一组人肺鳞癌诊断用LncRNA生物标志物
技术领域tt
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一组人肺鳞癌诊断用LncRNA生物标志物、相关tt试剂盒以及他们的用途。tt
背景技术tt
非小细胞肺癌是造成全世界癌症相关死亡的首要原因之一。它主要包括四种组织学亚型：tt腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和其他(神经内分泌癌，良性肿瘤等)。鳞状细胞癌大约占所tt有非小细胞肺癌的30％，是致死率仅次于腺癌的非小细胞癌，肺鳞癌多见于老年男性，与吸tt烟有密切关系。由于非小细胞肺癌的五年生存率低于15％，早期诊断能有效的降低其死亡率。tt
低剂量螺旋CT在早期肺癌尤其在肺部结节的筛查方面具有较高的敏感性，同时避免了tt其他创伤性检查。然而正是由于其较高的敏感性，也使得其扫描筛查肺癌的假阳性率较高，tt存在“过度诊断”，导致一些不必要的检查、活检和手术。肿瘤标志物检测具有成本低，取tt样方便的特点，可作为早期肺癌检测的辅助手段。然而目前常用的肿瘤蛋白标志物如ttCEA,CY211等的检测缺乏肺癌组织特异性，限制了其在肺癌早期检测上的应用。因此探索和tt发展具有高灵敏度高特异性的肿瘤标志物具有重要的科学和临床意义。最近的研究表明90％tt的基因组转录产物不具有编码能力，尽管如此，越来越多的实验证实这些非编码RNA具有重tt要的生理学及病理学功能。非编码RNA根据长度不同可分为短链非编码RNA(小于200bp)tt和长链非编码RNA(长于200bp)。长链非编码RNA(LncRNA)又可以分为反义长非编码ttRNA，内含子非编码RNA(LincRNA)，启动子相关LncRNA和基因间LncRNA等。作为tt非编码RNA的重要的一类，LncRNA广泛参与如增殖、细胞周期、染色体重塑和组蛋白修饰tt等细胞和生命活动的调节。已有的一些研究在许多肿瘤组织中发现了lncRNA的异常表达，tt并且我们前期的研究也筛选出了一组用于早期肺腺癌检测的长链非编码RNA标志物。目前肺tt鳞癌相关的lncRNA表达研究还处在初步阶段，对lncRNA作为肺鳞癌肿瘤标志物的潜力尚tt未有一个很好的评估。探索LncRNA在肺鳞癌的生物学功能以及LncRNA的表达与肺鳞癌的tt关系对了解肺鳞癌的发生发展以及早期检测具有重大意义。tt
发明内容tt
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一组人肺鳞癌诊断用LncRNA生tt物标志物，用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的LncRNA生物标志物对于人肺鳞癌tttttt具有很高的灵敏度和特异性，尤其对人早期肺鳞癌具有很好的检测效果，可以作为新型的生tt物标志物用于肺鳞癌的检测。tt
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一组人肺鳞癌诊断用LncRNA生tt物标志物，所述LncRNA生物标志物包括：ENST00000453324、ENST00000441841、uc011cly.2、ttNR_046326和NR_028500。tt
优选的，所述人肺鳞癌为人早期肺鳞癌。tt
所述ENST00000453324的序列如SeqIDNo：1所示；tt
所述ENST00000441841的序列如SeqIDNo：2所示；tt
所述uc011cly.2的序列如SeqIDNo：3所示；tt
所述NR_046326的序列如SeqIDNo：4所示；tt
所述NR_028500的序列如SeqIDNo：5所示。tt
优选的，所述LncRNA生物标志物还包括：ENST00000393515、ENST00000400498和ttENST00000423466。tt
所述ENST00000393515的序列如SeqIDNo：6所示；tt
所述ENST00000400498的序列如SeqIDNo：7所示；tt
所述ENST00000423466的序列如SeqIDNo：8所示。tt
本发明第二方面提供所述LncRNA生物标志物在制备或筛选人肺鳞癌的肿瘤诊断药物中tt的用途。tt
优选的，所述用途具体为制备或筛选人早期肺鳞癌的肿瘤诊断药物中的用途。tt
本发明第三方面提供一组人肺鳞癌诊断用LncRNA引物的组合，所述LncRNA引物的组tt合包括：针对ENST00000453324的特异性引物、针对ENST00000441841的特异性引物、针tt对uc011cly.2的特异性引物、针对NR_046326的特异性引物、针对NR_028500的特异性引物。tt
优选的，所述针对ENST00000453324的特异性引物包括序列如SEQIDNo：9所示的前tt引物，序列如SEQIDNo：10所示的后引物；所述针对ENST00000441841的特异性引物包tt括序列如SEQIDNo：11所示的前引物，序列如SEQIDNo：12所示的后引物；所述针对ttuc011cly.2的特异性引物包括序列如SEQIDNo：13所示的前引物，序列如SEQIDNo：14tt所示的后引物；所述针对NR_046326的特异性引物包括序列如SEQIDNo：15所示的前引tt物，序列如SEQIDNo：16所示的后引物；所述针对NR_028500的特异性引物包括序列如ttSEQIDNo：17所示的前引物、序列如SEQIDNo：18所示的后引物。tt
优选的，所述LncRNA引物的组合还包括：针对ENST00000393515的特异性引物、针tttttt对ENST00000400498的特异性引物、针对ENST00000423466的特异性引物。tt
更优选的，所述针对ENST00000393515的特异性引物包括序列如SEQIDNo：19所示tt的前引物，序列如SEQIDNo：20所示的后引物；所述针对ENST00000400498的特异性引tt物包括序列如SEQIDNo：21所示的前引物，序列如SEQIDNo：22所示的后引物；所述tt针对ENST00000423466的特异性引物包括序列如SEQIDNo：23所示的前引物，序列如SEQttIDNo：24所示的后引物。tt
本发明第四方面提供所述的LncRNA引物的组合在制备或筛选人肺鳞癌的肿瘤诊断药物tt中的用途。tt
优选的，所述用途具体为制备或筛选人早期肺鳞癌的肿瘤诊断药物中的用途。tt
本发明第五方面提供一种诊断试剂盒，包括所述的LncRNA引物的组合。tt
优选的，所述诊断试剂盒为人肺鳞癌的肿瘤诊断试剂盒。tt
优选的，所述试剂盒还包括标记物。tt
所述标记物用于标记所述特异性引物的扩增产物，本领域技术人员可根据实际需要，选tt择合适的标记物，对所述特异性引物的扩增产物进行标记。tt
更优选的，所述标记物为用于标记双链DNA的荧光标记物。在本发明一实施例中，所tt述标记物为SYBRGreen。tt
优选的，所述试剂盒还可包括RNA抽提试剂、RT-PCR试剂中的一种或多种的组合。tt
所述RNA抽提试剂可使用本领域各种总RNA抽提试剂，这些试剂均可通过市售途径获tt得。tt
所述RT-PCR试剂可采用本领域各种RT-PCR试剂，具体可包括：dNTP、逆转录引物(随tt机引物)、还原剂、RNase抑制剂、逆转录酶、MgCl2、工艺用水、逆转录缓冲液等中的一种tt或多种的组合。tt
本发明第六方面提供一种检测人肺鳞癌的LncRNA芯片，所述LncRNA芯片包括固相载tt体以及固定于固相载体上的针对所述的LncRNA生物标志物的探针。tt
本领域技术人员可根据经验，设计能够检测相关LncRNA生物标志物的探针，如本领域tt已经被广泛使用的荧光探针等。具体来说，所述荧光探针可以为寡核苷酸探针，所述的寡核tt苷酸探针对应于LncRNA部分或全部序列。tt
本发明所提供的人肺鳞癌诊断用LncRNA生物标志物，可用来区分人肺鳞癌组织，尤其tt是人早期肺鳞癌。其区分早期肺鳞癌和配对正常肺组织的AUC可达0.932，显著性高于这5tt个LncRNAs单独诊断早期肺鳞癌的AUC(p<0.05)，其ROC曲线表明这5个LncRNAs诊断tttttt早期肺鳞癌的灵敏度和特异性分别为92％和87％，显著性高于单个LncRNA用于肺鳞癌诊断tt的灵敏度和特异性(p<0.05)。tt
附图说明tt
图1显示为本发明8个LncRNAs联合起来区分训练集(n＝33)肺鳞癌及其配对正常肺组tt织的ROC曲线图；tt
图2-A显示为本发明优化的5个LncRNAs联合起来区分训练集(n＝33)肺鳞癌及其配tt对正常肺组织的ROC曲线图；图2-B显示为本发明5个LncRNAs联合起来区分验证集(n＝30)tt肺鳞癌及其配对正常肺组织的ROC曲线图。tt
具体实施方式tt
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露tt的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加tt以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精tt神下进行各种修饰或改变。tt
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定tt的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，tt而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指tt出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。tt
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以tt及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术tt语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，tt根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例tt中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。tt
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常tt规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相tt关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等ttMOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborttLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINttMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesttttttMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINttSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSttINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicttPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinttProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。tt
实施例1tt
1临床样本收集：tt
收集复旦大学附属中山医院以及中科院细胞所2013-2014年期间存档的早期肺鳞癌冰冻tt新鲜组织标本及其配对正常肺组织63对。所有病人对参与科学研究均有知情同意。tt
2LncRNA定量PCR实验：tt
2.1RNA抽提及定量PCRtt
利用Trizol从冰冻组织中抽提总RNA，用微体积分光光度计对RNA进行定量。tt
2.2内参基因及引物tt
内参基因选用β-actin，β-actin和本发明所提供的一组LncRNA生物标志物的引物序列如tt表1所示：tt
表1定量PCR使用的引物序列tt
2.3逆转录反应tt
使用SuperScriptⅢFirstStrandSynthesisSystem试剂盒进行逆转录，RNA起始量为1μg，tt逆转录反应组分的用量如表2所示，反应条件：65℃下孵育5min，完成后至少在冰上放置1min；tt再在所得产物中加入逆转录反应混合液体，混匀后分别在25℃下孵育10min、50℃下孵育tt50min、85℃下孵育5min，逆转录反应混合液体的用量如表3所示；完成后在每个反应所得tt产物中加入1μlRNaseH，37℃下孵育20min后低温保存备用。tt
表2逆转录反应组分tt
表3逆转录反应混合液体(mix)tt
2.4实时定量PCR反应tt
定量PCR使用LightCycler480SYBRGreenⅠmaster，定量仪器为LightCycler480。反应tt体系如表4所示，反应条件如表5所示步骤，每个实时定量PCR反应分别做三个重复：tt
表4实时定量PCR预混液tt
表5实时定量PCR热循环参考值tt
使用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。数据以平均值±标准差的形式表示，除非有tt特殊的说明。肺鳞癌与其配对正常肺组织中lncRNA的表达差异统计使用配对样本t检验的方tt法，所有p值均为双侧，p<0.05被认为有统计学意义。tt
2.58个LncRNAs区分肺鳞癌及其配对正常肺组织的能力评估tt
我们利用ROC曲线来评估这8个LncRNAs(ENST0000045332、ENST00000441841、ttuc011cly.2、NR_046326、NR_028500、ENST00000393515、ENST00000400498、ttENST00000423466)区分肺鳞癌及其配对正常肺组织的能力。单个LncRNA用于肺鳞癌诊断tt的AUC为0.58-0.75，灵敏度为60-78％，特异性为51-82％(如表6所示)。我们将这8个LncRNAstt联合起来用于33对肺鳞癌样本的诊断，其AUC值可达到0.943(如图1)，在选择合适阈值tt之后，灵敏度和特异性分别为94％和89％。tt
表68个LncRNAs在训练集(33对样本)中的表达情况tt
1p值和AUC都是用内参基因β-actin归一化后得到的。tt
2.6.1优选的5个LncRNAs区分肺鳞癌及其配对正常肺组织的能力评估tt
通过线性逻辑回归分析，我们从8个LncRNA中分析优选得到了5个LncRNA。我们利tt用ROC曲线来评估5个LncRNAs(NR_046326,NR_028500,ENST00000453324,uc011cly.2和ttENST00000441841)在训练集中区分肺鳞癌及其配对正常肺组织的能力(所用33对样本与tt2.5相同)。这5个LncRNAs结合起来区分早期肺鳞癌和配对正常肺组织的AUC可达0.932tt(如图2-A所示)，接近8个LncRNA联合检测水平，并显著高于这5个LncRNAs单独诊断tt早期肺鳞癌的AUC(p<0.05)。在选择合适的阈值之后，ROC曲线表明这5个LncRNAs诊断tt早期肺鳞癌的灵敏度和特异性分别为92％和87％，显著高于单个LncRNA用于肺鳞癌诊断的tt灵敏度和特异性(p<0.05)。tt
表75个LncRNA在验证集(30对样本)中的诊断结果tt
1p值和AUC都是用内参基因β-actin归一化后得到的。tt
2.6.25个LncRNAs区分另一组肺鳞癌及其配对正常肺组织的能力评估tt
我们在另外一组30例肺鳞癌样本及其配对正常肺组织(验证集)中验证从训练集筛选出tt的这5个LncRNAs的检测特性。这5个LncRNAs在肺鳞癌及其配对正常肺组织均中有显著tt性差异表达(p<0.001)。单个LncRNA用于检测肺鳞癌的AUC为0.72-0.87，灵敏度为73-83％，tt特异性为63-80％(表7)。这5个LncRNAs联合检测63对肺鳞癌样本的AUC可达0.925(图tt2-B)，在选择合适的阈值之后，ROC曲线表明其灵敏度为86％，特异性为86％，均显著高于tt任何单个LncRNA的检测能力(p<0.05)。并且，这组LncRNAs在两组独立样本(训练集和tt验证集)中具有类似的检测能力，说明这组LncRNAs可以作为肺鳞癌早期检测的生物标志物。tt
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当tt指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干tt改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不tt脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修tt饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实tt施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。tt
