鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用
技术领域tt
本发明涉及植物生物技术和分子育种领域，更具体地，涉及鉴定tt水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记及其应用。tt
背景技术tt
三系杂交水稻以其稳产、高产等优势，在种植面积上一直处于领tt先地位，为我国粮食安全做出了巨大的贡献。CMS(Cytoplasmic Male ttSterility)即细胞质雄性不育,是三系杂交稻开发利用的物质基础，以tt此为基础开发的三系配套具体是指CMS恢复系、CMS保持系和CMStt不育系。育种过程需要完成三系各自的保种和制备杂交种，具体操作tt是CMS保持系和CMS恢复系通过自交繁种；CMS不育系与CMS保持tt系杂交繁种；CMS恢复系做父本，与CMS不育系母本杂交可以制杂tt交种。我国杂交水稻CMS恢复系的选育历史上，CMS恢复系主要有tt野败型(WA)CMS恢复系和红莲型(HL)CMS恢复系，以及粳稻包tt台型(BT)CMS恢复系(万建民等，2008)。明恢63的培育成功具tt有里程牌式的意义，它兼具野败型CMS和包台型CMS恢复系的作用tt(Tang等，2014；Wang等，2006；Komori等，2004)；其次，9311是tt红莲型CMS恢复系的代表品系(Hu等，2012)。上述3种类型中控tt制着育性恢复的关键位点之一就是Rf-1基因及其相邻区间，它包括了tt野败型CMS恢复基因Rf4(Tang等，2014)、包台型CMS恢复基因ttRf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、红莲型CMS恢tt复基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。tt
传统育种中，恢复系的选育通过大田杂交测恢保关系，工作量大，tt组合有限，而利用分子标记可以在室内快速鉴定恢复基因的等位类tt型，提升育种的预见性，减少不必要的测交组合，从而提高育种效率。tttttt在分子标记辅助育种中，当前该基因座位的常用分子标记可分为两tt种，一是紧密连锁的标记，二是功能标记(陈涛等，2013)。在大规tt模选择中这两类标记都有一定的缺陷，前者会有目的基因丢失的现tt象，后者在育种实践中只能够鉴别其中一个基因座位的基因型，且两tt种标记都会伴随非预期性状的带入，即存在连锁累赘的问题。tt
基于CMS恢复基因Rf-1位点的基因定位克隆研究，已经认识到该tt位点的恢复基因都属于PPR家族成员，具有较高的DNA序列同源性，tt常规的InDel区分彼此之间的差异非常困难，而SNP分布广、数量多，tt是开发鉴别该位点基因家族成员彼此之间差异标记的有效来源。因tt而，通过开发区段内分布合理的多个以SNP标记为主的组合，可以鉴tt定种质资源的Rf-1区段的单倍型，同时，可以在培育三系杂交水稻中，tt鉴定Rf-1区段导入片段大小范围，选择更加合适的改良单株后代，有tt效克服连锁累赘。最终，达到同步解决多个基因座位的基因型鉴定及tt连锁累赘的问题，进而，提升育种技术水平。tt
Life Technologies公司(http://www.lifetechnologies.com/)的ttTaqMan OpenArray技术是将TaqMan-MGB探针技术与OpenArray芯tt片技术相结合的高通量基因分型技术。TaqMan-MGB探针技术是已经tt成熟应用的水解携带荧光基团的杂交探针获取荧光信号的检测技术。ttOpenArray芯片技术是将反应控制在33nl的微孔内进行的微阵列技tt术，一张芯片上设有3072个微孔，由48个方阵组成，按4行12列tt排布，每个方阵由64个微孔组成，按8行8列排布。芯片上可以灵tt活地选择检测的目标数目，如16个，32个，64个，128个和256个；tt相应的检测样品数为144份，96份，48份，24份和12份。OpenArraytt芯片灵活的检测目标数目与检测样品数的组合方案可以为不同规模tt的检测提供成本控制更加合理的选择。tt
发明内容tt
本发明的目的在于提供了鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍tttttt型的分子标记。tt
为实现本发明目的，本发明首先利用新一代测序技术，对水稻野tt败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63、红莲型CMS恢复系亲本9311、tt自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97进行全tt基因组重测序，与参照品种日本晴测序数据进行比对，选定Rf-1基因tt及其上下游各200kb约遗传距离1cM区间范围，发掘多态性位点。共tt获得水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点32个。tt
具体地，本发明筛选水稻CMS恢复基因Rf-1区段多态性位点的方tt法包括以下步骤：tt
(1)比对参考基因组，将各材料测序reads比对到Nipponbare基tt因组，使用软件BWA进行比对，参考基因组序列是MSU第6.1版ttNipponbare的基因组序列。tt
(2)鉴定筛选多态性位点，基于步骤(1)的比对结果，使用软tt件SAMtools分析鉴定多态性位点，具体步骤如下:1)位置碱基比对的tt质量值(MapQ值为50是特异性最强的reads，MapQ值小于40时将tt不会被采用)；2)位置碱基测序的质量值大于或等于20；3)位置tt碱基的杂合程度(碱基必须纯合)；4)位置碱基的覆盖度(位点的tt覆盖度大于5小于1000)；5)baseQ/BAQ的值小于15的位点不会被tt选定；6)位置碱基的变异可能性Q值大于等于20。满足以上条件且tt变异位点周围的序列保守时，该位点将被用作开发标记的候选。tt
(3)设计探针引物，将抽提包含候选变异位点的测序序列，利tt用Primer Express V3.0.1软件的TaqMan MGB Allelic Discriminationtt模块进行设计，如果软件给出设计结果，选择合适的探针、引物作为tt候选；否则，将序列转换为反向互补序列后，再次尝试设计，如果依tt然找不到合适的探针引物则视为标记设计未通过。如果一段序列上可tt以设计多个探针，则选择软件设计给出罚分最低的探针。以标记坐标tt平均分布的原则，在5个参考样品基因组重测序共线性的区段每10Kbtttttt设计一个标记，在平衡基因组之间的结构差异之后达到均匀分布。tt
因此，本发明提供了一种用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单tt倍型的分子标记，该分子标记是由以下引物扩增得到，所述引物的核tt苷酸序列为：tt
SEQ ID NO.1-2或SEQ ID NO.5-6或SEQ ID NO.9-10或tt
SEQ ID NO.13-14或SEQ ID NO.17-18或SEQ ID NO.21-22或tt
SEQ ID NO.25-26或SEQ ID NO.29-30或SEQ ID NO.33-34或tt
SEQ ID NO.37-38或SEQ ID NO.41-42或SEQ ID NO.45-46或tt
SEQ ID NO.49-50或SEQ ID NO.53-54或SEQ ID NO.57-58或tt
SEQ ID NO.61-62或SEQ ID NO.65-66或SEQ ID NO.69-70或tt
SEQ ID NO.73-74或SEQ ID NO.77-78或SEQ ID NO.81-82或tt
SEQ ID NO.85-86或SEQ ID NO.89-90或SEQ ID NO.93-94或tt
SEQ ID NO.97-98或SEQ ID NO.101-102或tt
SEQ ID NO.105-106或SEQ ID NO.109-110或tt
SEQ ID NO.113-114或SEQ ID NO.117-118或tt
SEQ ID NO.121-122或SEQ ID NO.125-126。tt
本发明还提供了一种用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍tt型的分子标记，该分子标记是由32组引物经PCR扩增得到，32组引tt物序列分别为：tt
SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.5-6和SEQ ID NO.9-10和tt
SEQ ID NO.13-14和SEQ ID NO.17-18和SEQ ID NO.21-22和tt
SEQ ID NO.25-26和SEQ ID NO.29-30和SEQ ID NO.33-34和tt
SEQ ID NO.37-38和SEQ ID NO.41-42和SEQ ID NO.45-46和tt
SEQ ID NO.49-50和SEQ ID NO.53-54和SEQ ID NO.57-58和tt
SEQ ID NO.61-62和SEQ ID NO.65-66和SEQ ID NO.69-70和tt
SEQ ID NO.73-74和SEQ ID NO.77-78和SEQ ID NO.81-82和tt
SEQ ID NO.85-86和SEQ ID NO.89-90和SEQ ID NO.93-94和tt
SEQ ID NO.97-98和SEQ ID NO.101-102和tt
SEQ ID NO.105-106和SEQ ID NO.109-110和tt
SEQ ID NO.113-114和SEQ ID NO.117-118和tt
SEQ ID NO.121-122和SEQ ID NO.125-126所示。tt
本发明还提供了用于鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的tt引物探针组合，是由32组引物探针组合构成，每组引物探针组合由tt一对引物及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ ID ttNO.1-128所示。tt
进一步地，本发明将上述32个位点的TaqMan-MGB探针和引物tt对组合，利用TaqMan OpenArray芯片制造技术制作成OpenArray芯片，tt该芯片命名为Rf-OA芯片，可同时检测96个样品。tt
本发明提供了上述分子标记或引物探针组合或OpenArray芯片在tt水稻种质资源鉴定中的应用。tt
本发明还提供了上述分子标记或引物探针组合或OpenArray芯片tt在培育三系杂交稻中的应用。tt
本发明的再一目的在于提供一种水稻CMS恢复基因Rf-1区段单tt倍型鉴定方法。tt
本领域技术人员可以根据本发明提供的上述分子标记，利用PCRtt的方法鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1的基因型，也可以利用上述引物探tt针组合或OpenArray芯片，采用荧光定量PCR方法进行水稻CMS恢复tt基因Rf-1的基因型鉴定，去除实验过程中缺失数据的位点，将所得结tt果与参照样品进行比较，判断单倍型，具体包括以下步骤：tt
(1)水稻基因组DNA提取：tt
根据检测需要从水稻种子、叶片等组织抽提基因组DNA。tt
(2)DNA样品质量检测：tt
用紫外分光光度计测量基因组DNA中蛋白质和有机物质污染水tt平，基因组DNA A260/280比值应在1.8-2.0之间，A260/230比值应tttttt在1.8-2.2之间，DNA工作液浓度10ng/μl；tt
(3)按照Life Technologies网站提供的标准操作方法进行操作,tt产生检测样品原始的基因型数据，即样品在特定位点上的基因型的型tt别，如纯合子1，纯合子2，杂合子或者无扩增杂交信号；tt
(4)数据分析：QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System仪tt器自带的分析软件产生基因型数据，经过缺失值的数据处理后，利用ttPowerMarker软件计算等位基因频率，按照SharedAllele距离计算方法tt计算材料间的遗传距离，并利用Mega5软件对材料间遗传距离的结果tt进行图形化展示，将材料间遗传距离为0的样品判定为相同单倍型，tt将材料间遗传距离小于0.04的样品判定为相近单倍型。tt
本发明提供上述方法在水稻种质资源鉴定及培育三系杂交稻中tt的应用。tt
本发明由于利用了多个标记进行目标区段的鉴定，比紧密连锁标tt记或单一的功能标记辅助选择更加准确，同时，本发明由于两端标记tt跨度大，相邻标记间距适中，可以准确鉴定导入片段的交换位点，克tt服连锁累赘问题，对于育种群体筛选更有指导意义。tt
附图说明tt
图1为分子标记在染色体上的分布示意图。左图为标记在基因组tt上的物理位置(参照日本晴基因组注释MSU6.1版)，右图为以目标基tt因Rf-1起始密码子ATG为参照的相对物理距离。图中垂直柱左侧数字tt为相对物理距离，右侧相应水平高度的符号为标记名称。tt
图2为四类标记典型检测效果图，(a)为标记TMRf1M07，(b)tt为标记Rfd11-2-R，(c)为标记d10-1，(d)为标记S80-2-R。横轴指示ttVIC荧光的信号水平，纵轴指示FAM荧光的信号水平；图中的圆点指tt示检测样品在特定的检测目标下出现的两种荧光水平，曲线代表了样tt品在每个循环中检测的两种荧光水平的变化趋势。图中I代表基因型tt为纯合子1，II代表基因型为纯合子2，III代表基因型为杂合子；黑色tttttt方框代表空白对照，“X”代表基因型不确定或者无扩增信号。tt
图3为Rf-1基因区段单倍型聚类图。其中，图3a为水稻各型CMStt恢复系及参照系共22份，利用32个标记基因型聚类结果图；图3btt为水稻各型CMS恢复系及参照系22份，利用3个基因片段测序分型tt聚类结果图。图下方的水平线是利用标记或序列评价材料间遗传距离tt的标尺，线上的数据是具体的距离值，聚类图中的水平线长度指示利tt用标记或序列评价材料间遗传距离大小，图右侧数值1-5指示的是聚tt类中选择一定的分类阈值之后的分类类别；“Z01”至“Z22”为材料tt代号。tt
图4为目标基因Rf-1导入片段分析示意图。左图为导入片段示意tt图：最左侧垂直线旁的数字为物理坐标，上方是四种基因型的形状注tt释，中心区域垂直柱显示的是该区段不同的重组个体的基因型，中间tt的横线指示标记的中心位置，垂直柱下方的符号为重组个体代号，重tt组个体代号下方连续的水平线指示个体中间具有相同亲本，再下方的tt符号指示重组个体的母本和父本。右图为导入片段区间多态性标记分tt布图：多态性标记在基因组上的物理位置(参照日本晴基因组注释ttMSU6.1版)，其中垂直柱左侧数字为物理位置，右侧相应水平高度的tt符号为标记名称。tt
具体实施方式tt
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未tt特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验tt手册(Sambrook J&Russell DW,Molecμlar cloning:a laboratory ttmanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。tt
实施例1 水稻CMS恢复基因Rf-1区段分子标记的设计tt
利用新一代测序技术(Illumina MiSeq测序仪)，对水稻野败型和tt包台型CMS恢复系亲本明恢63、红莲型CMS恢复系亲本9311、自主tt培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系亲本珍汕97进行全基因tttttt组平均20倍覆盖重测序，选定Rf-1基因及其上下游各200kb(遗传tt距离约1cM区间)范围，发掘变异位点。标记设计的具体步骤如下：tt
第一步，比对参考基因组，将各材料测序reads比对到Nipponbarett基因组，使用软件BWA进行比对，参考基因组序列是MSU第6.1版ttNipponbare的基因组序列。tt
第二步，鉴定筛选多态性位点，基于第一步的比对结果，使用软tt件SAMtools分析鉴定多态性位点，具体步骤如下:(1)位置碱基比tt对的质量值(MapQ值为50是特异性最强的reads，MapQ值小于40tt时将不会被采用)；(2)位置碱基测序的质量值大于或等于20；(3)tt位置碱基的杂合程度(碱基必须纯合)；(4)位置碱基的覆盖度(位tt点的覆盖度大于5小于1000)；(5)baseQ/BAQ的值小于15的位点不tt会被选定；(6)位置碱基的变异可能性Q值大于等于20。满足以上条tt件且变异位点周围的序列保守时，该位点将被用作开发标记的候选。tt
第三步，设计探针引物，将抽提包含候选变异位点的测序序列，tt利用Primer Express V3.0.1软件的TaqMan MGB Allelic Discriminationtt模块进行设计，如果软件给出设计结果，选择合适的探针、引物作为tt候选；否则，将序列转换为反向互补序列后，再次尝试设计，如果依tt然找不到合适的探针引物则视为标记设计未通过。如果一段序列上可tt以设计多个探针，则选择软件设计给出罚分最低的探针。以标记坐标tt平均分布的原则，在5个参考样品基因组重测序共线性的区段每10Kbtt设计一个标记，在平衡基因组之间的结构差异之后达到均匀分布。通tt过该方法在参考基因组坐标轴上设计32个成功分型的引物探针组，tt染色体上的物理位置跨度为18.69Mb-19.11Mb，其分布如图1所示。tt
获得的32个成功分型的引物探针组合，每组引物探针组合由一tt对引物及两条TaqMan-MGB探针组成，其序列分别如SEQ ID ttNO.1-128所示。组合命名规则为：首字段为标记的特异字段，区分tt不同的标记，如TMRf1M01、TMRf1M02、TMRf1M03等；后续字段tttttt为各组标记所包含的四条序列的特征字段，其中forward primer为引物tt对上游扩增引物、reverse primer为引物对下游扩增引物、TaqMan MGB ttProbe 1为探针序列1、TaqMan MGB Probe 2为探针序列2。tt
实施例2 水稻CMS恢复基因Rf-1区段OA芯片的制备tt
将实施例1获得的32个分子标记的128条序列SEQ ID No.1-ttSEQ ID No.128提交Life Technologies公司合成相应的引物和ttTaqMan-MGB探针，并制作OpenArray芯片，可同时检测96个样品。tt
实施例3 鉴定水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型的分子标记在检tt测水稻DNA样品中的应用效果验证tt
为验证水稻CMS恢复基因Rf-1区段单倍型鉴定方法，需要测试tt引物探针组合、OA芯片的实际检测及分型效果，通过比较设计参考tt的样品基因型与实际检测的基因型是否一致，从而判定引物探针组、ttOA芯片是否达到设计预期效果。该实施例具体步骤如下：tt
1.水稻基因组DNA提取：tt
根据检测需要从水稻种子、叶片等组织抽提基因组DNA，其中tt水稻幼嫩叶片DNA抽提采用Promega植物基因组抽提试剂盒标准流tt程抽提。tt
2.DNA样品质量检测：tt
用紫外分光光度计测量基因组DNA中蛋白质和有机物质污染水tt平，基因组DNA A260/280比值应在1.8-2.0之间，A260/230比值应tt在1.8-2.2之间，DNA工作液浓度10ng/μl。tt
3.基因型检测：tt
按照Life Technologies网站tt(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/4478673.pdf)提tt供的标准操作方法进行操作，产生检测样品原始的基因型数据，即样tt品在特定位点上的基因型的型别，如纯合子1，纯合子2，杂合子或tt者无扩增杂交信号。tt
4.数据分析：tt
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System仪器自带的分析软tt件，并根据图2所示的方式对标记的检测效果进行判读分类：(a)图tt相同类型圆点的聚类集中，不同类型圆点相互之间间距明显，呈现出tt直角平分之势，如标记TMRf1M07；(b)图不同类型圆点(或带曲线tt圆点)相互之间间距明显，呈现出直角平分之势，如标记Rfd11-2-R；tt(c)图不同类型圆点(或带曲线圆点)相互之间间距明显，呈现出tt锐角平分之势，如标记d10-1；(d)图不同类型圆点(或带曲线圆点)tt相互之间间距小，呈现出锐角平分之势，如标记S80-2-R。再经过缺tt失值的数据处理后，产生基因型数据，利用PowerMarker软件进行等tt位基因频率和材料间遗传距离的计算，并利用Mega5软件对材料间tt遗传距离的结果进行图形化展示。tt
5.结果解读——基因型检测鉴定结果与设计前基因型的比对：tt
使用水稻野败型和包台型CMS恢复系亲本明恢63，红莲型CMStt恢复系亲本9311，自主培育的优良恢复系G527和水稻野败型保持系tt亲本珍汕97，以及芯片开发中参考基因型材料日本晴。参考上述4tt个步骤进行实验，聚类结果如图3b所示，图中Z01(明恢63)、Z14tt(9311)、Z21(G527)、Z22(日本晴)分别聚在第1、2、4和5类tt中，该结果表明32个引物探针组能区分三种类型恢复系和常规粳稻。tt
实施例4 Rf-OA芯片在鉴定种质资源Rf-1基因区段单倍型中的应tt用tt
种质资源是育种的基础，鉴定种质的基因资源是育种应用的重要tt途径。本发明收集的一套种质资源主要是育种中不同细胞质雄性不育tt类型的恢复系，具体信息见表1。tt
利用Rf-OA芯片，本发明对17份不同胞质类型恢复系Rf-1基因tt区段(18.69Mb-19.11Mb)进行了标记组合的单倍型鉴定并整合5份tt参考样品的标记基因型数据进行了分析，实验操作参见实施例2中第tttttt1步至第4步。tt
根据基因分型结果利用PowerMarker3.25对上述材料进行聚类分tt析，聚类结果用Mega5进行作图展示，结果(图3b)显示，可以分tt为5种主要的单倍型。由于上述材料都是育种过程中形成的自然群tt体，根据连锁不平衡的规律，一般认为水稻群体的连锁不平衡衰减距tt离在500kb，故区段内选取位点的基因型可以反映该区段内基因的单tt倍型，为验证上述分型与具体的3个基因座位的单倍型是否对应，再tt次利用Sanger测序方法进行了下列研究，将17份样品和5份参考样tt品在Rf-1基因区段(18.69Mb-19.11Mb)的3个基因座位Rf4/Rf1a/Rf1btt基因区间LOC_Os10g35240(18760733..18764605)、LOC_Os10g35440tt(18880028..18882286)和LOC_Os10g35640(18985444..18988240)tt通过sanger测序，Mega5开展进化树分析(Tamura et al.,2011)，鉴tt定出3个基因的多种单倍型，其中，Rf4分为10种单倍型(Tang等，tt2014)：Rf4-1(比对参考样品明恢63，有恢复功能等位基因Rf4)，Rf4-2，ttRf4-3，Rf4-4，Rf4-5(比对参考样品9311，无恢复功能等位基因rf4-j)，ttRf4-6，Rf4-7，Rf4-8，Rf4-9，Rf4-10(比对参考样品日本晴，无恢复tt功能等位基因rf4-j)；Rf1a分为3种单倍型(Wang等，2006；Komoritt等，2004)：Rf1a-1(比对参考样品明恢63和9311，有恢复功能等位tt基因Rf1a),Rf1a-2,Rf1a-3(比对参考样品日本晴，无恢复功能等位tt基因rf1a)；rf1b分为7种单倍型(Wang等，2006)：Rf1b-1(比对参tt考样品明恢63，有恢复功能等位基因Rf1b)，Rf1b-2，Rf1b-3，Rf1b-4，ttRf1b-5，Rf1b-6，Rf1b-7(比对参考样品9311，无恢复功能等位基因ttrf1b)，详细结果见表1。3个基因组合分类，以3个基因位点测序拼tt接序列为数据，利用Mega5对上述材料进行聚类分析，结果见图3a，tt根据参考样品在已有报道中该区段的功能特征，进一步划分为5个类tt别。利用标记分型(图3b)和利用基因测序分型(图3a)具有相近tt的分类趋势，参考代表品系的3个基因座位的已知基因型，可以划分tttttt为：1、野败CMS恢复系亲本明恢63(Z01Rf4/Rf1a/Rf1b)代表群，tt三个恢复基因均为有功能的单倍型；2、红莲型CMS恢复系亲本9311tt(Z14rf4-i/Rf1a/rf1b)代表群，仅Rf1a恢复基因均有功能的单倍型；tt3、其他类群(Rf1b)，仅知道Rf1b为有功能的单倍型；4、自主培育tt的恢复系G527(Z21)，恢复基因为新型的功能的单倍型；5、Nip(Z22ttrf4-j/rf1a/rf1b)代表群，三个恢复基因均为无功能的单倍型。基于基tt因序列聚类(图3a)与标记单倍型聚类(图3b)，结果显示其有类似tt的分类趋势，表明利用区段单倍型能够反映功能基因位点序列的单倍tt型。tt
分类结果中，多数材料被归为了野败CMS恢复系类群，这与当tt前利用野败CMS不育系以及多数其他类型的不育系与野败CMS不tt育系具有类似的恢保关系有关，另外，还有一些不能确定对应功能的tt单倍型资源成为探索研究的新材料。tt
表1三个恢复基因测序分析分类结果tt
水稻CMS恢复基因Rf-1检测方法在鉴定种质资源区段单倍型tt时，能够确定不同材料之间有多态性的标记，从而方便地转换为单标tt记，利于群体改良过程中大规模前景筛选。再者，单倍型分析能够了tt解区段在多样性材料中的单倍型分类状况，辅助决策遗传改良的对tt象，缩减重复工作的数量，利于扩大育种改良的有效性。tt
实施例5 Rf-OA芯片在遗传改良培育三系中的应用tt
利用覆盖422kb范围的标记组构建的OpenArray芯片可以快速将tt交换位点锁定到平均20kb左右的范围，辅助选择更加小而有效的导tt入事件进行后续育种，进而大大地降低连锁累赘的影响，提升育种效tt率。tt
通过两个远端SSR标记筛选9311(轮回亲本)与R1128(目标Rf1tt恢复基因区段供体亲本)的BC1F1群体，发现173份重组单株，接着tt利用Rf-OA芯片检测了上述重组单株。基因型鉴定的实验操作参见实tt施例2中第1步至第3步。断点分析按照以下4步进行：第1步，校tt对原始基因型，比较每个标记在双亲之间的多态性，将有多态性的标tt记数据保留下来；第2步，基因型转换，根据被转育材料基因型记为ttA，转育材料基因型记为B，杂合基因型记为H的原则进行基因型转换；tt第3步，依照以下规则作图，对应参考基因组相邻的标记为同样的基tt因型时，将两者之间的区间认定为与两个相邻标记具有相同的基因tt型；对应参考基因组相邻的标记为不同的基因型时，将两者之间的区tt间认定为不确定基因型，即重组交换区间或断点区间；第4步，将多tt态性标记及对应坐标等信息加载到图中，如图4所示，其中左斜线tt方框所所示为被转育的材料基因型，右斜线方框所示为转育材料基因tt型；左右斜线交叉方框表示杂合状态基因型，空白方框表示位置基因tt型区间，即重组交换或断点区间。tt
在检测的转育后代材料中，一共找到37份在Rf-OA标记覆盖范tttttt围内的交换，均为单交换。具体结果从断点区间的分布来看，几乎覆tt盖了在整个标记区间，间距从3kb-120kb不等，图中仅展示了部分有tt多态性的标记(图4)。举例说明，代号为NIL01的单株，基因型结果tt为除一个标记Rfd14-3-R(SEQ ID No.125-128)为A(左斜线方框)tt以外，其他多态性标记均为H(左右斜线方框)，与其紧邻的标记ttRfd11-2-R(SEQ ID No.117-120)，参考断点分析步骤第3步，ttRfd14-3-R(SEQ ID No.125-128)与Rfd11-2-R(SEQ ID No.117-120)tt两个标记之间的区间用空白方框表示未知基因型，即断点区间，从图tt中可知两标记之间从19085kb-19119kb，相距34kb，即未知基因型tt的断点区间在大约34kb。图中展示的结果表明，针对少量标记辅助tt选择的个体进行区段的精细基因型鉴定是必要的，它可以减少含有不tt利连锁基因的单株进入后续育种环节，避免了育种资源的浪费。区段tt密集的标记鉴定相比单一的分子连锁标记鉴定更能保证目的基因不tt丢失，相比功能标记而言，更利于将可能的连锁累赘减少到最低，为tt后续的育种提供更加合适的候选单株。tt
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详tt尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本tt领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础tt上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。tt
