instrument加热盖上方的把手拉开，打开热盖。t
4、安装扩增板放置到相应位置，将把手拉回到原位，合上热盖。t
5、将连接扩增板的胶皮管卡在Ion One Touch 2Instrument的相应槽中，将另一端的针头缓慢垂直插入离心盖中，不要斜着插入，若不能加入离心盖，关机重新开机即可。t
6、向Ion One Touch 2Instrument油管中加入试剂盒中提供的Ion PGM OT2 OIL，大约加到二分之一处。t
7、向Ion One Touch 2Instrument Recovery 管中加入试剂盒中提供的Ion PGM Recovery Solution。t
8、将废液槽中的废液排出。t
9、按照表9中配置扩增液。t
表9
10.将扩增液涡旋5s，轻甩离心管，将管壁溶液甩到离心管中。t
11.将1000μl扩增液缓慢注入到Ion PGM Plus Reaction Filter中，再将750μl反应油缓慢注入到Ion PGM Plus Reaction Filter中，不要产生气泡。t
12.重复上一步，将750μl反应油缓慢注入到Ion PGM Plus Reaction Filter中，不要产生气泡。t
13.将Ion PGM Plus Reaction Filter翻转过来，并插入到Ion One Touch 2Instrument的反应槽中，运行Ion One Touch 2Instrument，选择相对应的试剂盒，并确保之前步骤已经完成，油管中反应液充足。t
14.反应过程大约5小时19分钟，运行完成后，点击屏幕的next,并且继续离心10分钟。t
15.离心完成后，将收集管去除，去上清，每管剩余50μl，将剩余的液体用枪头吹打混匀，将两管中的液体转移到新的1.5ml离心管中。t
16.配置ES所需溶液，溶液组分如表10中所示。t
表10
17.配置Myone Beads ，振荡30s后，吸取50μl到1.5ml离心管中，放置在磁力架上2min后，弃上清，加入1ml Ion One Touch Wash Solution ，振荡5s，短暂离心，将离心管放置在磁力架上2min，弃上清，加入130μl Ion PGM Myone Beads Capture Solution，涡旋混匀。t
18.取出一个八连排，放置在Ion One Touch 2 ES八连排槽上，并放置在八连排槽的最左端，按照表11中加入不同的溶液。t
表11
19.把枪头安在枪头臂的末端，PCR放置在左边的小孔中，运行Ion One Touch 2 ES 大约35分钟，运行完毕后，将PCR小管取出来，加入3μl control ISP,吹打混匀，离心5分钟，去上清，剩余3μl。t
20.加入3μl Ion PGM Sequencing Primer，按照表12中的反应条件进行PCR。t
表12
21.PCR结束后，加入11μl Ion PGM Sequencing 200V2 poiymerase，放入4℃条件下保存，准备进行上机实验。t
四、上机测序。t
经过测序，在本发明的方法中可以一次检测多个耐药基因，其结果如表13所示。t
表13 一次检测多个耐药基因结果表t
本发明涉及的方法可以一次检测出多个位点，包括统一药物的不同耐药点和不同药物的耐药位点，并能判定其突变性质，即能检测出耐多药菌株的多个突变位点。其结果如表14中所示。t
表14 新的耐药位点检测结果表（其中表格中的*：为常见耐药位点 ，# ：未知突变位点，可发现全新耐药位点）t
在本实施例中，具体的，对300菌株样本进行检测，其中传统方法已经验证处的耐药位点通过本发明的方法100%检出，此外，还检测出更多的耐药位点（结果如图1所示）。t
如图2所示，检测完整耐药基因，可发现全新耐药突变位点，本发明覆盖了GyrA、lnhA 、katG、rpoB等四个基因的全长，能够检测出该基因范围内所有位点的突变，能够检测出已公开报道的耐药位点和全新突变位点，有利于全新耐药位点的发现。t
如图3所示，本发明能同时检测出菌株中的高频突变和低频突变(低至百分之一)，以及优势耐药菌株突变位点和劣势耐药菌株突变位点，能更科学、更安全、更准确的指导结合病人用药。其结果如表15中所示。t
表15同时检测出菌株中高频突变和低频突变结果表t
如图4所示，本发明对实验方法进行优化，在本发明的实验过程中对DNA纯化过程中的MPure磁珠用量，文库构建过程中模板的使用量以及上级文库的量等进行优化，使的检测结果达到最优。 t
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。t
