一种快速制备高通量测序文库的方法及应用
技术领域t
本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种快速制备高通量测序文库的方法及应用。t
背景技术t
现行的匹配Miseq及Hiseq测序平台的PCR产物高通量测序文库的构建方法一般是采用传统的文库构建方法，即：1)扩增模板DNA/RNA，将基因组DNA片段化；2)将DNA片段进行末端修复；3)在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加A；4)将具有粘性末端A的DNA片段与测序公司接头相连；5)将经过连接的DNA片段进行PCR扩增；6)分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库；其中，6个步骤之间均需进行产物纯化操作，具体来说，传统的文库构建流程如图1所示：t
通常这个流程需要15小时，即2个工作日。由于步骤繁多，各种试剂的使用、人工的耗损、多步操作的系统误差等因素使得现有PCR产物文库构建方法成本较高、污染频率较高、并进一步影响文库的构建质量。t
因此，建立一种步骤少，简单、快速、高效的制备高通量测序文库的方法。t
发明内容t
为解决上述问题，本发明提供了一种在PCR产物末端加Adapter的方法及应用，以及一种快速制备高通量测序文库的方法。t
第一方面，本发明提供了一种在PCR产物末端加Adapter的方法，包括如下Adapter连接体系： t
PCR产物 10ult
2×Quick ligase buffer 25ult
Adapter(1μM) 10ult
Quick ligase 5ul。t
优选地，将所述的Adapter连接体系在20°孵育15分钟，获得末端连接有Adapter的PCR产物。t
第二方面，本发明提供了一种快速制备高通量测序文库的方法，包括以下步骤:t
1)配置PCR体系，然后PCR扩增模板DNA，获得末端具有腺嘌呤脱氧核苷酸A的PCR产物，纯化PCR产物；t
2)配置如下Adapter连接体系，对纯化后PCR产物添加Adapter：t
纯化后的PCR产物 10ult
2×Quick ligase buffer 25ult
Adapter(1μM) 10ult
Quick ligase 5ult
用如上反应体系在20°孵育15分钟，获得连接产物；纯化连接产物；t
3)扩增纯化后的连接产物，获得末端具有测序公司index的扩增产物；t
4)纯化扩增产物，获得所述高通量测序文库。t
本发明对加adapter的反应体系进行了优化，通过多组实验，设计多组浓度梯度，摸索最优选的adapter浓度(即1μM)提高了加adapter的效率。t
值得注意的是，所述步骤(1)中的PCR体系中，本发明所述的“正向引物”和“正向引物”可为任意特异性引物对。t
进一步优选地，所述步骤(1)中，所述引物对为如SEQUENCE NO.1和 SEQUENCE NO.2所示的核苷酸序列，或者为如SEQUENCE NO.4和SEQUENCE NO.5所示的核苷酸序列。t
本发明所述步骤(1)的PCR体系中，所述模版DNA包括但不限于基因组、总RNA逆转录DNA产物或mRNA逆转录DNA产物。t
本发明第二方面采用具有加A特性的DNA聚合酶，比如Taq热启动酶，作为特定引物扩增模版DNA的酶，并优化酶的反应体系，提高其保真度及扩增效率，在进行PCR扩增完成的同时，即可稳定地在PCR产物的3’末端形成粘性末端A的结构；经过纯化PCR产物后进行加接头的工作，然后经过纯化继续进行文库扩增及对每个文库进行index添加，从而完成文库的构建。本发明步骤(1)提供的PCR扩增体系可直接替代高通量测序时文库构建步骤中的加A步骤，使得PCR扩增与加A两个步骤同时在1个体系中完成，大大提高了构库效率。t
本发明所述步骤(1)的PCR体系中，使用的Taq DNA聚合酶为行业内常用的可用于T/A克隆的Taq DNA聚合酶。本发明采用的“行业内常用的可用于T/A克隆的Taq DNA聚合酶”具有5’-3’DNA聚合酶活性，无3’-5’外切酶活性。使用该产品扩增得到的PCR产物的3’末端附有一个“A”碱基，可直接用于TA克隆。t
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的在PCR产物末端加Adapter的方法或如第二方面所述的快速制备高通量测序文库的方法在制备高通量测序文库中的应用。t
本发明提供的技术方案基于我们对该技术流程的深入研究，我们选择了最优的PCR反应体系(优选采用Taq酶)，从而在完成特定引物扩增模版DNA的步骤之后的同时就已经完成了加末端碱基A的工作流程，相比当前将模板扩增与加A步骤分开进行的方法，本发明大大的减少了整个构库时间；更重要的是，我们对加adapter的反应体系进行了优化，提高了加adapter的效率，降低了文库构建成本及人为操作误差出现的可能性。t
目前，高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX sequencer)、Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)等，应当指出的是，本发明提供的技术方案适用于目前任一一种二代高通量测序的文库构建工作，尤其可大大缩短Miseq及Hiseq测序平台中PCR产物的文库构建的工作时间，提高接头(adapter)的连接效果，进而提高目的产物的测序数据质量。t
本发明部分英文释义(若无释义，则为本领域技术人员常规理解，优选为高通量测序中的常规理解)：t
Adapter(adapter)：接头序列(根据具体的高通量测序平台，使用相应的接头序列，比如，illumina有PCR扩增接头和测序接头，分别用于文库构建和测序的引物；具体接头序列参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书)t
ligase buffer：连接酶缓冲液t
ligase：连接酶t
index：索引序列(测序公司用index来标记样品，以区分样品；具体索引序列参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书)t
附图说明t
图1为传统的文库构建流程图；t
图2为本发明提供的一种快速制备高通量测序文库的方法示意图；t
图3和图4为本发明实施例1提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；t
图5为本发明效果实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果。t
具体实施方式t
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。t
本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。t
实施例1t
图2为本发明提供的一种快速制备高通量测序文库的方法示意图。t
结合图2，本发明提供了一种快速制备高通量测序文库的方法，包括以下步骤:t
一、插入片段扩增t
选取人类基因组为模版进行1对引物的PCR扩增。t
采用以下Taq酶的反应体系：t
其中，所述引物对为引物对1：t
引物对1(针对肿瘤)：t
正向引物序列为：TTTTTTTTCACGGGAA(SEQUNEC NO.1)t
反向引物序列为：TATTGTTTATTAGCAC(SEQUNEC NO.2)t
采用的Taq DNA聚合酶为DongshengBio公司(货号为P1011)。t
并用以下条件进行反应t
本发明引物对1扩增后的PCR产物为150-200bp。t
二、PCR产物纯化t
用Qiagen PCR Production Purification Kit进行纯化。t
三、Adapter连接(采用(New England Biolabs)连接试剂盒)t
为充分说明本发明的有益效果，本发明实施例还提供了Adapter浓度分别为1pM、1nM或1μM时，进行平行实验，摸索最佳Adapter浓度；配置的连接体系如下：t
PCR insert 10ult
2×Quick ligase buffer 25ult
Adapter(1pM、1nM或1μM) 10ult
Quick ligase(New England Biolabs) 5ult
其中，Adapter信息如下： t
Multiplexing Adapters:t
5’P-GATCGGAAGAGCACACGTCT(SEQUNEC NO.3)t
5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQUNEC NO.4)t
其中，“P”表示磷酸化；t
用如上反应体系在20°孵育15分钟。t
四、连接产物纯化t
用Qiagen PCR Production Purification Kit进行纯化t
五、文库加index及扩增(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)PCR体系：t
用以上混合物进行以下PCR反应t
六、文库纯化 t
用Qiagen PCR Production Purification Kit进行纯化；获得高通量测序文库。t
对纯化后的高通量测序文库产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别如图3和图4所示。在图3-4中，“before”表示实施例1步骤二的纯化产物(没有添加Adapter和测序公司的index)，“after”即为实施例1步骤六的纯化产物。理论上，相对于“before”(约150-200bp)，“after”泳道的条带(即PCR产物经过接头连接以及加index后，约270-320bp)的长度会漂移(shift)约120bp，即胶图上的DNA条带会增大约120bp。t
由图3和图4可知，Adapter的浓度为1nM时，DNA条带基本无漂移；Adapter的浓度为1pM时，DNA条带出现轻微漂移；而Adapter的浓度为1μM时，DNA条带出现了明显的漂移，且符合理论值(约120bp)。t
效果实施例t
为增加本发明说服力，进一步验证实施例1步骤三的Adapter的浓度为1μM时，是否适用其他引物对，本发明还提供了效果实施例，效果实施例与实施例1的区别在于将实施例1步骤一Taq酶反应体系中的引物对1(针对肿瘤)改为引物对2(针对乙肝)：t
引物对2(针对乙肝)：t
正向引物序列为：CATCTTCTTGTTGGTTCTTCT(SEQUNEC NO.5)t
反向引物序列为：GCAGCAAAGCCCAAAAGACC(SEQUNEC NO.6)；t
此外，将实施例1步骤三的连接体系中的Adapter的浓度为设置为1μM和10μM。t
所构建的高通量测序文库产物经纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别如图5所示。理论上，相对于“before”(约300bp)，“after”泳道的条带(即PCR产物经过接头连接以及加index后，约420bp)的长度漂移(shift)约120bp，即胶图上的DNA条带增大约120bp。由图5可知，相对于10μM，Adapter的浓度为设置为1μM时，DNA条带出现了明显的漂移，且符合理论值(约120bp)。t
因此，本发明提供的Adapter的浓度设置为1μM可有效用于构建高通测序文库的Adapter连接体系。 t
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。t
