检测脑脊液病原菌的基因芯片
技术领域:t
本发明涉及生物技术领域的基因芯片,特别涉及一种检测脑脊液病原菌的基因芯片。t
背景技术:t
化脓性脑膜炎在发达国家成人中年发病率为十万分之四至十万分之六,是一种严重危害人类健康的疾病,尽管抗菌药物在临床的应用使得许多病例获得治愈,但该疾病在世界范围内的发病率和病死率至今仍保持难以接受的高水平。据最近报道,化脓性脑膜炎的平均病死率仍大于20%。由于抗生素的泛滥、疫苗接种和病人免疫力下降等许多因素的影响,目前化脓性脑膜炎致病菌的种类和耐药性较以前已发生明显变化。t
目前脑脊液(CSF)涂片染色和细菌培养是诊断化脓性脑膜炎的重要手段,其中能检测到的细菌可达数十种,但由于面临着抗生素的早期使用、菌种变迁、混合感染等问题,导致CSF细菌培养阳性率较低,且无典型的影像学表现,严重影响临床诊断,临床医生只能根据经验,不能为患者提供个体化治疗方案,这也是造成抗生素滥用的重要原因。如何快速明确致病菌成为神经科医生急需解决的问题。既往采用PCR方法对Sp、E.coli、Hi和Sa等多种病原菌进行检测,敏感性和特异性均高于CSF培养,为病原学诊断提供了依据,但由于费用高、操作复杂、假阳性率较高等缺点,而被国家行政部门叫停。t
基因芯片技术是采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针有序地固化于支持物上,然后与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析,获得样品的基因序列、基因表达信息等遗传信息。具有可实现样品的高通量检测、提高检测速度;可对大量样品进行并行检测,保证了检测结果的精确性和准确性;分析过程中可采用多色荧光(多达4种)对样品进行标记,同时对多个生物样品进行分析,减少了人为因素的干扰,提高了检测的准确性,降低了试剂的消耗;缩短检测时间;特异性较强:可完全实现自动化及快速检测。在芯片制备和结果检测以及信号分析、处理过程中采用计算机控制,使分析、检测结果更为客观、准确。t
发明内容:t
鉴于此,有必要设计一种检测脑脊液病原菌的基因芯片。t
一种检测脑脊液病原菌的基因芯片,包括片基和探针,探针固定在片基上,探针布局如表1所示:t
表1t
表1中,HEX为点样质控探针;NC为杂交阴性质控探针;PC为杂交阳性质控探针。t
表1中所涉及的化脓性脑膜炎常见病原菌如下表所示:t
表2t
探针序列如表3所示:t
表3t
优选的,片基为自载玻片、硅片、膜或高分子材料。t
本发明中,所述的基因芯片又称DNA芯片、生物芯片,本发明的实施例中,将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息;具体而言,其测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法,在一块基片表面固定了序列已知的核苷酸的探针;当溶液中带有荧光标记的核酸序列,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度最强的探针位置,获得一组序列完全互补的探针序列;据此可重组出靶核酸的序列。t
所述的基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上,可一次性对样品大量序列进行检测和分析,解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和NorthernBlotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足;而且,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。t
本发明中,所述的基因芯片的制备方法,主要有原位合成法和点样法:其中,(1)原位合成法是基于组合化学的合成原理,通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序,把腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基的核苷酸按不同次序化学偶联在相应的位点,原位合成序列不同的寡核苷酸探针,形成DNA芯片;(2)点样法制备基因芯片首先按常规方法制备cDNA(或寡核苷酸)探针库,然后通过特殊的微喷头,分别把不同的探针溶液按照预先排定的顺序逐点点在片基表面,并通过物理和化学作用使探针固定于基片表面,探针片段除了可使用寡聚核苷酸探针,也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针(如PNA等);t
上述的基因芯片的制备方法为公知技术,本领域的技术人员可依据现有的技术制备得到检测化脓性脑膜炎脑脊液病原菌的基因芯片。t
本发明的检测化脓性脑膜炎脑脊液病原菌的基因芯片与现有技术相比,具有以下的有益效果:t
(1)所述的诊断芯片操作步骤简单,检测特异性高,稳定性好,所述的诊断芯片多次试验重复性高。t
(2)检测所需的时间短,从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成;可实现样品的高通量检测;可对大量样品进行并行检测。t
(3)分析过程中可采用多色荧光(多达4种)对样品进行标记,同时对多个生物样品进行分析,减少了人为因素的干扰,提高了检测的准确性。t
(4)反应体积小,降低了试剂的消耗;反应物在单位体积内浓度高,反应快,缩短检测时间;特异性较强:基因芯片检测的特异性与传统PCR结合探针杂交检测的特异性一致。t
(5)可完全实现自动化及快速检测。在芯片制备和结果检测以及信号分析、处理过程中采用计算机控制,使分析、检测结果更为客观、准确。t
(6)化脓性脑膜炎基因芯片检测技术可以对常见致病菌高效诊断,能够大大节省时间和劳动力,指导临床合理选择抗生素。t
(7)该技术可能会为临床鉴别诊断脑膜炎类型及筛选抗生素提供依据,为中枢神经系统其它病原体感染乃至其它系统感染性疾病病原体的诊断探讨出一条途径和方法。t
本发明的检测化脓性脑膜炎脑脊液病原菌的基因芯片,操作步骤简单、检测特异性高、稳定性好、时间短、成本低,可快速、低成本、大通量和自动化检测化脓性脑膜炎脑脊液病原菌的种类,可以检测到临床脑脊液中的细菌的种类,其敏感性高于细菌培养,从而为化脓性脑膜炎的诊断提供帮助。t
附图说明:t
附图1是CNS-人葡萄球菌芯片杂交图。t
附图2是大肠杆菌芯片杂交图。t
附图3是金黄色葡萄球菌芯片杂交图。t
附图4是流感嗜血杆菌芯片杂交图。t
附图5是脑膜炎奈瑟氏菌芯片杂交图。t
附图6是肺炎链球菌芯片杂交图。t
附图7是表皮葡萄球菌芯片杂交图。t
附图8是阴性对照芯片杂交图。t
具体实施方式:t
步骤一:检测探针的设计与制备:t
化脓性脑膜炎脑常见的病原菌有如下表所示:t
将上表中的病原菌,从NCBI的Taxonomy数据库中,查找每种微生物在数据库中的TaxonomyID信息等t
利用生物信息学手段,检索每个病原菌的16SrRNA序列,并根据这些序列使用相关生物信息学软件(DNAStar等软件)针对每个待检测病原菌设计寡核苷酸探针,针对7种待测病原菌设计并优化出153条探针,这些探针覆盖了这7种菌的大部分常见的亚型。t
采用晶芯基因芯片点样液和水,将寡核苷酸探针配制成特定浓度点样液,然后按照点阵排布模式转移至孔板的相应位置,并用封口膜密封,准备点样。t
上表为含有153条微生物检测探针以及相应的质控探针的基因芯片布局,其中,HEX为点样质控探针;NC为杂交阴性质控探针;PC为杂交阳性质控探针。t
步骤二:基因芯片的制备t
2.1基因芯片的物理点制t
A.片基制作:将光学玻片在铬酸洗液中浸泡过夜,取出后用纯化水洗掉表面的残液,用1%APTES乙醇溶液进行硅烷化处理1h,清洗后烘干,即成氨基基片。对氨基片基采用浓度为1.25%的戊二醛溶液进行醛基化,最后对醛基化后的片基进行清洗得到醛基片基。t
B.点样:将探针溶解在点样缓冲液中,稀释成终浓度为20μmol/L,利用点样仪将制备好的点样探针溶液点制到芯片片基上。芯片点样选用博奥生物有限公司的晶芯SmartArrayerTM136微阵列芯片生产系统。t
C.探针固定:将点样后芯片上的探针固定到醛基片基上,具体方法如下:①将点制后的芯片放入湿润的芯片盒,于37℃放置16h以上后取出。②经扫描合格后,依次用0.2%SDS和纯化水洗涤,以除去未键合上的寡核苷酸,清洗后的芯片离心甩干。③将上步中的芯片浸入硼氢化钠溶液中,封闭5min后用纯化水洗两次后离心甩干。t
2.2基因芯片的预扫描t
将制备好的化脓性脑膜炎脑脊液致病菌检测芯片放入晶芯Luxscan-10K芯片检测平台内,使用cy3光道观察芯片的阵列位置和点样效果。观察质控探针的反应确认芯片点制效果。t
2.3基因芯片的检测t
A.将目标样品DNA的PCR产物,使用Klenow酶片段化并经过cy3荧光标记。取荧光标记产物15μL,加入4×杂交缓冲液5μL,,95℃变性3min,冰上备用。t
B.取出芯片杂交盒,在杂交盒内支架周围滴200μL左右ddH2O(保证杂交时芯片湿度),将标记后的样品通过芯片盖片加入芯片,密封杂交盒,将杂交盒放入杂交仪,50℃杂交2h或过夜。t
C.取出杂交盒,将芯片与盖片放入50℃1×洗脱液Ⅱ内使芯片与盖片自然分离(避免不同样品间的污染),将芯片放入芯片清洗仪,设定程序,1×洗脱液I清洗两遍,1×洗脱液Ⅱ清洗三遍,使用芯片甩干机离心1分钟。t
D.芯片扫描:将杂交洗脱后的芯片置于晶芯Lux-scan10K检测平台中,使用CY3光道进行检测,调节扫描的强度和背景值,使Laserpower:90%,PMT:70%。t
E.待扫描结束后通过图片进行结果判断。t
本基因芯片与各病原菌的杂交信号见附图1~8。t
序列表t
<110>宁夏医科大学总医院t
<120>检测脑脊液病原菌的基因芯片t
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<211>20t
<212>DNAt
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<400>124t
ATGTACACAGAAATGAGACT20t
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<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)t
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<212>DNAt
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)t
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GACAGGTACTGTCATTCGTT20t
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<212>DNAt
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)t
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GCAGATGGAGAAATCTTCAC20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)t
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AAATCACATTAAGAGATGAA20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)t
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<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
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GTAATTGAGAAAGACAATTG20t
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<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
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<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
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<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
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CATCGTAATGGCACGATTTA20t
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<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
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<400>140t
TACAGCTATTCGATTCAAAG20t
<210>141t
<211>20t
<212>DNAt
<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
<400>141t
ACTTCAAAAGCGTATACGTG20t
<210>142t
<211>20t
<212>DNAt
<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
<400>142t
TCCATCTGTAGGACGCATTA20t
<210>143t
<211>20t
<212>DNAt
<213>表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)t
<400>143t
GTAGGACGCATTATTGTTGA20t
<210>144t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>144t
GAACTTGAAATAGTTGGAGA20t
<210>145t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>145t
GTCGTCAGTTGTTAATGCCC20t
<210>146t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>146t
CGCAGAACTTGAAATAGTTG20t
<210>147t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>147t
ACCAAGCATTATCATTATGA20t
<210>148t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>148t
CAACGAGAACAAGGATGTAA20t
<210>149t
<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
<400>149t
GCCAATAATATTCATACACA20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
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GACCAAATTGGGAAATAGCG20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
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TTCTTCTAATAACCCTGCTG20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
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AGATGATTCGATTACTGTTG20t
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<211>20t
<212>DNAt
<213>肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)t
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AGCGCCAAGGTTTGGAACAA20t