立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途

立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途

　　技术领域tt

　　本发明涉及立克次体甄别检测基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。tt

　　背景技术tt

　　立克次体(rickettsiae)是一类除极少数外专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，其引起的立tt克次体病是一类重要的人畜共患的自然疫源性疾病，在世界范围内呈散发性和季节性流行。tt许多节肢动物如虱、蚤、蜱、螨等均可作为立克次体感染的传播媒介。随着国际旅游业的发tt展，立克次体病被认为是威胁旅游健康的重要传染病之一。近些年来，斑点热新种的不断出tt现，埃立克体等新发立克次体的流行，都在提醒我们立克次体病大规模流行和突然暴发的可tt能性。此外立克次体作为潜在的生物恐怖病原体，也日益受到重视，美国反对生物恐怖主义tt(Bioterrorism)已将流行性斑疹伤寒、落基山斑点热以及Q热列在生物战剂名录中。因此，tt加强立克次体的监测与防治具有重要的现实意义。tt

　　目前世界范围内已发现具有致病性的立克次体有20余种，病人分离出的病原体以及基因tt检测证据表明我国至少存在10种立克次体病。立克次体病早期症状多样，无特异性临床特征，tt临床误诊率极高。延误治疗可引起严重的并发症，甚至死亡。但是若能在感染早期做出正确tt的诊断，低廉、有效的强力霉素及四环素即可对立克次体有效。因此快速、准确的早期诊断tt是控制立克次体病的关键。传统的立克次体检测方法主要有分离培养、PCR和免疫学诊断。tt但分离培养耗时长，操作复杂；PCR和免疫学方法只能检测一种或几种病原体，不能完全满tt足检测种类多样的立克次体的需要。而基因芯片技术具有快速、准确、低成本等特点特别适tt用于立克次体病的高通量检测。tt

　　发明内容tt

　　本发明的目的在于针对立克次体核酸高通量检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、tt特异、敏感、快速的立克次体甄别检测基因芯片，能同时检测七种重要的立克次体，包括普tt氏立克次体、莫氏立克次体、斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、查菲埃立tt克体、嗜吞噬细胞无形体，为立克次体感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手tt段。tt

　　为了达到上述目的，本发明立克次体甄别检测基因芯片，其制备方法如下：tt

　　1.步骤一：制备立克次体属通用及特异性引物tt

　　选择立克次体属的ompB基因、贝氏柯克斯体icd基因、恙虫病东方体47-KDa基因、嗜tt吞噬细胞无形体ankA基因、查菲埃立克体trp-120基因等作为检测靶基因，可以实现7种立tt克次体靶基因片段的扩增。优选6对引物序列及其对应的扩增靶标，如表1所示：tt

　　表1引物序列及对应的扩增靶标tt

　　2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针tt

　　根据7种立克次体基因序列间的比对及每种立克次体种内的序列比对，在上下游引物范tt围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。立克次体通用探针序列、种特异性探针序列以tt及对应的靶标，如表2所示：tt

　　表2寡核苷酸探针序列及对应的靶标tt

　　3.步骤三：制备寡核苷酸芯片tt

　　一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，tt0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片tt上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。tt该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括立克次体属通用探针和7个种特异性探针，其tt探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH2修饰，用来tt监测醛基片片基质量；阴性探针为与立克次体无关的植物基因序列，用来指示特异性；所有tt探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时。tt

　　表3寡核苷酸探针阵列tt

　　

　　4.步骤四：建立多重不对称PCR体系tt

　　本发明基因芯片中PCR体系的特征为2管三重不对称PCR反应体系。合适的多重不对tt称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对tt比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示：tt

　　表4多重不对称PCR体系配方tt

　　优选的PCR扩增条件为：95℃预变性2min；95℃20s，55℃20s，72℃，20s，共45tt个循环；72℃延伸5min。tt

　　5.步骤五：建立杂交体系tt

　　合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以tt保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(Att管和B管各2.5μl)与杂交液(5μl)等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为4×SSC，tt0.3％SDS，5％甲酰胺。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗tttttt液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。tt

　　6.步骤六：化学发光显色tt

　　1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，tt37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，tt置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μltt的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交tt信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。tt

　　以上制备的立克次体甄别检测基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液ttA、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。tt

　　一个优选的实施方案使用市售的DNA提取试剂盒提取立克次体基因组DNA，提取参照相tt应的试剂盒说明书进行。提取的DNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩tt增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行tt杂交和显色。tt

　　洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行扫描，并运用分析软件判读结果。tt选择肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、洋葱假单胞菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞tt菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜麦芽窄食单胞菌等细菌作为样本，利用上述制备的基tt因芯片进行检测，考察芯片的特异性。制备质粒DNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测tt限。结果：莫氏立克次体、斑点热立克次体检测限为3×50copies/反应，普氏立克次体、查菲tt埃立克体检测限为3×100copies/反应，恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、嗜吞噬细胞无形体检测tt限为3×1000copies/反应。tt

　　使用本发明制备的基因芯片检测立克次体模拟样本(全血)。本芯片法检测4种不同浓度tt的立克次体模拟样本，结果显示，模拟样本基因芯片检测符合率达到100％，灵敏度为tt103-104copies/μl。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对全血中的立克次体进行准确检测。tt

　　本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别七种重要的立克次体，tt包括普氏立克次体、莫氏立克次体、斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、查tt菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，tt可为立克次体感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发tt明的基因芯片以对7种不同种的立克次体进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片对7种立tt克次体的检测灵敏度为150-3000copies/反应。tt

　　附图说明tt

　　图1：为本发明立克次体甄别检测基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同tttttt阵列。tt

　　图2：立克次体甄别检测基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针tt的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。①对应的是普氏立克次体特tt异性探针；②对应的是莫氏立克次体特异性探针；③对应的是斑点热群立克次体特异性探针tt1；④对应的是斑点热群立克次体特异性探针2；⑤对应的是立克次体属通用型探针；⑥对应tt的是贝氏柯克斯体特异性探针；⑦对应的是恙虫病东方体特异性探针；⑧对应的是查菲埃立tt克体特异性探针；⑨对应的是嗜吞噬细胞无形体特异性探针；⑩对应的是阴性对照探针；对应片基质控探针。tt

　　图3：典型的7种立克次体的芯片检测图。其中1-7依次为普氏立克次体、莫氏立克次体、tt黑龙江立克次体、查菲埃立克体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体立克次tt体甄别芯片检测结果。tt

　　图4：基因芯片特异性检测结果图。其中1-10依次为肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色tt葡萄球菌、洋葱假单胞菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、C型流感嗜血杆菌、B型流感嗜血tt杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌的检测结果图。tt

　　图5：7种立克次体质粒DNA参考品的灵敏度检测结果图。其中1-7依次为普氏立克次tt体3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNAtt参考品和阴性对照检测结果；8-14依次为莫氏立克次体3×105copies、3×104copies、3×103copies、tt3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；15-21依次为tt黑龙江立克次体3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copiestt质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；22-28依次为查菲埃立克体3×105copies、3×104copies、tt3×103copies、3×102copies、3×50copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；tt29-36依次为贝氏柯克斯体3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×500copies、3×102copies、tt3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；37-42依次为恙虫病东方体3×105copies、tt3×104copies、3×103copies、3×500copies、3×102copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性tt对照检测结果；43-48依次为嗜吞噬细胞无形体3×105copies、3×104copies、3×103copies、tt3×500copies、3×102copies、3×101copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果。tt

　　图6：立克次体甄别检测基因芯片模拟样本检测结果图。1-5依次为普氏立克次体tt105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl模拟样本和阴性样本检测结果；6-10依tt次为莫氏立克次体105copies/μl、104copies/μl、103copies/μi、102copies/μl模拟样本和阴性样本tt检测结果；11-15依次为黑龙江立克次体105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μltttttt模拟样本和阴性样本检测结果；16-20依次为查菲埃立克体105copies/μl、104copies/μl、tt103copies/μl、102copies/μl模拟样本和阴性样本检测结果；21-25依次为贝氏柯克斯体tt105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl模拟样本和阴性样本检测结果；29-30tt依次为恙虫病东方体105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl模拟样本和阴性样tt本检测结果；31-35依次为嗜吞噬细胞无形体105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、tt102copies/μl模拟样本和阴性样本检测结果。tt

　　具体实施方式tt

　　下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。tt

　　实施例1：立克次体甄别检测基因芯片的研制tt

　　一、引物探针设计和筛选tt

　　首先从NCBI基因数据库中下载立克次体靶基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTI ttAdvance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进tt行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性tt引物。经过筛选最终确定共12条上下游引物，将反向引物进行5’端bio标记，作为芯片使用tt的引物；确定10条特异性检测探针，3’端NH2修饰。tt

　　二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列tt

　　完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图2。①对应的是普氏立克次tt体特异性探针；②对应的是莫氏立克次体特异性探针；③对应的是斑点热群立克次体特异性tt探针1；④对应的是斑点热群特异性探针2；⑤对应的是立克次体属通用型探针；⑥对应的是tt贝氏柯克斯体特异性探针；⑦对应的是恙虫病东方体特异性探针；⑧对应的是查菲埃立克体tt特异性探针；⑨对应的是嗜吞噬细胞无形体特异性探针；⑩对应的是阴性对照探针；对应tt片基质控探针。tt

　　三、多重不对称PCR体系tt

　　本发明中PCR体系的特征为两管三重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提tt高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因tt素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.1μM：0.5μM，Taq酶用量为2.5U/体系时，参考品tt的探针信号值较强，且低拷贝模板103copie/μl仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为：95℃tt预变性2min；95℃20s，55℃20s，72℃，20s，共45个循环；72℃延伸5min。tt

　　四、建立并优化杂交体系tt

　　通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。tt在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％tttttt甲酰胺。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，tt洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。tt

　　五、化学发光显色tt

　　1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，tt37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，tt置室温晾干。tt

　　2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合tt液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ttArrayVision7.0软件分析结果。tt

　　实施例2：立克次体甄别检测基因芯片阳性判定标准的确定tt

　　Cutoff值是判断基因芯片信号值是否为阳性的标准。每条分型探针分别选取非立克次体tt(即阴性菌株)、空白对照进行基因芯片杂交，通过反复的实验和数据统计，将阴性菌株和空tt白对照的背景统计平均值+2SD作为每条探针的Cutoff值。将各突变检测探针的区分能力在2.5tt倍以上作为位点是否出现突变的判断标准。tt

　　实施例3：立克次体甄别检测基因芯片的特异性评价tt

　　特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检tt测了肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、洋葱假单胞菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞tt菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和嗜麦芽窄食单胞菌等细菌，由附图4可以看出，上述细tt菌检测结果都呈立克次体阴性，特异性良好。本发明检测7种立克次体，由附图3可以看出，tt7种立克次体均可以明显区分，说明本发明特异性良好。tt

　　实施例4：立克次体甄别检测基因芯片灵敏度评价tt

　　构建7种立克次体质粒DNA作为检测参考品，从109copies/μl梯度稀释至101copies/μl，tt进行芯片检测，结果见附图5。由附图5可以看出，本发明的检测限：莫氏立克次体、斑点tt热立克次体检测限为3×50copies/反应；普氏立克次体、查菲埃立克体检测限为3×100copies/tt反应；恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、嗜吞噬细胞无形体检测限为3×1000copies/反应。tt

　　实施例5：立克次体甄别检测基因芯片模拟样本检测tt

　　使用本发明制备的基因芯片，检测4种不同浓度的立克次体模拟样本(全血)，结果显示，tt模拟样本基因芯片检测符合率达到100％，灵敏度为103-104copies/μl。部分检测结果见附图6。tt

　　除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术tt方案，均在本发明要求的保护范围。tt