miRNA检测芯片及其制作方法和应用
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种miRNA检测芯片及其制作方法和应用。
背景技术
microRNA(微小RNA，又称miRNA)是一种长度为18～22nt的内生性非编码小RNA分子，普遍存在于动植物体内。microRNA是生物体内重要的基因表达调控子，参与调节胚胎早期发育、细胞增殖分化凋亡及新陈代谢等各个过程，其差异性表达与多种人类疾病的发生发展密切相关。不同疾病的不同阶段都有其相应的miRNA表达谱，且血清/血浆内源性miRNA相对比较稳定。近年来，miRNA在临床上被视作新型的生物标志物，可以为疾病的诊断、治疗提供全新的重要依据和研究思路。目前miRNA的主要检测方法有NorthernBlotting、微阵列技术以及RT-PCR等，这些技术都各自存在一定的检测缺陷，如NorthernBlotting方法复杂、耗时、成本高且灵敏度低；RT-PCR具有较好的准确性、较高的灵敏度，可以检测低丰度miRNA，但是由于miRNA的长度比引物更短造成扩增技术困难且不能高通量检测；微阵列技术虽然能够实现高通量检测miRNA，但其实验用试剂、仪器设备昂贵，成本高。
基因芯片技术可以一次性对样品中大量序列进行检测和分析，广泛应用于基因表达分析、病毒和细菌的鉴定、医疗诊断等领域。然而传统的基因芯片技术往往需要PCR实现信号的扩增，操作过于繁琐，灵敏度不高，难以适应高通量的基因的分析。
发明内容
基于此，有必要提供一种操作简便且可实现高通量检测的miRNA检测芯片及其制作方法和应用。
一种miRNA检测芯片，包括设有金膜的基底、特异性RNA探针和单链DNA探针；
所述特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列，所述特异性序列可与由所述目标miRNA逆转录形成的cDNA杂交；
所述特异性RNA探针的一端修饰生物素，所述生物素上结合有荧光标记物，所述特异性RNA探针的另一端修饰巯基，所述特异性RNA探针修饰有巯基的一端通过Au-S键固定在所述设有金膜的基底上；
所述单链DNA探针用于检测对照，所述单链DNA探针的一端修饰生物素，所述生物素上结合有荧光标记物，所述单链DNA探针的另一端修饰巯基，所述单链DNA探针修饰有巯基的一端通过Au-S键固定在所述设有金膜的基底上。
在一个实施例中，所述特异性RNA探针为一种，所述特异性RNA探针的序列为SEQIDNo.1或SEQIDNo.2。
在一个实施例中，所述特异性RNA探针为两种，所述特异性RNA探针的序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。
在一个实施例中，所述单链DNA探针的序列如SEQIDNo.3所示。
在一个实施例中，所述荧光标记物为异硫氰酸荧光素标记的链酶亲和素。
上述miRNA检测芯片的制作方法，包括如下步骤：
构建用于检测目标miRNA的特异性序列，所述特异性序列可与由目标miRNA逆转录形成的cDNA杂交，在所述特异性序列的一端修饰生物素并且将荧光标记物结合在所述生物素上，接着在所述特异性序列的另一端修饰巯基，得到特异性RNA探针；
构建用于检测对照的单链DNA序列，在所述单链DNA序列的一端修饰生物素并且将荧光标记物结合在所述生物素上，接着在所述单链DNA序列的另一端修饰巯基，得到单链DNA探针；
在基底表面形成一层金膜，得到设有金膜的基底；
将所述特异性RNA探针及所述单链DNA探针分别点样至所述设有金膜的基底上，4℃密封保存，使所述特异性RNA探针及所述单链DNA探针与所述设有金膜的基底之间发生Au-S键自组装而对探针进行固定；及
采用无水乙醇溶液封闭空白区域，得到所述miRNA检测芯片。
一种miRNA的检测方法，包括如下步骤：
提取待测miRNA，并以提取的所述待测miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，逆转录形成与所述待测miRNA互补的cDNA；
将上述任一实施例所述的miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到初始荧光强度；
在所述miRNA检测芯片中加入与所述待测miRNA互补的cDNA，得到miRNA/cDNA杂交体；
加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的cDNA；
洗涤除去游离的cDNA、核糖核酸酶以及荧光标记物，将所述miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度；以及
通过比较所述初始荧光强度和所述酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。
在一个实施例中，所述得到酶切后荧光强度后，还包括芯片再生步骤，所述芯片再生步骤为采用10mmol/L的NaOH溶液再生芯片表面，再以不含核糖核酸酶的水溶液冲洗芯片表面。
在一个实施例中，所述加入核糖核酸酶水解所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA的操作中，所述水解操作为将核糖核酸酶滴加在所述miRNA检测芯片表面，铺满探针区域，静置10分钟，使核糖核酸酶切割所述miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的cDNA，释放出来的cDNA又继续与芯片表面剩余的完整的miRNA探针链再杂交、再水解。
在一个实施例中，所述核糖核酸酶为RNaseH，所述RNaseH的浓度为60U/mL。
上述miRNA检测芯片中的特异性RNA探针和单链DNA探针均结合有荧光标记物，并且特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列。当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性序列杂交时，形成miRNA/cDNA杂交体。再通过使用核糖核酸酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，使得结合在特异性RNA探针上的荧光标记物脱离，通过比较芯片初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。同时，释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大检测效应，操作简便可以实现miRNA的高通量检测。
附图说明
图1为一实施方式的miRNA检测芯片的结构示意图；
图2为一实施方式的miRNA检测芯片的制作方法的流程图；
图3为一实施方式的miRNA的检测方法的流程图；
图4为cDNA浓度与初始荧光强度和酶切后荧光强度差值的标准曲线图；
图5a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上单链DNA探针区域的初始荧光强度照片；
图5b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上单链DNA探针区域的酶切后荧光强度照片；
图6a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性mir-29a-3pRNA探针区域的初始荧光强度照片；
图6b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性mir-29a-3pRNA探针区域的酶切后荧光强度照片；
图7a为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性mir-181a-5pRNA探针区域的初始荧光强度照片；
图7b为一实施方式的电动生物荧光显微镜下检测miRNA检测芯片上特异性mir-181a-5pRNA探针区域的酶切后荧光强度照片。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对miRNA检测芯片及其制作方法和应用做进一步的解释说明。
如图1所示，一实施方式的miRNA检测芯片100，包括设有金膜的基底110、特异性RNA探针120和单链DNA探针130。
基底为平板状的玻璃基片，金膜设在基底的一侧。
特异性RNA探针120的一端修饰生物素，生物素上结合有荧光标记物，特异性RNA探针120的另一端修饰巯基，特异性RNA探针120修饰有巯基的一端通过Au-S键与金膜结合，从而固定在设有金膜的基底100上。
单链DNA探针130的一端修饰生物素，生物素上结合有荧光标记物，单链DNA探针130的另一端修饰巯基，单链DNA探针130修饰有巯基的一端通过Au-S键与金膜结合，从而固定在设有金膜的基底100上。
具体的，生物素上结合的荧光标记物可以是异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链酶亲和素，异硫氰酸荧光素(FITC)标记在链酶亲和素上，生物素与链酶亲和素具有良好的亲和性，生物素能与荧光标记的链霉亲和素结合形成生物素-链霉亲和素-异硫氰酸荧光素系统，在后续的检测过程中实现检测信号的放大作用。
具体的，miRNA检测芯片100为微阵列芯片。
在一个实施方式中，miRNA检测芯片100上固定有一种特异性RNA探针120，特异性RNA探针120含有根据mir-29a-3p或mir-181a-5p设计的特异性序列，如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。
在另一个实施方式中，miRNA检测芯片100上固定有两种特异性RNA探针120，特异性RNA探针120含有根据mir-29a-3p和mir-181a-5p设计的特异性序列，两种特异性RNA探针120的序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
在一个实施方式中，miRNA检测芯片100上固定有用于检测对照的单链DNA探针130，单链DNA探针的序列根据特异性RNA探针120的序列设计，将设计好的特异性RNA探针120的序列中的尿嘧啶碱基(U)替换为胸腺嘧啶碱基(T)，得到单链DNA探针的序列。具体的，单链DNA探针的序列可以如SEQIDNo.3所示。
可以理解，在其他实施方式中，特异性RNA探针120和单链DNA探针130的序列不限于此，根据要检测的目标miRNA的序列，可以设计出不同的特异性RNA探针120和单链DNA探针。根据检测的需要，可以在miRNA检测芯片100上固定一种、两种甚至多种特异性RNA探针120。
miRNA检测芯片中既含有特异性RNA探针又含有用于检测对照的单链DNA探针，并且均带有荧光标记物质。检测时单链DNA探针可作为参照物，一方面检测miRNA检测芯片的有效性，另一方面可以作为特异性RNA探针检测结果的对比参照，在同一个芯片中检测得实验组与实验对照组的，提高检测数据的可靠性。
这种miRNA检测芯片，特异性RNA探针和单链DNA探针均结合有荧光标记物，并且特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列。当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性序列杂交时，形成miRNA/cDNA杂交体。再通过使用核糖核酸酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，使得结合在特异性RNA探针上的荧光标记物脱离，通过比较芯片初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。同时，释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大检测效应，操作简便可以实现miRNA的高通量检测。
如图2所示的上述miRNA检测芯片的制作方法，包括如下步骤：
S110、构建用于检测目标miRNA的特异性序列，该特异性序列可与由目标miRNA逆转录形成的cDNA杂交，在该特异性序列的一端修饰生物素并且将荧光标记物结合在生物素上，接着在另一端修饰巯基，得到特异性RNA探针。
在一个实施方式中，目标miRNA为一种，mir-29a-3p或mir-181a-5p，构建的特异性序列根据mir-29a-3p或mir-181a-5p设计，具体如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示。
在另一个实施方式中，目标miRNA有两种，分别为mir-29a-3p和mir-181a-5p，构建两种特异性序列，分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
S120、构建用于检测对照的单链DNA序列，在该单链DNA序列的一端修饰生物素并且将荧光标记物结合在生物素上，接着在另一端修饰巯基，得到单链DNA探针。
用于检测对照的单链DNA序列可以根据特异性RNA探针序列设计，将构建好检测目标miRNA的特异性序列中的尿嘧啶碱基(U)替换为胸腺嘧啶碱基(T)，得到单链DNA探针的序列。具体的，单链DNA探针的序列可以如SEQIDNo.3所示。
具体的，荧光标记物可以是异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链酶亲和素，生物素与链酶亲和素具有良好的亲和性，生物素能与荧光标记的链霉亲和素结合形成生物素-链霉亲和素-异硫氰酸荧光素系统，在后续的检测过程中实现检测信号的放大作用。
S130、在基底表面形成一层金膜，得到设有金膜的基底。
S140、将S110得到的特异性RNA探针及S120得到的单链DNA探针分别点样至S130得到的设有金膜的基底上，4℃密封保存，使特异性RNA探针及单链DNA探针与设有金膜的基底之间发生Au-S键自组装而对探针进行固定。
一般的，点样前要对设有金膜的基底清洗处理。
具体的，特异性RNA探针和单链DNA探针以溶液的形式存在，将特异性RNA探针和单链DNA探针稀释至1μmol/L，点样至设有金膜的基底上。
具体的，密封保存的条件为4℃下密封保存16h，使特异性RNA探针及单链DNA探针与设有金膜的基底充分结合，通过探针上带有的巯基与金膜之间发生Au-S键自组装而对探针进行固定。
S150、采用无水乙醇溶液封闭空白区域，得到miRNA检测芯片。
具体的，在miRNA检测芯片上固定好探针之后，用1mmol/L的mPEG-SH无水乙醇溶液浸泡两小时以上，封闭芯片表面的空白区域，即得到miRNA检测芯片。
具体的，构建的miRNA检测芯片为微阵列芯片。
上述miRNA检测芯片中的特异性RNA探针和单链DNA探针均结合有荧光标记物，并且特异性RNA探针含有用于检测目标miRNA的特异性序列。当待测miRNA逆转录形成的cDNA能与该特异性序列杂交时，形成miRNA/cDNA杂交体。再通过使用核糖核酸酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，使得结合在特异性RNA探针上的荧光标记物脱离，通过比较芯片初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。同时，释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大检测效应，操作简便可以实现miRNA的高通量检测。
如图3所示的一种miRNA的检测方法，其包括如下步骤：
S210、提取待测miRNA，并以提取的待测miRNA为模板，在逆转录酶的作用下，逆转录形成与待测miRNA互补的cDNA。
具体的，从待测样本中提取待测miRNA后，可以采用特异性茎环逆转录引物将样本中miRNA逆转录成cDNA。
S220、将制作好的miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到初始荧光强度。
具体的，荧光显微镜为电动生物荧光显微镜。
S230、在miRNA检测芯片中加入与待测miRNA互补的cDNA，得到miRNA/cDNA杂交体。
在检测了芯片的初始荧光后，将芯片从荧光显微镜中取出，放置在平面操作台上，加入一定量的上述miRNA逆转录成的cDNA。若样本中含有目标miRNA，则由其转录成的cDNA能够与miRNA检测芯片中的RNA探针杂交，形成miRNA/cDNA杂交体。
S240、加入核糖核酸酶水解miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的cDNA。
具体的，核糖核酸酶为RNaseH，RNaseH的浓度为60U/mL。RNaseH是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA和RNA杂合链中的RNA，而不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能水解单链或双链DNA或RNA。
具体的，水解操作为将核糖核酸酶滴加在miRNA检测芯片表面，铺满探针区域，静置10分钟，使核糖核酸酶切割miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的cDNA，释放出来的cDNA又继续与芯片表面剩余的完整的miRNA探针链再杂交、再水解。循环水解，实现以少量的cDNA造成大量的miRNA水解。
S250、洗涤除去游离的cDNA、核糖核酸酶以及荧光标记物，将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度。
采用RNase-freewater(不含核糖核酸酶的水)冲洗芯片表面，除去芯片上游离的cDNA、核糖核酸酶、荧光标记物以及水解的miRNA等，再将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度。
若需要检测两种或两种以上miRNA，采用含有两种或两种以上特异性RNA探针的检测芯片，按上述步骤检测一种miRNA后，将检测芯片再生，芯片再生步骤为采用10mmol/L的NaOH溶液再生芯片表面，再以RNase-freewater(不含核糖核酸酶的水)冲洗芯片表面，之后按上述步骤检测另一种miRNA即可。
S260、通过比较初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。
通过比较初始荧光强度和酶切后荧光强度可以定性的检测待测样本中是否含有目标miRNA。
进一步的，可以通过在芯片中加入已知浓度的cDNA，得到cDNA浓度与初始荧光强度和酶切后荧光强度的差值的标准曲线。随后将待测样本提取的miRNA逆转录形成的cDNA加入芯片，得到样本的初始荧光强度和酶切后荧光强度的差值，通过标准曲线可以定量的计算出待测miRNA逆转录形成的目标cDNA的含量，进一步反推出待测样本中目标miRNA含量。
上述miRNA的检测方法，所使用的miRNA检测芯片中既含有特异性RNA探针又含有用于检测对照的单链DNA探针，并且均带有荧光标记物质。检测时单链DNA探针可作为参照物，一方面检测miRNA检测芯片的有效性，另一方面可以作为特异性RNA探针检测结果的对比参照，在同一个芯片中检测实验组与实验对照组，提高检测数据的可靠性。通过比较芯片初始荧光强度和酶切后荧光强度，获得miRNA检测芯片表面的特异性RNA探针的降解量，从而得到待测miRNA的含量。同时，释放的cDNA可以反复与芯片表面的特异性RNA序列结合，再水解，直到芯片表面的RAN探针完全被水解，从而形成了一种基于非PCR的放大检测效应，操作简便可以实现miRNA的高通量检测。这种miRNA的检测方法，通过简便的荧光检测技术平台，辅以高效的循环酶切信号放大技术，实现miRNA的灵敏检测，为疾病相关miRNA表达谱筛查提供有效手段，具有较强的实际应用潜力。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，
仪器：电动生物荧光显微镜(德国Zeiss)；芯片(苏州偲聚生物材料有限公司)。
试剂：特异性RNA探针和单链DNA探针(大连Takara公司)；探针互补cDNA(大连Takara公司)；RNaseH酶(大连Takara公司)。
实施例1构建miRNA检测芯片
构建含有两种特异性RNA探针的miRNA检测芯片，可以检测mir-29a-3p和mir-181a-5p，两种特异性序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。单链DNA的序列如SEQIDNo.3所示。在构建好的特异性序列的一端修饰生物素并且将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链酶亲和素结合在生物素上，接着在另一端修饰巯基，得到特异性RNA探针和DNA探针。将稀释好的1μmol/L的特异性RNA探针和单链DNA探针分别手工点样于清洗处理好的芯片金膜表面，4℃密封保存16小时，使巯基化探针与金膜之间发生Au-S键自组装而对探针进行固定。探针固定好之后，采用1mmol/L的mPEG-SH无水乙醇溶液浸泡2小时以上，封闭芯片表面为固定探针的空白区域。将芯片放在电动生物荧光显微镜下进行荧光检测，记录其荧光强度，记为初始荧光强度。
实施例2制作标准曲线
从显微镜下取出芯片，放置在平面操作台上，加入一系列已知浓度的mir-29a-3p对应的标准cDNA，静置10分钟。加入60U/mL的RNaseH酶溶液，铺满探针区域，静置10分钟，使RNaseH酶切割miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，释放出杂交体中的cDNA，释放出来的cDNA又继续与芯片表面剩余的完整的miRNA探针链再杂交、再水解。循环水解，实现以少量的cDNA造成大量的miRNA水解。用RNase-freewater洗涤除去游离的cDNA、RNaseH酶以及荧光标记物，将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度。cDNA浓度与ΔI(初始荧光强度－酶切后荧光强度)的关系如表1所示：
表1：cDNA浓度与ΔI关系表
根据表1绘制的标准曲线如图4所示。
实施例3cDNA与单链DNA探针结合酶切前后荧光强度对比
电动生物荧光显微镜(德国Zeiss)下检测miRNA检测芯片上单链DNA探针区域的初始荧光强度照片，检测得荧光强度为1380，初始荧光强度照片如图5a所示。将100nmol/L人工合成的标准cDNA样品滴加到单链DNA探针区域，静置10分钟，使其与单链DNA充分杂交。之后将60U/mL的RNaseH酶溶液滴加到芯片表面，静置10分钟。再用RNase-freewater洗涤除去游离的cDNA、RNaseH酶以及荧光标记物。将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度，检测得荧光强度为1300，酶切后荧光强度照片如图5b所示。由图5a和图5b可知，初始荧光强度与酶切后荧光强度相差不大，说明RNaseH酶只特异性针对DNA和RNA杂合链中的RNA起作用。
实施例4cDNA与RNA探针结合酶切前后荧光强度对比
电动生物荧光显微镜(德国Zeiss)下检测miRNA检测芯片上特异性mir-29a-3pRNA探针区域的初始荧光强度，检测得荧光强度为1400，初始荧光强度照片如图6a所示。将100nmol/L人工合成的mir-29a-3p对应的标准cDNA样品滴加到RNA探针区域，静置10分钟，使其与RNA探针充分杂交，得到miRNA/cDNA杂交体，之后将60U/mL的RNaseH酶溶液滴加到芯片表面，静置10分钟，使RNaseH酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA，再用RNase-freewater洗涤除去游离的cDNA、RNaseH酶以及荧光标记物，将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度，检测得荧光强度为480，酶切后荧光强度照片如图6b所示。
采用10mmol/L的NaOH溶液再生miRNA检测芯片表面，再以RNase-freewater(不含核糖核酸酶的水)冲洗芯片表面。电动生物荧光显微镜(德国Zeiss)下检测miRNA检测芯片上特异性mir-181a-5pRNA探针区域的初始荧光强度，检测得荧光强度为1450，初始荧光强度照片如图7a所示。将100nmol/L人工合成的mir-181a-5p对应的标准cDNA样品滴加到RNA探针区域，静置10分钟，使其与RNA探针充分杂交得到miRNA/cDNA杂交体。之后将60U/mL的RNaseH酶溶液滴加到芯片表面，静置10分钟，使RNaseH酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA。再用RNase-freewater洗涤除去游离的cDNA、RNaseH酶以及荧光标记物，将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度，检测得荧光强度为350，酶切后荧光强度照片如图7b所示。
由图6a、图6b、图7a以及图7b可以看出，在RNA探针区域加入与特异性RNA序列对应的标准cDNA样品，再加入RNaseH酶酶切，酶切后荧光强度比芯片的初始荧光强度减弱了，因为RNaseH酶能特异性针对DNA和RNA杂合链中的RNA起作用，将miRNA/cDNA杂交体中的miRNA水解。
实施例5甲流患者咽拭子样本中miRNA的检测
从甲流患者咽拭子样本中提取miRNA，采用特异性茎环逆转录引物将样本中mir-29a-3p逆转录成cDNA，滴入构建好的芯片中，检测得芯片的初始荧光强度为1212，将60U/mL的RNaseH酶溶液滴加到芯片表面，静置10分钟，使RNaseH酶酶切miRNA/cDNA杂交体中的miRNA。再用RNase-freewater洗涤除去游离的cDNA、RNaseH酶以及荧光标记物，将miRNA检测芯片置于荧光显微镜下进行荧光检测，得到酶切后荧光强度为960。ΔI(初始荧光强度－酶切后荧光强度)等于252，根据图4中的标准曲线，推算出逆转录成的cDNA含量为15nmol/L，反推检测样本中mir-29a-3pmiRNA的量为15nmol/L。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
