腺相关病毒变体及其使用方法
交叉引用tt
本申请要求2013年5月31日提交的美国临时专利申请号tt61/829,735的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。tt
关于联邦资助研究的声明tt
本发明是由国家卫生研究院(theNationalInstitutesofHealth)资助tt的HL081527号基金在政府支持下进行。政府对本发明享有某些权利。tt以文本文件提供的序列表以引用的方式并入tt
序列表在此以文本文件形式提供，“BERK-216WO_ST25.txt”于tt2014年5月28日生成且具有169KB的大小。所述文本文件的内容tt在本文中以引用的方式整体并入。tt
引言tt
已论证基于腺相关病毒(AAV)的基因递送载体在临床前疾病模tt型及最近在人临床试验中关于若干疾病靶的前景。基于AAV的载体tt是非常安全的，这是因为野生型AAV是非致病性的并且与任何已知tt疾病在病原学上无关。此外，AAV能高效递送基因并且在许多组织tt中可维持转基因的表达，包括肝脏、肌肉、肺脏、视网膜、以及脑。tt
AAV是含有两个开放阅读框rep和cap的单链DNA病毒。第一tt个基因编码基因组复制所必需的四个蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、tt和Rep40)，且第二个表达装配以形成病毒衣壳的三个结构蛋白tt(VP1-3)。如其名字所示，AAV的活性复制依赖辅助病毒，如腺病毒tttttt或疱疹病毒的存在。无辅助病毒时，AAV呈潜伏状态，其基因组维tt持为游离体形式或整合进宿主染色体中。已经鉴别出多个同源的灵长tt类AAV血清型和许多非人的灵长类类型。AAV2被表征为最佳基因tt递送媒介物。tt
到2010年为止，存在使用AAV作为基因递送媒介物的75项正tt在进行的临床试验。然而，抗衣壳中和抗体的高度流行(由于人群中tt对许多AAV变体和血清型的广泛暴露)减弱AAV基因疗法的功效。tt此预先存在的免疫性以及后来由于载体施用而形成的免疫性可阻止ttAAV基因疗法的更广泛的实施。例如，迄今为止，AAV在涉及递送tt到免疫特许区域的临床研究中是最成功的。tt
近来的分析表明抗AAVIgG抗体在人中的发生率对于AAV2tt(72％)和AAV1(67％)是最高的，但AAV9(47％)、AAV6(46％)、AAV5tt(40％)、以及AAV8(38％)抗体也存在于所研究的大部分群体中。若干tt研究发现在基因疗法期间对AAV衣壳的体液免疫可通过减少递送的ttrAAV粒子的量来预防。令人遗憾的是，低载体剂量的施用导致低转tt导及由此低治疗性基因表达。tt
在本领域中存在对开发对由抗AAV抗体进行的中和有抗性的新tt型AAV变体的需要。tt
文献
Asuri等人,MolTher.2012Feb；20(2):329-38；Bainbridge等人,ttNEnglJMed.2008May22；358(21):2231-9；Excoffon等人,ProcttNatlAcadSciUSA.2009Mar10；106(10):3865-70；Grimm等人,ttJVirol.2008Jun；82(12):5887-911；Jang等人,MolTher.2011Apr；tt19(4):667-75；Klimczak等人,PLoSOne.2009Oct14；4(10):e7467；ttKoerber等人；MolTher.2008Oct；16(10):1703-9；Koerber等人；MttolTher.2009Dec；17(12):2088-95；Maguire等人,NEnglJMed.2tt008May22；358(21):2240-8；Maguire等人,Lancet.2009Nov7；374tttttt(9701):1597-605；Maheshri等人,NatBiotechnol.2006Feb；24(2):198tt-204；Perabo等人,JGeneMed.2006Feb；8(2):155-62；Yang等人,ttProcNatlAcadSciUSA.2009Mar10；106(10):3946-51；WO201tt2145601；美国专利公布号US20050053922tt
简述tt
本公开提供包含变体衣壳蛋白和异源核酸的感染性重组腺相关tt病毒(rAAV)病毒粒子。本公开还提供变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白tt(和/或编码变体AAV衣壳蛋白的核酸)，其向感染性rAAV病毒粒子tt赋予对人AAV中和抗体的提高的抗性。本公开还提供包含感染性ttrAAV病毒粒子和/或编码所述变体AAV衣壳蛋白的核酸的宿主细胞。tt本公开还提供以上病毒粒子、衣壳蛋白、核酸和/或宿主细胞的文库；tt其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含具有至少一个相tt对于SEQIDNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的氨基酸tt取代的氨基酸序列。tt
本公开还提供向靶细胞递送异源核酸的方法，其中使靶细胞与所tt述感染性rAAV病毒粒子接触。本公开还提供向个体递送基因产物的tt方法，所述方法一般涉及向需要其的个体施用有效量的所述rAAV病tt毒粒子。本文还提供用于实践所述方法的组合物和试剂盒。tt
特征tt
本公开的特征包括一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，tt其包含：(a)包含与在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨基tt酸序列具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体腺相tt关病毒(AAV)衣壳蛋白；及(b)异源核酸。在一些情况下，变体AAVtt衣壳蛋白包含与在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸tt序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况tt下，变体AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中tt列出的氨基酸序列。tt
本公开的特征包括一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，tt其包含：(a)包含与在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列具有至少约tt95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列且包括相对于SEQIDNO:2的tt氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q的tt变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白；及(b)异源核酸。在一些情况下，变tt体AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列。在一tt些情况下，rAAV展现与由AAV2(野生型AAV血清型2)展现的抗性tt相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些情况下，rAAV展现与tt由AAV2展现的抗性相比至少约1.5倍(例如，至少约3倍、至少约5tt倍、至少约10倍、至少约30倍等等)对人AAV中和抗体更大的抗性。tt在一些情况下，rAAV展现与由野生型AAV血清型2(AAV2)展现的哺tt乳动物细胞的转导相比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细tt胞转导。在一些情况下，哺乳动物细胞是肝细胞、胰腺细胞、骨骼肌tt细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、ttT细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞(例如，造血干细胞、造血tt祖细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱tt导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干tt细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、肌肉干细胞、视网膜干细胞等等)、tt内皮细胞、或癌细胞。在一些情况下，异源核酸包含RNA干扰剂。tt在一些情况下，异源核酸包含编码多肽的核苷酸序列。tt
本公开的特征包括一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒tt(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，所述衣壳蛋白包含与在SEQIDNO:tt11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序tt列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋tt白包含与在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具tt有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所编tt码的变体AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中tt列出的氨基酸序列。tt
本公开的特征包括一种分离的核酸，其包含编码变体腺相关病毒tttttt(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列，所述衣壳蛋白包含与在SEQIDNO:tt10中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸tt序列且包括相对于SEQIDNO:2的氨基酸取代N312K、N449D、ttD472N、N551S、I698V、及L735Q。tt
在一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白(由分离的核酸编码)tt向感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2(野生型ttAAV血清型2)展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在tt一些情况下，提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少约1.5倍(例如，tt至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约30倍等等)大。在tt一些情况下，所编码的变体AAV衣壳蛋白(由分离的核酸编码)向感tt染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的转导相tt比在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。tt
本公开的特征包括分离的宿主细胞，其包含如上所述的核酸。在tt一些情况下，宿主细胞用核酸稳定地转染。在一些情况下，宿主细胞tt还包含一种核酸，其包含编码AAVrep蛋白的核苷酸序列。在一些情tt况下，宿主细胞还包含重组AAV载体。tt
本公开的特征包括一种向靶细胞递送异源核酸的方法，其包括使tt靶细胞与所述病毒粒子(如上所述)接触。在一些情况下，靶细胞是肝tt细胞、胰腺细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、tt滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神经元、神经胶质细胞、干细胞(例tt如，造血干细胞、造血祖细胞、神经干细胞、神经祖细胞、神经嵴干tt细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、间充质干细胞、tt中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、胰腺祖细胞、肌肉干细胞、tt或视网膜干细胞等等)、内皮细胞、或癌细胞。在一些情况下，靶细tt胞是在体外。在一些情况下，靶细胞是在体内。tt
本公开的特征包括一种向需要其的个体递送基因产物的方法，所tt述方法包括向个体施用有效量的所述感染性重组腺相关病毒(rAAV)tttttt病毒粒子(如上所述)。在一些情况下，rAAV病毒粒子的异源核酸包tt含RNA干扰剂。在一些情况下，rAAV病毒粒子的异源核酸包含编tt码多肽的核苷酸序列。在一些情况下，施用步骤包括感染性rAAV病tt毒粒子的间接递送。在一些情况下，施用步骤包括感染性rAAV病毒tt粒子的直接递送。tt
本公开的特征包括一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含tt与在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少tt约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV衣壳tt蛋白包含与在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列tt具有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，ttAAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:11-13及26-33的一个中列出的氨tt基酸序列。tt
本公开的特征包括一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含tt与在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列具有至少约95％氨基酸序列tt同一性的氨基酸序列且包括相对于SEQIDNO:2的氨基酸取代ttN312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q。在一些情况tt下，变体AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列。tt在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病毒(rAAV)tt病毒粒子赋予与由AAV2展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高tt的抗性。在一些情况下，提高的抗性是由AAV2展现的抗性的至少约tt1.5倍(例如，至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约30倍tt等等)大。在一些情况下，变体AAV衣壳蛋白向感染性重组腺相关病tt毒(rAAV)病毒粒子赋予与由AAV2展现的转导相比在人AAV中和抗tt体存在下提高的哺乳动物细胞转导。tt
本公开的特征包括一种包含以下至少一个的文库：(i)两个或更多tt个感染性rAAV病毒粒子，各自包含变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白tt及异源核酸；(ii)两个或更多个分离的核酸，各自包含编码变体AAVtt衣壳蛋白的核苷酸序列；(iii)两个或更多个宿主细胞，各自包含含有tttttt编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸；以及(iv)两个或更多个tt变体AAV衣壳蛋白；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白tt包含具有至少一个相对于SEQIDNO:10-13及26-33的一个中列出的tt氨基酸序列的氨基酸取代的氨基酸序列。tt
本公开的特征包括一种生成和鉴别修饰的感染性rAAV病毒粒子tt的方法，所述病毒粒子相对于包含起始衣壳蛋白的起始(亲代)病毒粒tt子展现改变的感染性质，所述方法包括：(a)由起始衣壳蛋白生成变体tt腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中起始衣壳蛋白包含在SEQIDNO:tt10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列，且其中每个变体AAV衣tt壳蛋白包含至少一个相对于起始衣壳蛋白的氨基酸取代；(b)生成变tt体AAV病毒粒子，各自包含在步骤(a)中生成的变体衣壳AAV蛋白；tt以及(c)测定在步骤(b)中生成的变体AAV病毒粒子的改变的感染性质tt以鉴别修饰的感染性rAAV病毒粒子。在一些情况下，变体AAV衣tt壳蛋白文库的生成包括一种选自由以下组成的组的诱变方法：聚合酶tt链反应诱变、寡核苷酸指导的诱变、饱和诱变、环交换诱变、片段改tt组诱变、及其组合。在一些情况下，改变的感染性质是与由起始病毒tt粒子展现的抗性相比对人中和AAV抗体的提高的抗性。在一些情况tt下，改变的感染性质是与由起始病毒粒子展现的转导相比在人AAVtt中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。在一些情况下，修饰的感tt染性rAAV病毒粒子包含修饰的AAV衣壳蛋白，其包含与起始衣壳tt蛋白具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。tt
本公开的特征包括一种由起始衣壳蛋白生成变体AAV衣壳蛋白tt的方法，所述方法包括：使包含编码起始衣壳蛋白的核苷酸序列的核tt酸经受选自由以下组成的组的类型的诱变：聚合酶链反应诱变、寡核tt苷酸指导的诱变、饱和诱变、环交换诱变、片段改组诱变、及其组合；tt其中起始衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10-13及26-33的一个中列出的tt氨基酸序列。tt
附图简述tt
图1A-B描绘AAV的定向进化用于增强的抗体逃避。tt
图2A-B描绘使用人IVIG的抗体逃避变体的中和曲线。tt
图3A-C描绘使用从个体中获取的人血清的抗体逃避变体的中和tt曲线，所述个体由于存在针对AAV的高中和抗体滴度而被排除在Btt型血友病临床试验之外。tt
图4A-B描绘环交换/改组及饱和诱变克隆的氨基酸序列。tt
图5显示AAV变体的体外向性。tt
图6A-B示出新型AAV变体的体内定位及中和。tt
图7A-D显示人抗体逃避株的生成。tt
图8A-I描绘与AAV1-9(SEQIDNO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列tt对齐的改组100-1(SEQIDNO:11)的衣壳蛋白序列。tt
图9A-I描绘与AAV1-9(SEQIDNO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列tt对齐的改组100-3(SEQIDNO:12)的衣壳蛋白序列。tt
图10A-I描绘与AAV1-9(SEQIDNO:1-9)的野生型衣壳蛋白序列tt对齐的改组100-7(SEQIDNO:13)的衣壳蛋白序列。tt
图11示出文库克隆和在免疫的小鼠血清中的亲代血清型的中和tt抗体滴度。tt
定义tt
腺相关病毒是由在非包膜二十面体衣壳内的4.7kb单链DNA基tt因组构成的非致病性细小病毒，“AAV”是腺相关病毒的缩写，且可用tt于指代病毒本身或其衍生物。基因组含有侧接有用作病毒复制起点和tttttt包装信号的反向末端重复(ITR)的三个开放阅读框(ORF)。repORF编tt码四个非结构蛋白，这些蛋白在病毒复制、转录调控、位点特异性整tt合、及病毒粒子装配中发挥作用。capORF编码三个结构蛋白(VP1-3)，tt这些蛋白装配形成60聚体病毒衣壳。最终，作为cap基因内的替代tt阅读框存在的ORF产生装配活化蛋白(AAP)，这是一种将AAV衣壳tt蛋白定位在细胞核中并在衣壳装配过程中发挥作用的病毒蛋白。tt
存在若干个天然存在的血清型和超过100个AAV变体，其各自tt在氨基酸序列方面不同，特别是在衣壳蛋白的高变区内，且因此在其tt基因递送性质方面不同。AAV与任何人类疾病无关，这使得重组AAVtt对于临床应用是有吸引力的。tt
除非另外需要，否则如本文所用的术语“AAV”涵盖所有亚型及天tt然存在的和重组形式。术语“AAV”包括AAV1型(AAV-1或AAV1)、ttAAV2型(AAV-2或AAV2)、AAV3型(AAV-3或AAV3)、AAV4型tt(AAV-4或AAV4)、AAV5型(AAV-5或AAV5)、AAV6型(AAV-6或ttAAV6)、AAV7型(AAV-7或AAV7)、AAV8型(AAV-8或AAV8)、AAVtt9型(AAV-9或AAV9)、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长tt类AAV、非灵长类AAV、以及羊AAV。“灵长类AAV”是指感染灵长tt类的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛ttAAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等等。tt
AAV的各种血清型的基因组序列、以及天然末端重复(TR)、Reptt蛋白、和衣壳亚基的序列在本领域中是已知的。所述序列可见于文献tt中或公共数据库如GenBank中。参见，例如GenBank登记号ttNC_002077.1(AAV-1)、AF063497.1(AAV-1)、NC_001401.2(AAV-2)、ttAF043303.1(AAV-2)、J01901.1(AAV-2)、U48704.1(AAV-3)、ttNC_001729.1(AAV-3)、NC_001829.1(AAV-4)、U89790.1(AAV-4)、ttNC_006152.1(AAV-5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV-6)、ttNC_006260.1(AAV-7)、AF513851.1(AAV-7)、AF513852.1(AAV-8)ttNC_006261.1(AAV-8)、以及AY530579.1(AAV-9)；为了教导AAV核tttttt酸及氨基酸序列，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。还参tt见，例如Srivistava等人(1983)J.Virology45:555；Chiorini等人(1998)ttJ.Virology71:6823；Chiorini等人(1999)J.Virology73:1309；ttBantel-Schaal等人(1999)J.Virology73:939；Xiao等人(1999)J.ttVirology73:3994；Muramatsu等人(1996)Virology221:208；Shade等tt人,(1986)J.Virol.58:921；Gao等人(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USAtt99:11854；Moris等人(2004)Virology33:375-383；国际专利公布WOtt00/28061、WO99/61601、WO98/11244；以及美国专利号6,156,303。tt
与AAV血清型有关的天然存在的cap(衣壳)蛋白的序列在本领域tt中是已知的且包括：AAV1(SEQIDNO:1)、AAV2(SEQIDNO:2)、ttAAV3(SEQIDNO:3)、AAV4(SEQIDNO:4)、AAV5(SEQIDNO:5)、ttAAV6(SEQIDNO:6)、AAV7(SEQIDNO:7)、AAV8(SEQIDNO:8)、tt以及AAV9(SEQIDNO:9)。术语“变体AAV衣壳蛋白”是相对于在ttSEQIDNO:1-9中列出的天然存在的AAV衣壳蛋白序列中的一个，tt包含包括至少一个取代(包括缺失、插入等等)的氨基酸序列的AAVtt衣壳蛋白。tt
“AAV病毒粒子(virion)”或“AAV病毒粒子(viralparticle)”是指由tt至少一个AAV衣壳蛋白和衣壳化的AAV多核苷酸构成的病毒粒子。tt
“重组”当应用于多核苷酸时意味着多核苷酸是克隆、限制或连接tt步骤、及产生不同于自然界中出现的多核苷酸的构建体的其他工序的tt不同组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒粒子。该术语tt分别包括原始多核苷酸构建体及原始病毒构建体的后代的复制。tt
如果AAV病毒粒子包含异源多核苷酸(即，不同于野生型AAVtt基因组的多核苷酸，例如，有待递送给靶细胞的转基因、有待递送给tt靶细胞的RNAi试剂或CRISPR试剂等等)，那么其通常被称为“重组ttAAV(rAAV)病毒粒子”或“rAAV病毒粒子”。一般说来，异源多核苷酸tt侧接有至少一个，且一般两个AAV反向末端重复序列(ITR)。tt
术语“rAAV载体”包括rAAV病毒粒子(即rAAV病毒粒子)(例如，tt感染性rAAV病毒粒子)，其根据定义包括rAAV多核苷酸；并且还包tt括编码rAAV的多核苷酸(例如，编码rAAV的单链多核苷酸tt(ss-rAAV))；编码rAAV的双链多核苷酸(ds-rAAV)，例如，编码rAAVtt的质粒；等等)。tt
“包装”是指引起AAV粒子的装配和衣壳化的一系列细胞内事tt件。tt
AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白tt的多核苷酸序列。AAVrep和cap在本文中被称为AAV“包装基因”。tt
用于AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)由哺乳tt动物细胞来复制和包装的病毒。用于AAV的多种这类辅助病毒在本tt领域中是已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒如牛痘。腺病毒包tt括许多不同的亚组，但最常使用C亚组的5型腺病毒。人、非人哺tt乳动物及鸟类来源的许多腺病毒是已知的且可从保藏机构如ATCCtt处获得。疱疹家族病毒包括例如单纯疱疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒tt(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病毒(PRV)；其也可从保藏机构tt如ATCC处获得。tt
“辅助病毒功能物”是指在辅助病毒基因组中编码的功能，其允许ttAAV复制和包装(结合本文所述的用于复制和包装的其他需求)。如本tt文所述，“辅助病毒功能物”可以许多方式提供，包括通过提供辅助病tt毒或提供例如将编码所需功能物的多核苷酸序列以反式提供给生产tt者细胞。例如，将包含编码一种或多种腺病毒蛋白的核苷酸序列的质tt粒或其他表达载体随rAAV载体一起转染到生产者细胞中。tt
“感染性”病毒或病毒粒子是包含适当装配的病毒衣壳且能够递tt送多核苷酸组分到病毒物种所趋向的细胞中的那些。该术语不一定意tt味着病毒的任何复制能力。用于计数感染性病毒粒子的测定描述在本tt公开的别处和本领域中。病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病tttttt毒粒子的比率。测定感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率的方法在本tt领域中是已知的。参见，例如Grainger等人(2005)Mol.Ther.11:S337tt(描述TCID50感染滴度测定)；及Zolotukhin等人(1999)GeneTher.tt6:973。还参见实施例。tt
如本文所用的术语“向性”是指由病毒(例如AAV)对特定的宿主tt物种或在宿主物种内的特定细胞类型的优先靶向。举例来说，可感染tt心、肺、肝、及肌细胞的病毒相对于仅可感染肺和肌细胞的病毒具有tt更宽(即提高)的向性。向性也可包括病毒对宿主的具体细胞表面分子tt类型的依赖。例如，一些病毒可仅感染具有表面糖胺聚糖的细胞，而tt其他病毒可仅感染具有唾液酸的细胞(这种依赖性可使用缺乏特定类tt别的分子的各种细胞系作为病毒感染的潜在宿主细胞来测试)。在一tt些情况下，病毒的向性描述病毒的相对偏好。举例来说，第一病毒将tt能感染所有细胞类型，但在感染具有表面糖胺聚糖的那些细胞方面成tt功得多。第二病毒可被认为具有与第一病毒类似(或相同的)向性，如tt果第二病毒也优选相同的特征(例如，第二病毒也在感染具有表面糖tt胺聚糖的那些细胞方面更成功)，即使绝对转导效率不相似也如此。tt举例来说，第二病毒也许比第一病毒在感染所测试的每个给定细胞类tt型上更有效，但如果相对偏好相似(或相同)，那么第二病毒仍可被认tt为具有与第一病毒相似(或相同的)向性。在一些实施方案中，包含所tt述变体AAV衣壳蛋白的病毒粒子的向性相对于天然存在的病毒粒子tt是不改变的。在一些实施方案中，包含所述变体AAV衣壳蛋白的病tt毒粒子的向性相对于天然存在的病毒粒子是扩展(即，变宽)的。在一tt些实施方案中，包含所述变体AAV衣壳蛋白的病毒粒子的向性相对tt于天然存在的病毒粒子是降低的。tt
“有复制能力的”病毒(例如，有复制能力的AAV)是指感染性的表tt型上野生型病毒，并且也能够在受感染细胞中(即，在辅助病毒或辅tt助病毒功能物存在下)复制。在AAV的情况下，复制能力一般需要功tt能性AAV包装基因的存在。一般说来，如本文所述的rAAV载体在tt哺乳动物细胞(特别是人细胞)中由于缺乏一个或多个AAV包装基因tttttt而没有复制能力。通常，这种rAAV载体缺乏任何AAV包装基因序tt列以便使有复制能力的AAV通过AAV包装基因与引入的rAAV载体tt之间的重组生成的可能性减到最低。在许多实施方案中，如本文所述tt的rAAV载体制剂是含有(即使有也极少的)有复制能力的ttAAV(rcAAV，也称为RCA)(例如，每102个rAAV粒子小于约1rcAAV、tt每104个rAAV粒子小于约1rcAAV、每108个rAAV粒子小于约1ttrcAAV、每1012个rAAV粒子小于约1rcAAV、或无rcAAV)的那些。tt
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的多聚形式，包括脱氧核tt糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可含有修饰的核苷酸，tt如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可插入非核苷酸组分。对核tt苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后进行(如果存在的话)。tt如本文所用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有规tt定或需要，文中涉及多核苷酸的任何实施方案包括双链形式与已知的tt或预计要形成双链形式的两条互补单链形式的每一条。tt
多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有某百分数的“序列tt同一性”是指，当比对时，在两条序列相比中此百分数的碱基或氨基tt酸相同。序列相似性可以许多不同的方式测定。为了测定序列同一性，tt可使用方法和计算机程序比对序列，计算机程序包括可由因特网址ttncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST。另一种比对算法是FASTA，tt可由Madison,Wisconsin,USA,awhollyownedsubsidiaryofOxfordttMolecularGroup,Inc的GeneticsComputingGroup(GCG)包装中获得。tt其他比对技术描述于Enzymology,第266卷:ComputerMethodsforttMacromolecularSequenceAnalysis(1996),Doolittle编著,AcademicttPress,Inc.,adivisionofHarcourtBrace&Co.,SanDiego,California,ttUSA的方法中。特别关注的是容许序列中的缺口的对比程序。ttSmith-Waterman是容许序列比对中的缺口的一种类型的算法。参见ttMeth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。使用Needleman和Wunsch对比tt方法的GAP程序也可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453tt(1970)tt
“基因”是指在细胞中执行某种功能的多核苷酸。例如，基因可含tt有开放阅读框，其在被转录和翻译后，能够编码特定的蛋白质。另一tt方面，基因可编码不被翻译的功能性RNA产物(例如，适体、干扰ttRNA、核蛋白体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)等等)。tt
“基因表达产物”或“基因产物”是由如上所定义的特定基因表达tt产生的分子。基因表达产物包括例如多肽、适体、干扰RNA、信使ttRNA(mRNA)、rRNA、tRNA、非编码RNA(ncRNA)等等。tt
“RNA干扰剂”或“RNAi试剂”包括可用于改变基因(如上所定义)tt表达的任何试剂(或编码这种试剂的多核苷酸)。本领域普通技术人员tt已知的RNAi试剂的实例包括但不限于(i)siRNA试剂；(ii)反义RNA；tt(iii)CRISPR试剂；(iv)锌指核酸酶试剂；以及(v)转录激活因子样效应tt子核酸酶(TALEN)试剂。tt
(i)siRNA试剂(“小干扰”或“短干扰RNA”(或siRNA))是靶向所关tt注基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指由RNttA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构，从而形成双链RNAtt的区域(dsRNA)。siRNA“靶向”基因是因为siRNA的双链体部分的核tt苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施方案中，siRNA的tt双链体长度小于30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体可以是29、tt28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、tt13、12、11或10个核苷酸长度。在一些实施方案中，双链体的长度tt是19-25个核苷酸长度。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构tt的一部分。含有发夹的siRNA试剂也可被称为“shRNA(短发夹RNA)tt试剂”。除双链体部分之外，发夹结构还可含有位于形成双链体的两条tt序列之间的环部分。环在长度方面可变化。在一些实施方案中，环的tt长度是5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可tt含有3'或5'突出端部分。在一些实施方案中，突出端是0、1、2、3、tt4或5个核苷酸长度的3'或5'突出端。一般说来，靶基因的表达产物(例tt如，mRNA、多肽等等)水平通过siRNA试剂(例如，siRNA、shRNAtttttt等等)而降低，所述siRNA试剂含有至少与靶基因转录产物的19-25tt个核苷酸长度的区段(例如，20-21个核苷酸序列)互补的特定双链核tt苷酸序列，包括5'非翻译(UT)区、ORF、或3'UT区。在一些实施方tt案中，短干扰RNA的长度为约19-25nt。参见，例如PCT申请WOtt0/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、ttWO01/89304、WO02/16620、及WO02/29858；以及美国专利公布号tt20040023390(关于siRNA技术的描述)。siRNA和/或shRNA可由核tt酸序列编码，且该核酸序列还可包括启动子。该核酸序列还可包括聚tt腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是合成的最小聚tt腺苷酸化信号。tt
(ii)反义RNA是与基因表达产物互补的RNA。举例来说，靶向tt特定mRNA的反义RNA是与mRNA互补的基于RNA的试剂(或可tt以是修饰的RNA)，其中反义RNA与mRNA的杂交改变mRNA的表tt达(例如，经由改变RNA的稳定性、改变RNA的翻译，等等)。编码tt反义RNA的核酸也包括在“反义RNA”中。tt
(iii)CRISPR试剂。CRISPR(簇规则间隔的短回文重复/CRISPRtt相关(Cas)系统提供通过使用CRISPRRNA(crRNA)来指导侵入核酸的tt沉默而对病毒和质粒具有适应性免疫的细菌和古细菌。Cas9蛋白(或tt其功能等效物和/或变体，即，Cas9样蛋白)天然地含有DNA核酸内tt切酶活性，这取决于该蛋白与两个天然存在的或合成的RNA分子(称tt为crRNA和tracrRNA，也称为指导RNA)的结合。在一些情况下，tt这两个分子共价连接以形成单一分子(也称为单指导ttRNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与靶向DNA的RNA(该tt术语包括双分子指导RNA构型和单分子指导RNA构型)结合，这活tt化了Cas9或Cas9样蛋白并将该蛋白导向靶核酸序列。如果Cas9或ttCas9样蛋白保持其天然酶促功能，那么其将靶DNA裂解以形成双链tt断裂，这可导致基因组变化(即，编辑：缺失、插入(当存在供体多核tt苷酸时)、置换等)，由此改变基因表达。Cas9的一些变体(这些变体tt被术语Cas9样所涵盖)已经改变，以使得它们具有降低的DNA裂解tttttt活性(在一些情况下，它们裂解靶DNA的单链而不是双链，而在其他tt情况下，它们严重地降低至无DNA裂解活性)。具有降低的DNA裂tt解活性(甚至无DNA裂解活性)的Cas9样蛋白仍可被导向靶DNA并tt且可阻断RNA聚合酶活性。因此，无酶促活性的Cas9样蛋白可在靶ttDNA中通过靶向DNA的RNA而靶向特定位置以便阻断靶DNA的tt转录。关于CRISPR试剂的详细信息可见于例如以下文献中：(a)Jinektt等人,Science.2012Aug17；337(6096):816-21:“Aprogrammablettdual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity”；(b)ttQi等人,Cell.2013Feb28；152(5):1173-83:“RepurposingCRISPRasanttRNA-guidedplatformforsequence-specificcontrolofgeneexpression”；tt以及(c)美国专利申请号13/842,859和PCT申请号PCT/US13/32589；tt所有这些文献据此以引用的方式整体并入。因此，如本文所用的术语tt“CRISPR试剂”包括任何试剂(或编码这类试剂的核酸)，包含天然存tt在的和/或合成的序列，其可用于基于Cas9的系统(例如，Cas9或Cas9tt样蛋白；靶向DNA的RNA的任何组分，例如crRNA样RNA、tracrRNAtt样RNA、单指导RNA等；供体多核苷酸；等等)中。tt
(iv)锌指核酸酶(ZFN)试剂。锌指核酸酶(ZFN)是通过锌指DNAtt结合域与DNA裂解域的融合而生成的人工DNA核酸内切酶。ZFNtt可被改造以靶向所需的DNA序列并且这使得锌指核酸酶能够裂解独tt特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN可用于在细胞(例如细胞基因组)tt中通过诱导双链断裂来编辑靶DNA。有关使用ZFN的更多信息，参tt见，例如：Asuri等人,MolTher.2012Feb；20(2):329-38；Bibikovatt等人Science.2003May2；300(5620):764；Wood等人Science.2011ttJul15；333(6040):307；Ochiai等人GenesCells.2010Aug；15(8):87tt5-85；Takasu等人,InsectBiochemMolBiol.2010Oct；40(10):759-6tt5；Ekker等人,Zebrafish2008Summer；5(2):121-3；Young等人,ProttcNatlAcadSciUSA.2011Apr26；108(17):7052-7；Goldberg等tt人,Cell.2010Mar5；140(5):678-91；Geurts等人,Science.2009Jultt24；325(5939):433；Flisikowska等人,PLoSOne.2011；6(6):e21045.dttttttoi:10.1371/journal.pone.0021045.Epub2011Jun13；Hauschild等人,ttProcNatlAcadSciUSA.2011Jul19；108(29):12013-7；以及Yutt等人,CellRes.2011Nov；21(11):1638-40；所有这些文献出于其有关ttZFN的教导而以引用的方式并入本文。术语“ZFN试剂”包括锌指核tt酸酶和/或包含编码锌指核酸酶的核苷酸序列的多核苷酸。tt
(v)转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)试剂。转录激活因子tt样效应子核酸酶(TALEN)是通过TAL(转录激活因子样)效应子DNAtt结合域与DNA裂解域的融合而生成的人工DNA核酸内切酶。TALEttN可迅速地被改造以结合几乎任何所需的DNA序列并且当被引入细tt胞中时，TALEN可用于在细胞(例如细胞基因组)中通过诱导双链断裂tt编辑靶DNA。有关使用TALEN的更多信息，参见，例如：Hockemettyer等人NatBiotechnol.2011Jul7；29(8):731-4；Wood等人Scienctte.2011Jul15；333(6040):307；Tesson等人NatBiotechnol.2011Auttg5；29(8):695-6；以及Huang等人,NatBiotechnol.2011Aug5；29(8):tt699-700；所有这些文献出于其有关TALEN的教导而以引用的方式并tt入本文。术语“TALEN试剂”包括TALEN和/或包含编码TALEN的核tt苷酸序列的多核苷酸。tt
“控制元件”或“控制序列”是涉及功能性调控多核苷酸的分子相tt互作用的核苷酸序列，包括该多核苷酸的复制、加倍、转录、剪接、tt翻译、或降解。调控可影响所述过程的频率、速度、或特异性，并且tt调控可以是天然地增强或抑制。本领域中已知的控制元件包括例如转tt录调控序列，如启动子和增强子。启动子是能够在一定条件下结合ttRNA聚合酶并引发通常位于启动子下游(在3'方向上)的编码区域的tt转录的DNA区域。tt
“可操作连接”或“操作性连接”指的是遗传元件的一种并列关系，tt其中这些元件是呈一种允许它们以预期方式行使功能的关系。例如，tt启动子可操作连接到编码区域，如果该启动子有助于引发编码序列的tt转录的话。在启动子和编码区域之间可以有间插残基，只要能维持这tttttt种功能性关系。tt
“表达载体”是含有编码感兴趣的多肽的区域的载体，并且用于实tt现预定靶细胞中该蛋白质的表达。表达载体还包含可操作连接到编码tt区域以促进蛋白质在靶标中的表达的控制元件。控制元件与其可操作tt连接以用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中tt许多都是本领域中已知和可获得的或可容易地由本领域中可获得组tt分来构建。tt
“异源的”意思是指来源于一种实体，该实体在基因型上截然不同tt于正被比较的实体的其余部分。例如，通过遗传工程技术引入来源于tt不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从启动子的天tt然编码序列中去掉启动子，且可操作地连接到不是天然序列的编码序tt列上，这种启动子叫异源启动子。因此，例如，含有编码异源基因产tt物的异源核酸的rAAV是含有天然存在的野生型AAV中通常不含有tt的核酸的rAAV，且所编码的异源基因产物是天然存在的野生型AAVtt通常不编码的基因产物。tt
术语“遗传改变”或“遗传修饰”(及其语法上的变型)在本文中可互tt换使用来指不通过有丝分裂或减数分裂将遗传元件(例如，多核苷酸)tt引入细胞中的方法。所述元件对细胞可以是异源的，或者可以是早已tt存在于细胞中的元件的额外拷贝或改进形式。遗传改变可例如通过本tt领域已知的任何方法用重组质粒或其他多核苷酸转染细胞来实现，所tt述方法如电穿孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸脂质体复合物接触。遗tt传改变也可例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来tt实现。遗传元件通常引入细胞的染色体或微小染色体中；但任何改变tt细胞及其后代的表型和/或基因型的变化均被归入该术语。tt
当这种DNA已引入细胞内部时，细胞已由外源性DNA(例如，tt经由重组病毒)“遗传修饰”或“转化”或“转染”。外源性DNA的存在产tt生永久或暂时的遗传变化。转化的DNA可以或未必被整合(共价连接)tttttt到细胞的基因组中。“克隆”是通过有丝分裂来源于单细胞或共同祖先tt的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克tt隆。tt
如果某基因序列在细胞的体外长期培养期间能被利用执行其功tt能或在体外持续延长的时间，就认为该细胞受到该基因序列“稳定地”tt改变、转导、遗传修饰或转化。这种细胞通常是“遗传上”受到改变的tt(遗传修饰的)，即引入的遗传改变也可遗传给所改变细胞的后代。tt
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指示任何长度tt的氨基酸聚合物。该术语也包括被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫tt键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、或与标记组分缀合。当向哺乳动tt物受试者递送基因产物多肽(如抗血管生成多肽、神经保护性多肽等tt等)及其组合物时，所述多肽及其组合物分别是指保留了完整蛋白质tt所需的生化功能的相应完整多肽、或其任何片段或其遗传工程改造的tt衍生物。类似地，编码抗血管生成多肽的核酸、编码神经保护性多肽tt的核酸、和用于递送基因产物至哺乳动物受试者(可被称为有待向受tt体细胞递送的“转基因”)的其他这种核酸包括编码拥有所需生化功能tt的完整多肽或任何片段或遗传工程改造的衍生物的多核苷酸。tt
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒粒子、宿主细胞、蛋白tt质、或其他物质是指所述物质至少缺乏一些其他组分的制剂，这些组tt分也可存在于这些物质或类似物质天然存在时或最初从其制备时。因tt此，例如，分离的物质可使用纯化技术从来源混合物中富集而制备。tt可以在一个绝对的基础上测量富集，如每体积溶液的重量，或者可以tt相对于来源混合物中存在的第二潜在干扰物质来测量富集。在本公开tt的实施方案中，富集程度增加则分离程度也增加。分离的质粒、核酸、tt载体、病毒、宿主细胞、或其他物质在一些实施方案中是纯化的，例tt如约80％至约90％纯的、至少约90％纯的、至少约95％纯的、至少tt约98％纯的、或至少约99％或以上纯的。tt
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等等是指获tt得所需药理和/或生理效果。该效果可以是完全或部分地抑制疾病或tt其症状的预防性效果，和/或可以是部分或完全治愈疾病和/或可归因tt于该疾病的副作用的治疗性效果。如本文所用，“治疗”包括在哺乳动tt物，特别是在人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病(和/或tt由该疾病所引起的症状)在可能易感该疾病或处于患上该疾病的风险tt中但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中出现；(b)抑制疾病(和/或由tt该疾病所引起的症状)，即阻止其发展；以及(c)减轻疾病(和/或由该疾tt病所引起的症状)，即，引起疾病(和/或由该疾病所引起的症状)的消tt退。tt
术语“个体”、“宿主”、“受试者”以及“患者”在本文中可互换地使tt用，且是指哺乳动物，包括但不限于人；非人灵长类动物，包括猿；tt哺乳动物运动动物(例如马)；哺乳动物农场动物(例如绵羊、山羊等tt等)；哺乳动物宠物(狗、猫等等)；以及啮齿动物(例如小鼠、大鼠等tt等)。tt
在一些实施方案中，个体是先前已自然暴露于AAV且因此具有tt抗AAV抗体(即，AAV中和抗体)的人。在一些实施方案中，个体是tt先前已施用AAV载体(且因此可具有抗AAV抗体)且需要再施用载体tt用于治疗不同病状或用于进一步治疗相同病状的人。基于涉及向例如tt肝、肌肉、及视网膜(所有组织都受到针对此媒介物的中和抗体的影tt响)递送AAV基因的临床试验中的积极结果，存在许多这类治疗性应tt用/疾病靶标。tt
如本文所用的术语“有效量”是足以实现有益的或所需临床结果tt的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的，化tt合物(例如感染性rAAV病毒粒子)的有效量是足以减轻、改善、稳定、tt逆转、预防、减缓或延迟具体疾病状况(例如癌症)(和/或与所述具体tt疾病状况有关的症状)发展的量。因此，感染性rAAV病毒粒子的有tt效量是能逃避个体的抗AAV抗体的中和活性，由此有效地向个体的tttttt一个靶细胞递(或多个靶细胞)递送异源核酸的感染性rAAV病毒粒子tt的量。tt
在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的具体实施tt方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应该理解，本文所用的术tt语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制，因为本发明的tt范围只受所附权利要求书的限制。tt
当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的tt每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单tt位的十分之一)和任何其他所述的或者在所述范围中的中间值都被包tt括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范tt围中，且在所述范围内明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明tt内。当所述范围包括所述上下限中的一个或两个时，排除了那些所包tt括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。tt
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发tt明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价tt于本文所述的那些的任何方法和材料还可用于实践或测试本发明，但tt现在描述示优选方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用的方式tt并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/tt或材料。tt
除非文中另外清楚指出，否则必须指出如本文和所附权利要求书tt中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，tt“一个感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子”包括多个这种病毒粒tt子且“感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子”包括本领域技术人员tt已知的一个或多个这种病毒粒子及其等效物，诸如此类。还应注意，tt权利要求书可能撰写成排除了任何可选要素。因此，此声明旨在用作tt排除性术语如“单独”、“仅仅”等与权利要求要素的陈述相关联的前提tt基础，或采用“负”限制。tt
应当理解，为清楚起见在参照不同实施方案的上下文中所描述的tt本发明的某些特点也可在单个实施方案中以组合方式给出。相反，为tt简洁起见在参照单一实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特tt点也可单独地或以任何适合的子组合方式给出。关于本发明的实施方tt案的所有组合具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个tt组合个别地且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有tt子组合也具体地由本发明所涵盖并且在本文中公开就好象每个这种tt子组合个别地且明确地在本文中公开一样。tt
本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。tt本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权使借助于在先发tt明的这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于真实的tt出版日期，真实的出版日期可能需要独立地进行确认。tt
详细说明tt
本公开提供包含变体衣壳蛋白和异源核酸的感染性重组腺相关tt病毒(rAAV)病毒粒子。本公开还提供变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白tt(和/或编码变体AAV衣壳蛋白的核酸)，其向感染性rAAV病毒粒子tt赋予对人AAV中和抗体的提高的抗性。本公开还提供包含感染性ttrAAV病毒粒子和/或编码所述变体AAV衣壳蛋白的核酸的宿主细胞。tt本公开还提供以上病毒粒子、衣壳蛋白、核酸和/或宿主细胞的文库；tt其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含相对于SEQIDttNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列具有至少一个氨基酸tt取代的氨基酸序列。tt
本公开还提供向靶细胞递送异源核酸的方法，其中使靶细胞与所tt述感染性rAAV病毒粒子接触。本公开还提供向个体递送基因产物的tt方法，所述方法一般涉及向需要其的个体施用有效量的所述rAAV病tt毒粒子。本文还提供用于实践所述方法的组合物和试剂盒。在许多实tt施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子、所述核酸、所述变体AAVtttttt衣壳蛋白、所述宿主细胞等等是分离的。tt
变体AAV衣壳多肽tt
所述变体AAV衣壳多肽(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋tt白)向包含变体AAV衣壳多肽的感染性rAAV病毒粒子赋予与由野生tt型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白tt的AAV展现的抗性相比对人AAV中和抗体的提高的抗性。在一些实tt施方案中，提高的抗性是由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血tt清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV所展现的抗性的至少约1.5倍tt(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少tt约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、tt至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约tt40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、tt至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大。tt
所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码的变体AAV衣壳蛋tt白)可向感染性rAAV病毒粒子赋予与由野生型AAV(例如，AAV2(野tt生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的转导相比tt在人AAV中和抗体存在下提高的哺乳动物细胞转导。在一些实施方tt案中，提高的转导是由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型tt2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV所展现的转导的至少约1.5倍(例tt如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约tt5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至tt少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40tt倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至tt少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)展现与结合野生型AAV衣壳蛋白的中和抗体tt减少的结合。例如，所述变体AAV衣壳蛋白可展现与抗体和野生型ttttttAAV衣壳蛋白的结合亲和力相比与结合野生型衣壳AAV蛋白的中和tt抗体至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、tt至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12tt倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少tt约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、tt至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍等)减tt弱的结合(例如，降低的亲和力)。tt
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体以小于约10-7M、小于约tt5×10-6M、小于约10-6M、小于约5×10-5M、小于约10-5M、小于tt约10-4M或更小的亲和力结合至所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核tt酸编码的变体AAV衣壳蛋白)。tt
术语“变体衣壳蛋白”不包括野生型AAV衣壳蛋白。“变体AAVtt衣壳蛋白”不包含存在于天然存在的AAV衣壳蛋白中的氨基酸序列。tt例如，所述变体衣壳蛋白不包含与在SEQIDNO:1-9中列出的任何序tt列具有100％序列同一性的氨基酸序列。换句话说，所述变体衣壳蛋tt白不包含在SEQIDNO:1-9的任一个中列出的氨基酸序列。变体AAVtt衣壳蛋白在氨基酸序列方面与“起始”或“亲本”AAV衣壳蛋白不同，所tt述亲本AAV衣壳蛋白可以是野生型AAV衣壳蛋白或非野生型AAVtt衣壳蛋白。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:10-13及26-33的一个中tt列出的氨基酸序列的氨基酸203-736具有至少约90％(例如，至少约tt92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少tt约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:10-13及26-33的一个中tt列出的氨基酸序列具有至少约90％(例如，至少约92％、至少约95％、tttttt至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、tt或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列tt的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、tt至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一tt性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAVtt衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、tt及L735Q，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:10中列出的氨基酸序列tt具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至tt少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，tt并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基tt酸取代N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、及L735Q，或在tt另一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:31中列出的氨基酸序列tt的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、tt至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一tt性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAVtt衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、N551S、及I698V，或在另tt一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:31中列出的氨基酸序列tt具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至tt少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，tttttt并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基tt酸取代N312K、N449D、N551S、及I698V，或在另一AAV亲本血tt清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:32中列出的氨基酸序列tt的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、tt至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一tt性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAVtt衣壳蛋白的氨基酸取代D180N、N312K、Q385R、N449D、N551S、ttI698V、及S721T，或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:32中列出的氨基酸序列tt具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至tt少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，tt并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAV衣壳蛋白的氨基tt酸取代D180N、N312K、Q385R、N449D、N551S、I698V、及S721T，tt或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:33中列出的氨基酸序列tt的氨基酸203-736具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、tt至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一tt性的氨基酸序列，并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO:2)的AAVtt衣壳蛋白的氨基酸取代N312K、N449D、T450A、N551S、及I698V，tt或在另一AAV亲本血清型中的相应位置。tt
在一些实施方案中，所述变体AAV衣壳蛋白(或由所述核酸编码tt的变体AAV衣壳蛋白)包含与在SEQIDNO:33中列出的氨基酸序列tt具有至少约95％(例如，至少约96％、至少约97％、至少约98％、至tttttt少约99％、至少约99.5％、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列，tt并且包括相对于AAV2(例如，SEQIDNO：2)的AAV衣壳蛋白的氨基tt酸取代N312K、N449D、T450A、N551S、及I698V，或在另一AAVtt亲本血清型中的相应位置。tt
示例性变体AAV衣壳蛋白包括但不限于(参见图8-10关于选定tt的示例性序列比对)：tt
SM10-2(氨基酸序列)(SEQIDNO：10)：tt
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPttGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFttQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDttSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSttGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKttQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLttKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPttADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFttHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTDTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRNQSRttNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKttDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTSVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLttQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGttGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSttKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ；tt
SM10-2(核苷酸序列)(SEQIDNO：22)：tt
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaattacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcttggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctatgttaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggaacgccttaaagaagttttttatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacttctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggttcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggttacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgattgggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcttacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcattctactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatttcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaagttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacgttgtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcttggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggattgtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggtaacaactttaccttcagctattcacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctttgtattacttgagcagaacagacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattttcggaaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacattgtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagcttcacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaagtgtggacttattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccttaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacttagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattttcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaattagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaattcgctggaatcccgaagttcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcattgagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatcagtaatt
改组100-1(氨基酸序列)(SEQIDNO：11)：tt
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPttGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEttFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPttDSSTGIGKKGKQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGttGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKttQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLttNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPttADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFttttttHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQttPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHttKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAttVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLttMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKEttNSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL；tt
改组100-1(核苷酸序列)(SEQIDNO：23)：tt
atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaattcctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcgttgacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgattccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgattcacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcttgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaattggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagttaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggttcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcaccttcgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccattctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatttcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatgttgcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcttggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggattgtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctattcacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctttgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccagctggcatttgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacattgcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacattaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggttacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccaccgaaagatttgggactgtggcagtcaatttctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgttatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagagttacgtatacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggctttggattctcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgcttttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagtgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaagcgctggattttttatcccgaagtgcagtacacatccaattatgcaaaatctgccaacgttgattttactgtggacaacaatggactttatactgagcctcttgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctgtaa；tt
改组100-3(氨基酸序列)(SEQIDNO：12)：tt
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPttGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEttFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPttDSSTGIGKKGKQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGttGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKttQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLttNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPttADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFttHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPTGMSVQPttKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKttDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVttNLQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLttMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKEttNSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL；tt
改组100-3(核苷酸序列)(SEQIDNO：24)：tt
atggctgctgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaattcctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcgttgacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgattccagcagctcaaggccggtgacaacccctacctcaagtacaaccacgccgacgcggagttccagcagcggcttcagggcgattcacatcgtttgggggcaacctcggcagagcagtcttccaggccaaaaagagggttcttgaacctcttggtctggttgagcaagcttgggtgagacggctcctggaaagaagagaccgttgattgaatccccccagcagcccgactcctccacgggtatcggcaaaaaattggcaagcagccggctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcggagttaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggtggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggttcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcaccttcgcacctgggccttgcccacctacaataaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcaacgggggccagcaacgacaaccattctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatttcaacaacaattggggattccggcccaagagactcaacttcaaactcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgacgaatgatgttgcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcttggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggattttttgtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctattcacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctttgtattacctgaacagaactcagaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgggggtctccaactggcatttgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacaacaacattgcaactttacctggactggtgcttcaaaatataaccttaatgggcgtgaatctataatcaaccctggcactgctatggcctcacacattaagacgacaaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaggagagcgccggagcttcaaacactgcattggttacaatgtcatgatcacagacgaagaggaaatcaaagccactaaccccgtggccactgaaagatttgggactgtggcagtcaatttctccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgccatgggagccttacctggaatggtgtggcaagacagattgacgtatacctgcagggtcctatttgggccaaaattcctcacacggatggacactttcacccgtctcctctcatgggcggctttggttactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaaagtttgttcttcattcatcacccagtattccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggttaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacgttgatttcactgtggacaacaatggactttatactgagcctttcgccccattggcacccgttacctcacccgtcccctgtaa；tt
改组100-7(氨基酸序列)(SEQIDNO：13)：tt
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLttPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAttEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEttPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGttGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYttKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKttRLSFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPttFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPttFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVttQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASttHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEFIKATNPVATERFGTVttAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPttLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKttENSKRWNPEVQYTSNYAKSANIDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPQ；tt
改组100-7(核苷酸序列)(SEQIDNO：25)：tt
atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggcgctgaattacctggagccccgaagcccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctttcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggatgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacttttttgaccagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaattgatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggattaggcgctaagacggctcctggaaagaaacgtccggtagagcaatcgccacaagagccagactcctcctcgggcatcggcaattgacaggccagcagcccgctaaaaagagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagtccccgacccacaacctctcttggagaacctccagcaacccccgctgctgtgggacctactacaatggcttcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgttaaggcgccgacggagtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagttcacccgaacatgggccttgcccacctataacaaccacctctacaagcaaatctccagtgcttcgacgggggccagcaacgacttaaccactacttcggctacagcaccccctgggggtattttgactttaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgttactcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcagcttcaagctcttcaacatccaggtcaaggaggtcacgacgattatgatggcgtcacaaccatcgctaataaccttaccagcacggttcaagtcttctcggactcggagtaccagcttccgtacgtcctcttggctctgcgcaccagggctgcctccctccgttcccggcggacgtgttcatgattccgcaatacggctacctgacgctcaacaatttggcagccaagccgtgggacgttcatccttttactgcctggaatatttcccttctcagatgctgagaacgggcaacaactttaccttcttagctacacctttgaggaagtgcctttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaatcctctcatcgatttcaatacctgtattacctgaacagaactcaaaatcagtccggaagtgcccaaaacaaggacttgctgtttagccgtgggtctccagttctggcatgtctgttcagcccaaaaactggctacctggaccctgttatcggcagcagcgcgtttctaaaacaaaaacagacaacattacaacagcaattttacctggactggtgcttcaaaatataacctcaatgggcgtgaatccatcatcaaccctggcactgctatggcctttcacataaagacgacgaagacaagttctttcccatgagcggtgtcatgatttttggaaaagagagcgccggagcttcaaacactttgcattggacaatgtcatgattacagacgaagaggaaattaaagccactaaccctgtggccaccgaaagatttgggaccgtggcttagtcaatttccagagcagcagcacagaccctgcgaccggagatgtgcatgctatgggagcattacctggcatggtgtggcaagttatagagacgtgtacctgcagggtcccatttgggccaaaattcctcacacagatggacactttcacccgtctcctcttatgggcggttctttggactcaagaacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacgcctgttcctgcgaatcctccggcggagttttcagctacaattagtttgcttcattcatcacccaatactccacaggacaagtgagcgtggagattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaattcgctggaatcccgaagtgcagtatacatctaactatgcaaaatctgccaacattgatttcactgtggacaacaatggactttatactttgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtccccagtaa；tt
改组10-2(氨基酸序列)(SEQIDNO：26)：tt
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLttPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAttEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEttPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSLTMASGttGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYttKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKttRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPttttttFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPttFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVttQPKNWLPGPCYRQQCVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASttHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVttAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSttPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQttKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL；tt
改组10-2(核苷酸序列)(SEQIDNO：34)：tt
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改组10-6(氨基酸序列)(SEQIDNO：27)：tt
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SM10-8(核苷酸序列)(SEQIDNO：39)：tt
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SM100-3(氨基酸序列)(SEQIDNO：32)：tt
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SM100-3(核苷酸序列)(SEQIDNO：40)：tt
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SM100-10(氨基酸序列)(SEQIDNO：33)：tt
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SM100-10(核苷酸序列)(SEQIDNO：41)：tt
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核酸和宿主细胞tt
本公开提供包含编码变体AAV衣壳蛋白(如上所述)的核苷酸序tt列的核酸，以及包含所述核酸的宿主细胞。核酸和宿主细胞适用于生tt成rAAV病毒粒子(如下所述)。tt
本公开提供包含所述核酸的宿主细胞，例如分离的宿主细胞。所tt述宿主细胞可被称为“遗传修饰的宿主细胞”且通常是分离的细胞，例tt如，在体外培养中的细胞。所述宿主细胞适用于产生所述rAAV病毒tt粒子，如下所述。当所述宿主细胞用于产生所述rAAV病毒粒子时，tt其被称为“包装细胞”。在一些实施方案中，所述宿主细胞被所述核酸tt稳定地遗传修饰(即，稳定地转染)。在其他实施方案中，所述宿主细tt胞被所述核酸瞬时遗传修饰(即，瞬时转染)。tt
使用已建立的技术将所述核酸稳定地或瞬时引入宿主细胞中，所tttttt述技术包括(但不限于)电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染等等。tt为进行稳定的转化，所述核酸通常还包含可选择标记，例如，如新霉tt素抗性等几种众所周知的可选择标记中的任一种。tt
通过将所述核酸引入多种细胞的任一种中生成所述宿主细胞，所tt述多种细胞是例如包括例如鼠细胞和灵长类细胞(例如，人细胞)的哺tt乳动物细胞。适合的哺乳动物细胞包括但不限于原代细胞和细胞系，tt其中适合的细胞系包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、ttVero细胞、3T3小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细tt胞等等。tt
在一些实施方案中，所述宿主细胞除包含编码突变衣壳蛋白的核tt苷酸序列的核酸之外还包括包含编码一种或多种AAVrep蛋白的核tt苷酸序列的核酸。在其他实施方案中，所述宿主细胞还包含rAAV载tt体，如下所述。如以下更详细地描述，rAAV病毒粒子是使用所述宿tt主细胞生成的。tt
感染性rAAV病毒粒子tt
所述感染性rAAV病毒粒子包含变体AAV衣壳蛋白和异源核酸tt(在下文中更详细地描述)，并且展现与由野生型AAV(例如，AAV2(野tt生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的抗性相比tt对人AAV中和抗体的提高的抗性。“提高的抗性”意味着所述感染性ttrAAV病毒粒子在人抗AAV抗体存在下展现提高的感染性。如上所tt述，病毒感染性可表示为感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率。因此，tt提高的感染性意味着感染性病毒粒子与总病毒粒子的比率提高。为了tt测定AAV对人抗AAV抗体的抗性，AAV的感染性是在各种浓度的tt人抗AAV抗体的存在下测量以便获得降低基因递送效率(即感染性)tt至在人抗AAV抗体不存在下所述效率的50％所需的抗体浓度(例如，tt血清浓度、IVIG浓度等)(mg/mL)。需要更高的抗体浓度以降低基因tt递送效率至人抗AAV抗体不存在下的效率的50％的病毒据说对抗体tttttt中和具有提高的抗性。因此，抗性的两倍提高意味着降低基因递送效tt率至人抗AAV抗体不存在下的效率的50％所需的抗体浓度的两倍提tt高。在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与由野生型ttAAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或包含野生型衣壳蛋白的ttAAV展现的抗性相比至少约1.5倍(例如，至少约1.5倍、至少约2tt倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约7.5倍、至少约tt10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、至少约20倍、tt至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约tt75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250tt倍、至少约300倍等)大的对人AAV中和抗体的抗性。tt
所述感染性rAAV病毒粒子据说在人AAV中和抗体存在下展现tt提高的哺乳动物细胞转导。在一些实施方案中，所述感染性rAAV病tt毒粒子展现与由野生型AAV(例如，AAV2(野生型AAV血清型2))或tt包含野生型衣壳蛋白的AAV展现的转导相比至少约1.5倍(例如，至tt少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、tt至少约7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约tt17倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、tt至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约tt200倍、至少约250倍、至少约300倍等)大的在人AAV中和抗体存tt在下的哺乳动物细胞转导。tt
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与结合野生tt型AAV衣壳蛋白的中和抗体减少的结合。例如，所述感染性rAAVtt病毒粒子可展现与抗体和野生型AAV衣壳蛋白的结合亲和力相比与tt结合野生型衣壳AAV蛋白的中和抗体至少约1.5倍(例如，至少约1.5tt倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约tt7.5倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约15倍、至少约17倍、tt至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约tt50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、tt至少约250倍、至少约300倍等)减弱的结合(例如，降低的亲和力)。tt
在一些实施方案中，抗AAV中和抗体以小于约10-7M、小于约tt5×10-6M、小于约10-6M、小于约5×10-5M、小于约10-5M、小于tt约10-4M或更小的亲和力结合至所述感染性rAAV病毒粒子。tt
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子展现与野生型ttAAV相比增加的体内停留时间。例如，所述感染性rAAV病毒粒子展tt现与野生型AAV的停留时间相比至少约10％、至少约25％、至少约tt50％、至少约100％、至少约3倍、至少约5倍、至少约10倍、至少tt约25倍、至少约50倍、至少约100倍或更多倍长的停留时间。tt
给定的所述感染性rAAV病毒粒子是否展现与中和抗体减弱的结tt合和/或对中和抗体提高的抗性可使用本领域普通技术人员已知的任tt何便利的测定来确定。tt
在一些实施方案中，所述感染性rAAV病毒粒子包含野生型ttRep78、Rep68、Rep52、及Rep40蛋白。在其他实施方案中，所述感tt染性rAAV病毒粒子除一种或多种变体衣壳蛋白之外还包含在ttRep78、Rep68、Rep52、及Rep40蛋白的一个或多个中的一个或多个tt突变。tt
异源核酸tt
供所述rAAV载体(例如，所述感染性rAAV病毒粒子)中使用的tt适合的异源DNA分子(在本文中也被称为“异源核酸”)可以是任何异tt源核酸。在一些实施方案中，异源核酸包含编码多肽(例如，向靶细tt胞赋予某些所需特征的蛋白质，例如，允许细胞示踪的荧光蛋白、提tt供靶细胞中丢失或改变的活性的酶，等等)的核苷酸序列。在一些实tt施方案中，异源核酸包含RNA干扰剂(如上所定义)。tt
所述异源核酸的大小一般小于约5千碱基(kb)且将包括例如编码tt受体个体或靶细胞中有缺陷或缺少的蛋白质的基因(核苷酸序列)；编tt码具有所需生物或治疗效果(例如，抗细菌、抗病毒或抗肿瘤/抗癌功tttttt能)的蛋白质的基因；编码抑制或减少有害或另外不希望有的蛋白质tt的产生的RNA的核苷酸序列(例如，编码如上所定义的RNA干扰剂tt的核苷酸序列)；和/或编码抗原蛋白的核苷酸序列。tt
适合的异源核酸包括但不限于编码用于治疗以下疾病的蛋白质tt的核酸：内分泌、代谢、血液、心血管、神经、肌肉骨骼、泌尿、肺tt和免疫病症，包括如炎性病症、自身免疫病症、慢性和感染性病症(如tt获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、癌症、高胆固醇血症；溶酶体贮积病，tt如激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷过多症、天tt冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、慢性己糖胺酶A缺乏症、tt胱氨酸过多症、Danon病、Fabry病、Farber病、岩藻糖苷贮积症、tt半乳糖唾液酸沉积症、戈谢病(Gaucherdisease)、GM1神经节苷脂沉tt积症、细胞内含物病/II型粘脂病、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、幼tt年型己糖胺酶A缺乏症、克腊比病、溶酶体酸脂肪酶缺乏症、异染tt性脑白质营养不良、粘多糖症(包括假胡尔勒氏多种营养不良/IIIA型tt粘脂病、MPSI赫尔利综合征(MPSIHurlerSyndrome)、MPSI沙伊综tt合征(MPSIScheieSyndrome)、MPSI赫尔利-沙伊综合征(MPSIttHurler-ScheieSyndrome)、MPSII亨特综合征(MPSIIHunterttsyndrome)、A型圣菲力浦综合征(Sanfilipposyndrome)/MPSIIIA、Btt型圣菲力浦综合征/MPSIIIB、C型圣菲力浦综合征/MPSIIIC、D型tt圣菲力浦综合征/MPSIIID、A型Morquio/MPSIVA、B型Morquiott/MPSIVB、MPSIX透明质酸酶缺乏症、MPSVIMaroteaux-Lamy、ttMPSVIISly综合征、I型粘脂病/唾液酸沉积症、IIIC型粘脂病、及ttIV型粘脂病)、多发性硫酸脂酶缺乏症、尼-皮二氏病(Niemann-PickttDisease)、神经元蜡样脂褐质沉积症、蓬佩病(Pompedisease)/II型糖tt原贮积病、致密性成骨不全症、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)/成人发tt病/GM2神经节苷脂沉积症、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症-婴tt儿型、桑德霍夫病/GM2神经节苷脂沉积症-幼年型、Schindler病、扎tt拉病(Salladisease)/唾液酸贮积病、Tay-Sachs/GM2神经节苷脂沉积tt症、及沃尔曼病(Wolmandisease)；胰岛素病症，如糖尿病、生长紊tttttt乱、各种血液病症，包括各种贫血症、地中海贫血和血友病；遗传缺tt陷，如囊性纤维化、高歇氏病(Gaucher'sDisease)、胡尔勒病(Hurler'sttDisease)、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症、肺气肿等等。tt
适合的异源核酸包括但不限于编码包括但不限于以下的多种蛋tt白质中的任一种的那些：干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω、ttIFN-τ)；胰岛素(例如，诺和灵、优泌林、优泌乐、来得时(Humalog)、tt优乐停(Lantus)等)；促红细胞生成素(“EPO”；例如，或(依泊汀-α)；(达贝泊汀-α)；(依泊汀-β)；等等)；抗体(例如，单克隆抗体)(例如，(利妥昔单抗)；(英夫利昔单抗)；(曲妥单抗)；ttHumiraTM(阿达木单抗)；(奥马佐单抗)；(托西莫单tt抗)；RaptivaTM(依法珠单抗)；ErbituxTM(西妥昔单抗)；(贝tt伐单抗)；等等)，包括单克隆抗体的抗原结合片段(例如，(雷tt珠单抗))；血液因子(例如，(阿替普酶)组织纤溶酶原活化tt蛋白；(重组人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，tt)；因子IX；β-球蛋白；血红蛋白；等等)；集落刺激因子(例tt如，(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(聚乙二醇化非格司亭)；tt粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子、巨噬tt细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子；等等)；生长激素(例如，tt生长激素(somatotropin)，例如，等；人生长激素；等等)；白介素(例tt如，IL-1；IL-2，包括例如，IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、ttIL-8、IL-9；等)；生长因子(例如，(beclapermin；PDGF)；tt(曲弗明；bFGF)；(安西司亭；干细胞因子)；角质tt细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、碱性成纤维tt细胞生长因子、肝细胞生长因子；等等)；可溶性受体(例如，TNF-αtt结合可溶性受体，如(依那西普)；可溶性VEGF受体；可溶tt性白介素受体；可溶性γ/δT细胞受体；等等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；tt(imiglucarase；β-葡糖脑苷脂酶、(阿糖苷酶)；tttttt酶激活剂(例如，组织型纤溶酶原激活剂)；趋化因子(例如，IP-10；ttMig；Groα/IL-8；RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4；等等)；tt血管生成剂(例如，血管内皮生长因子(VEGF)；抗血管生成剂(例如，tt可溶性VEGF受体)；蛋白疫苗；神经活性肽，如血管舒缓激肽、缩tt胆囊肽、胃泌素、分泌素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、tt脑啡肽、P物质、生长激素释放抑制因子、催乳素、甘丙肽、生长激tt素释放激素、韩蛙皮素、强啡肽、神经降压素、胃动素、促甲状腺激tt素、神经肽Y、黄体生成素、降血钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压tt素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽tt等；其他蛋白，如溶解血栓剂、心钠肽、骨形态发生蛋白、促血小板tt生成素、松弛素、胶质细胞原纤维酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗tt胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、黄tt体生成素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、嗜中性白细胞趋化因tt子、神经生长因子、金属蛋白酶的组织抑制剂；血管活性肠肽、血管tt生成素、促血管素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体tt拮抗剂(例如，(阿那白滞素))；离子通道，例如，囊性纤维化tt跨膜传导调节蛋白(CFTR)；肌营养不良蛋白(dystrophin)；utrophin(一tt种肿瘤抑制剂)；溶酶体酶酸α-葡糖苷酶(GAA)；等等。适合的核酸tt还包括编码任何上述蛋白的功能性片段的那些；以及编码任何上述蛋tt白的功能性变体的核酸。tt
适合的异源核酸还包括编码抗原蛋白的那些。包含编码抗原蛋白tt的异源核酸的所述rAAV载体适用于在哺乳动物宿主中刺激对抗原蛋tt白的免疫应答。抗原蛋白来源于自身抗原、变应原、肿瘤/癌症相关tt抗原、致病病毒、致病细菌、致病原虫、致病蠕虫、或感染哺乳动物tt宿主的任何其他致病生物。如本文所用，术语“编码源自……的抗原tt蛋白的核酸”包括编码野生型抗原蛋白的核酸，例如，从编码病毒蛋tt白的致病病毒中分离的核酸；在实验室中生成的编码与天然存在的抗tt原蛋白在氨基酸序列方面相同的抗原蛋白的合成核酸；在实验室中生tt成的编码与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面不同(例如，1个氨tttttt基酸至约15个氨基酸)但仍诱导对相应的天然存在的抗原蛋白的免疫tt应答的抗原蛋白的合成核酸；在实验室中生成的编码抗原蛋白片段tt(例如，约5个氨基酸至约50个氨基酸的片段，该片段包含一个或多tt个抗原表位)的合成核酸，所述片段诱导对相应的天然存在的抗原蛋tt白的免疫应答；等等。tt
类似地，“源自于”自身抗原、变应原、肿瘤/癌症相关抗原、致tt病病毒、致病细菌、致病原虫、致病蠕虫、或感染哺乳动物宿主的任tt何其他致病生物的抗原蛋白包括与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序tt列方面相同的蛋白、以及与天然存在的抗原蛋白在氨基酸序列方面不tt同(例如，1个氨基酸至约15个氨基酸)但仍诱导对相应的天然存在的tt抗原蛋白的免疫应答的蛋白；及抗原蛋白的片段(例如，约5个氨基tt酸至约100个氨基酸的片段，例如约5个至约50个氨基酸，该片段tt包含一个或多个抗原表位)，所述片段诱导对相应的天然存在的抗原tt蛋白的免疫应答。tt
在一些实施方案中，对由所述rAAV载体编码的抗原蛋白的免疫tt应答将在哺乳动物宿主中刺激对呈现抗原蛋白或抗原表位(或与编码ttrAAV的抗原蛋白或抗原表位有交叉反应的蛋白或表位)的致病生物tt的保护性免疫应答。在一些实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的tt细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答将在哺乳动物宿主中诱导。在其他实tt施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的体液应答将在哺乳动物宿主中tt诱导，以使得生成对抗原蛋白有特异性的抗体。在许多实施方案中，tt对编码rAAV的抗原蛋白的TH1免疫应答将在哺乳动物宿主中诱导。tt适合的抗原蛋白包括肿瘤/癌症相关抗原、病毒抗原、细菌抗原、以tt及原虫抗原；及其抗原性片段。在一些实施方案中，抗原蛋白源自于tt细胞内病原体。在其他实施方案中，抗原蛋白是自体抗原。在其他实tt施方案中，抗原蛋白是变应原。tt
肿瘤/癌症特异性抗原包括但不限于各种MAGE(黑素瘤相关抗tt原E)中的任一种，包括MAGE1(例如，GenBank登记号M77481)、ttttttMAGE2(例如，GenBank登记号U03735)、MAGE3、MAGE4等；tt各种酪氨酸酶中的任一种；突变ras；突变p53(例如，GenBank登记tt号X54156和AA494311)；以及p97黑素瘤抗原(例如，GenBank登记tt号M12154)。其他肿瘤/癌症特异性抗原包括与晚期癌症有关的Rastt肽和p53肽、与子宫颈癌有关的HPV16/18和E6/E7抗原、与乳癌有tt关的MUCI1-KLH抗原(例如，GenBank登记号J03651)、与结肠直肠tt癌有关的CEA(癌胚抗原)(例如，GenBank登记号X98311)、与黑素瘤tt有关的gp100(例如，GenBank登记号S73003)或MART1抗原、以及tt与前列腺癌有关的PSA抗原(例如，GenBank登记号X14810)。p53tt基因序列是已知的(参见，例如Harris等人(1986)Mol.Cell.Biol.,tt6:4650-4656)且以GenBank登记号M14694保藏。因此，所述蛋白质、tt核酸和/或病毒粒子可用作用于包括但不限于以下癌症的免疫治疗tt剂：子宫颈癌、乳癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌，以及用于黑素tt瘤。tt
病毒抗原源自于造成包括但不限于以下疾病的已知病原体：麻tt疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎(例如GenBanktt登记号E02707)和丙型肝炎(例如，GenBank登记号E06890)、以及其tt他肝炎病毒、流感、腺病毒(例如，4型和7型)、狂犬病(例如，GenBanktt登记号M34678)、黄热病、日本脑炎(例如，GenBank登记号E07883)、tt登革热(例如，GenBank登记号M24444)、汉坦病毒、以及人类免疫tt缺陷病毒(例如，GenBank登记号U18552)。tt
适合的细菌和寄生虫抗原包括源自于造成包括但不限于以下疾tt病的已知病原体的那些抗原：白喉、百日咳(例如，GenBank登记号ttM35274)、破伤风(例如，GenBank登记号M64353)、肺结核、细菌及tt真菌性肺炎(例如，流感嗜血杆菌、肺炎肺囊虫等)、霍乱、伤寒、瘟tt疫、志贺氏菌病、沙门氏菌病(例如，GenBank登记号L03833)、军团tt菌病(Legionnaire'sDisease)、莱姆病(例如，GenBank登记号U59487)、tt疟疾(例如，GenBank登记号X53832)、钩虫病、盘尾丝虫病(例如，ttGenBank登记号M27807)、血吸虫病(例如，GenBank登记号L08198)、tttttt锥虫病、利什曼病、贾第鞭毛虫病(例如，GenBank登记号M33641)、tt阿米巴病、丝虫病(例如，GenBank登记号J03266)、莱姆包柔螺旋体tt病、以及旋毛虫病。tt
编码异源基因产物的适合的异源核酸包括非翻译RNA，如RNAitt试剂(如上文中更详细地描述)(例如，反义RNA；siRNA；shRNA；双tt链RNA(dsRNA)；CRISPR试剂，例如Cas9或Cas9样蛋白、crRNAtt样RNA、tracrRNA样RNA、单指导RNA和/或供体多核苷酸；等等)、tt核糖酶等。RNAi试剂可用于抑制基因表达。一些RNAi试剂提供可tt随后用于抑制基因表达的工具(例如，CRISPR试剂，如cas9或cas9tt样蛋白)。tt
靶基因包括编码有害的(例如病理的)靶基因产物(RNA或蛋白质)tt的任何基因，例如，功能障碍的靶基因产物(例如，由于在编码的蛋tt白质序列中的突变，由于在控制基因产物的稳态水平的非编码序列中tt的突变，等等)。靶基因产物包括但不限于：享延顿；丙型肝炎病毒；tt人类免疫缺陷病毒；淀粉状蛋白前体蛋白质；tau；包括聚谷氨酰胺tt重复的蛋白质；疱疹病毒(例如，水痘带状疱疹)；任何致病病毒；等tt等。tt
因此，包括编码RNAi试剂的异源核酸的所述rAAV适用于治疗tt包括但不限于以下的多种病症和病状：神经变性疾病，例如，三核苷tt酸重复疾病，如与聚谷氨酰胺重复有关的疾病，例如亨廷顿舞蹈病、tt脊髓小脑共济失调、脊髓延髓肌萎缩(SBMA)、齿状核红核苍白球路tt易体萎缩(DRPLA)等；获得性病理现象(例如，由异常的生理、生化、tt细胞、结构、或分子生物状态所表现的疾病或综合征)，如病毒感染，tt例如，作为HCV感染结果或可能作为HCV感染结果的肝炎、作为ttHIV感染结果的获得性免疫缺陷综合征；癌症等等。tt
在许多实施方案中，编码RNAi试剂的异源核酸可操作地连接至tt启动子。适合的启动子为本领域技术人员已知且包括任何蛋白编码基tttttt因的启动子，例如内源性调节基因或组成型表达基因的启动子。例如，tt可将由细胞生理活动(例如，热休克、氧水平和/或一氧化碳水平，例tt如缺氧时)所调节的基因的启动子可操作地连接于siRNA编码核酸。tt
选择的异源核苷酸序列(如，编码EPO的或感兴趣的核酸)可操作tt地连接于指导该核苷酸序列的体内转录或表达的控制元件。这种控制tt元件可含有通常与所选择的基因(例如，内源性细胞控制元件)相连的tt控制序列。或者，可采用异源控制序列。有用的异源控制序列一般包tt括源自于编码哺乳动物或病毒基因序列的那些异源控制序列。实例包tt括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)tt启动子；腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动tt子、对于感兴趣的基因是异源的内源细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)tt启动子如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)tt启动子、合成启动子、杂合启动子等等。另外，本文也使用源自于非tt病毒基因如鼠金属硫蛋白基因的序列。这种启动子序列可从例如ttStratagene(SanDiego,Calif.)商购获得。tt
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性启动子将可操tt作连接至编码异源基因产物的异源核酸，以使得该基因产物在特定的tt细胞类型或组织中选择性地或优先地产生。在一些实施方案中，诱导tt性启动子将可操作连接至异源核酸。tt
例如，肌肉特异性和诱导性启动子、增强子等适用于将基因产物tt递送至肌细胞。这种控制元件包括但不限于：源自于肌动蛋白和肌球tt蛋白基因家族的那些控制元件，如来自myoD基因家族；肌细胞特异tt性增强子结合因子MEF-2；源自于人骨骼肌动蛋白基因和心脏肌动蛋tt白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件及鼠肌酸激酶增强子tt(mCK)元件；源自于骨骼快收缩肌钙蛋白C基因、慢收缩心脏肌钙蛋tt白C基因及慢收缩肌钙蛋白I基因的控制元件；低氧诱导性核因子；tt类固醇诱导性元件及启动子，如糖皮质激素反应元件(GRE)；用于ttRU486诱导的融合一致元件；以及提供用于四环素调控基因表达的元tttttt件。tt
具有和AAVITR相连的感兴趣的DNA分子(异源DNA)的AAVtt表达载体可通过将所选择的序列直接插入到切除了主要AAV开放阅tt读框(“ORF”)的AAV基因组来构建。AAV基因组的其他部分也可以tt缺失，只要保留足够部分的ITR以允许复制和包装功能。这种构建体tt可使用本领域中公知的技术来设计。参见，例如美国专利号5,173,414tt和5,139,941；国际公布号WO92/01070(1992年1月23日公布)和ttWO93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等人(1988)Molec.ttCell.Biol.8:3988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines90(ColdSpringttHarborLaboratoryPress)；Carter,B.J.(1992)CurrentOpinioninttBiotechnology3:533-539；Muzyczka,N.(1992)CurrentTopicsinttMicrobiol.andImmunol.158:97-129；Kotin,R.M.(1994)HumanGenettTherapy5:793-801；Shelling和Smith(1994)GeneTherapy1:165-169；tt以及Zhou等人(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。tt
或者，AAVITR可以由病毒基因组或由AAV载体上切除获得，tt所述AAV载体包含病毒基因组且使用本领域技术人员已知的任何便tt利方法将其与存在于另一个载体中的选定核酸构建体的5'和3'端融tt合。例如，一种适合的手段使用标准连接技术，如描述于Sambrooktt等人,同上中的那些。例如，可在20mMTris-ClpH7.5、10mMMgCl2、tt10mMDDT、33μg/mlBSA、10mM-50mMNaCl，和40μMATP、tt0.01-0.02(Weiss)单位T4DNA连接酶在0℃至16℃(用于“粘性末端”tt连接)或1mMATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4DNA连接酶在14℃(用于tt“钝端”连接)下完成连接。分子间“粘性末端”连接通常在30-100μg/mltt总DNA浓度(5-100nM总的终浓度)下进行。含有ITR的AAV载体tt已描述于例如美国专利号5,139,941中。具体说来，若干AAV载体描tt述于其中，它们是以登记号53222、53223、53224、53225及53226tt获自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)。tt
另外，嵌合基因可合成地产生，以包括排列一个或多个选定的核tttttt酸序列5'和3'端的AAVITR序列。可以使用哺乳动物肌细胞中用于tt表达嵌合基因序列的优选密码子。完全嵌合序列由通过标准方法制备tt的重叠寡聚核苷酸装配。参见，例如Edge,Nature(1981)292:756；ttNambair等人Science(1984)223:1299；Jay等人J.Biol.Chem.(1984)tt259:6311。tt
所述感染性rAAV病毒粒子的生成tt
经由引入，通常采用宿主或“生产者”细胞用于rAAV载体复制和tt包装。这种生产者细胞(通常是哺乳动物宿主细胞)一般包含或被修饰tt以包含若干不同类型的组分用于rAAV产生。第一组分是可被宿主包tt装细胞复制并包装到载体粒子中的重组腺相关病毒(rAAV)载体基因tt组(或“rAAV原载体”)。既然将这种转基因包装到rAAV载体粒子中可tt有效地用于将转基因递送至多种哺乳动物细胞，rAAV原载体通常将tt包含在基因疗法中在遗传上改变另一种细胞所需的异源多核苷酸(或tt“转基因”)。转基因通常侧接有两个AAV反向末端重复序列(ITR)，该tt序列含有在AAV载体的切除、复制和包装过程中以及在该载体整合tt入宿主细胞基因组的过程中识别的序列。tt
第二组分是可提供用于AAV复制的辅助功能物的辅助病毒。虽tt然通常采用腺病毒，但是其他辅助病毒也可如本领域中已知来使用。tt或者，所需的辅助病毒功能物可从辅助病毒中遗传地分离并且编码基tt因可用于以反式提供辅助病毒功能物。AAV载体元件和辅助病毒(或tt辅助病毒功能物)可同时或依次以任何顺序引入宿主细胞中。tt
生产者细胞中有待提供的用于AAV产生的最终组分是“AAV包tt装基因”，如分别提供复制和衣壳化蛋白的AAVrep和cap基因。可tt提供几种不同形式的AAV包装基因(包括rep-cap表达盒与分开的reptt和/或cap表达盒)，其中rep和/或cap基因可被置于天然启动子或可tt操作连接的异源启动子的控制下。可将这种AAV包装基因瞬时或稳tt定地引入宿主包装细胞，这是本领域已知的并详述于下文中。tt
1.rAAV载体tt
含有感兴趣的异源DNA的所述rAAV病毒粒子(其中“感兴趣的tt异源DNA”在本文还被称为“异源核酸”)可使用本领域技术人员已知tt的标准方法产生。这些方法通常涉及以下步骤：(1)将所述rAAV载体tt引入宿主细胞；(2)将AAV辅助构建体引入宿主细胞，其中辅助构建tt体包含的AAV编码区域能在宿主细胞中表达来补充AAV载体所缺乏tt的AAV辅助功能物；(3)将一种或多种辅助病毒和/或附属功能载体引tt入宿主细胞，其中辅助病毒和/或附属功能载体提供能在宿主细胞中tt支持重组AAV(“rAAV”)病毒粒子有效产生的附属功能物；以及(4)培tt养该宿主细胞来产生rAAV病毒粒子。AAV表达载体、AAV辅助构tt建体和辅助病毒或附属功能载体可使用标准转染技术同时或连续引tt入宿主细胞。tt
使用已知技术构建AAV表达载体来至少提供作为以转录方向操tt作性相连的组分的控制元件，所述元件包括转录起始区、感兴趣的ttDNA和转录终止区。选择在哺乳动物肌细胞中有功能的控制元件。tt包含操作性连接组分的所得构建体以功能性AAVITR序列为边界(5'tt和3')。tt
AAVITR区域的核苷酸序列是已知的。关于AAV-2序列，参见，tt例如Kotin,R.M.(1994)HumanGeneTherapy5:793-801；Berns,K.I.tt"ParvoviridaeandtheirReplication"inFundamentalVirology,第2版,tt(B.N.Fields和D.M.Knipe编著)。用于本发明载体中的AAVITR不tt需要有野生型核苷酸序列，并且是可以改变的，例如，通过核苷酸的tt插入、缺失或取代。另外，AAVITR可源自于几种AAV血清型中的tt任一种，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、ttAAV-7等。此外，AAV表达载体中侧接所选择的核苷酸序列的5'和tt3'ITR不一定是相同的或由相同的AAV血清型或分离株衍生，只要tt它们的功能是想要的，即允许由宿主细胞基因组或载体切除和挽救感tt兴趣的序列，并且当AAVRep基因产物存在于细胞中时允许整合ttttttDNA分子到受体细胞基因组中。ITR允许在Rep蛋白的适当混合物tt存在下复制载体序列。ITR还允许载体序列并入到衣壳中以生成AAVtt粒子。tt
为了产生rAAV病毒粒子，使用已知的技术，如通过转染将AAttV表达载体引入适合的宿主细胞中。许多转染技术一般在本领域中是tt已知的。参见，例如Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrottok等人(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSprittngHarborLaboratories,NewYork，Davis等人(1986)BasicMethottdsinMolecularBiology,Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene13:1tt97。特别适合的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等人(1973)Virttol.52:456-467)、直接微量注射到培养细胞中(Capecchi,M.R.(1980)ttCell22:479-488)、电穿孔(Shigekawa等人(1988)BioTechnigues6:tt742-751)、脂质体介导的基因转移(Mannino等人(1988)BioTechniquttes6:682-690)、脂质介导的转导(Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acattd.Sci.USA84:7413-7417)、以及使用高速微粒的核酸递送(Klein等tt人(1987)Nature327:70-73)。tt
出于本公开的目的，用于产生rAAV病毒粒子的适合的宿主细胞tt包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞、以及哺乳动物细胞，其可以或已tt被用作异源DNA分子的受体。该术语包括已被转染的原始细胞的后tt代。因此，用于产生rAAV病毒粒子的“宿主细胞”一般是指用外源性ttDNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293(容易例如以登记号ttATCCCRL1573获自美国典型培养物保藏中心)的细胞在许多实施方tt案中使用。具体来说，人细胞系293是用5型腺病毒DNA片段转化tt(Graham等人(1977)J.Gen.Virol.36:59)并且表达腺病毒E1a和E1btt基因(Aiello等人(1979)Virology94:460)的人胚肾细胞系。293细胞系tt是容易被转染的，并且提供特别便利的平台以在其中产生rAAV病毒tt粒子。tt
2.AAV辅助功能tt
包含上述AAV表达载体的宿主细胞必须有能力提供AAV辅助功tt能物，以便复制和使侧接有AAVITR的核苷酸序列衣壳化以产生ttrAAV病毒粒子。AAV辅助功能物通常是AAV-衍生的编码序列，该tt序列可被表达来提供AAV基因产物，进而对生产性AAV复制起反式tt作用。本文使用AAV辅助功能以补充AAV表达载体失去的必要的ttAAV功能。因此，AAV辅助功能物包括主要AAVORF(即rep和captt编码区域)中的一个或两个、或其功能同系物。在本公开的上下文中，ttcap功能物包括一种或多种突变的衣壳蛋白，其中至少一种衣壳蛋白tt含有至少一个如上所述的突变。tt
“AAVrep编码区域”是指本领域公认的编码复制蛋白Rep78、Reptt68、Rep52及Rep40的AAV基因组的区域。这些Rep表达产物已显tt示拥有多种功能，包括AAVDNA复制的起点的识别、结合和产生切tt口、DNA解旋酶活性和调节AAV(或其他异源)启动子转录。Rep表tt达产物共同需要用于复制AAV基因组。关于AAVrep编码区域的描tt述，参见，例如Muzyczka,N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol.andttImmunol.158:97-129；及Kotin,R.M.(1994)HumanGeneTherapytt5:793-801。AAVrep编码区域的适合的同系物包括人疱疹病毒tt6(HHV-6)rep基因，已知该基因也介导AAV-2DNA复制(Thomson等tt人(1994)Virology204:304-311)。tt
AAVcap蛋白包括VP1、VP2、及VP3，其中VP1、VP2、及VP3tt中的至少一个包含至少一个如上所述的突变。tt
AAV辅助功能物通过在AAV表达载体转染之前或同时用AAVtt辅助构建体转染宿主细胞被引入宿主细胞。AAV辅助构建体由此用tt于至少提供AAVrep和/或cap基因的瞬时表达以补充生产性AAV感tt染所必需的丢失的AAV功能物。AAV辅助构建体缺少AAVITR并tt且不能自我复制和包装。这些构建体可呈质粒、噬菌体、转位子、装tt配型质粒、病毒、或病毒粒子形式。已经描述编码Rep和Cap表达tt产物的许多AAV辅助构建体，如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45。tttttt参见，例如Samulski等人(1989)J.Virol.63:3822-3828；及McCartytt等人(1991)J.Virol.65:2936-2945。已经描述编码Rep和/或Cap表达tt产物的许多其他载体。参见，例如美国专利号5,139,941。tt
AAV表达载体和AAV辅助构建体都可被构建以含有一个或多个tt任选可选择标记。合适的标记包括当细胞在适当的选择性培养基中生tt长时，向使用包含可选择标记的核酸构建体转染的细胞赋予抗生素抗tt性或敏感性、赋予颜色或改变其抗原特征的基因。在本公开的实践方tt法中可用的几个可选择的标记基因包括潮霉素B抗性基因(编码氨基tt糖苷磷酸转移酶(APH))，通过赋予潮霉素抗性允许在哺乳动物细胞中tt进行选择；新霉素磷酸转移酶基因(编码新霉素磷酸转移酶)，通过赋tt予抗G418抗性允许在哺乳动物细胞中进行选择；等等。其他适合的tt标记为本领域技术人员所知。tt
3.AAV附属功能物tt
宿主细胞(或包装细胞)必须也是具有提供非AAV-衍生功能物或tt“附属功能物”的能力，以便产生rAAV病毒体。附属功能物是AAVtt复制所依赖的非AAV衍生的病毒和/或细胞功能物。因此，附属功能tt物包括至少AAV复制需要的那些非AAV蛋白和RNA，包括涉及以tt下过程的那些：AAV基因转录的活化、阶段特异性AAVmRNA剪接、ttAAVDNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳装配。基于病毒的tt附属功能物可源自于任何已知的辅助病毒。tt
具体来说，附属功能物可以通过本领域技术人员已知的方法引入tt并继而在宿主细胞中表达。附属功能物通常通过用无关的辅助病毒感tt染宿主细胞来提供。已知许多适合的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病tt毒如1型和2型单纯疱疹病毒；及牛痘病毒。本文还使用非病毒附属tt功能物，例如通过应用任何不同的已知试剂使细胞同步所提供的那tt些。参见，例如Buller等人(1981)J.Virol.40:241-247；McPhersontt等人(1985)Virology147:217-222；Schlehofer等人(1986)Virologytttttt152:110-117。tt
或者，附属功能物可使用附属功能载体来提供。附属功能载体包tt括提供一个或多个附属功能物的核苷酸序列。附属功能载体能够被引tt入适合的宿主细胞中以便支持在宿主细胞中有效产生AAV病毒粒tt子。附属功能载体可呈质粒、噬菌体、转位子、装配型质粒、或另一tt种病毒形式。附属载体的形式也可以是一种或多种线性化的DNA或ttRNA片段，当其与合适的控制元件或酶相连时，这些片段可在宿主tt细胞中转录或表达来提供附属功能物。tt
提供附属功能物的核酸序列可从天然来源处获得，如来自腺病毒tt粒子的基因组，或使用本领域中已知的重组或合成方法来构建。就此tt而言，已对腺病毒衍生的附属功能物进行广泛研究，并且附属功能物tt所涉及的许多腺病毒基因已得到鉴别并部分地表征。参见，例如Carter,ttB.J.(1990)"Adeno-AssociatedVirusHelperFunctions,"CRCHandbookttofParvoviruses,第I卷(P.Tijssen编著)及Muzyczka,N.(1992)Curr.ttTopics.Microbiol.andImmun.158:97-129。具体来说，早期腺病毒基tt因区域E1a、E2a、E4、VAIRNA及(可能地)E1b被认为参与附属过tt程。Janik等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1925-1929。已对tt疱疹病毒衍生的附属功能物进行了描述。参见，例如Young等人tt(1979)Prog.Med.Virol.25:113。还对牛痘病毒衍生的附属功能物进行tt了描述。参见，例如Carter,B.J.(1990),同上，Schlehofer等人(1986)ttVirology152:110-117。tt
作为用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能载体转染宿主细胞tt的结果，附属功能物表达反式激活AAV辅助构建体以产生AAVReptt和/或Cap蛋白。Rep表达产物从AAV表达载体上切除重组DNA(包tt括感兴趣的DNA，例如异源核酸)。Rep蛋白还用来复制AAV基因组。tt所表达的Cap蛋白装配成衣壳，并且重组AAV基因组被包装到衣壳tt中。因此，接着生产性AAV复制，并将DNA包装到rAAV病毒粒子tt中。tt
重组AAV复制后，可使用多种常规的纯化方法(如CsCl梯度)从tt宿主细胞中纯化rAAV病毒粒子。此外，如果用感染来表达附属功能，tt那么残余的辅助病毒可用已知方法灭活。例如，可通过加热至温度约tt60℃持续例如20分钟或更长时间使腺病毒失活。由于AAV是对热非tt常稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的，所以这样的处理仅对辅助病tt毒有效的灭活。tt
得到的rAAV病毒粒子然后可用于DNA递送(如用于基因疗法)tt或用于递送基因产物至哺乳动物宿主。tt
递送异源核酸tt
本公开还提供将异源核酸递送至靶细胞和/或需要其的个体的方tt法。在一些实施方案中，需要其的个体是先前已经天然地暴露于AAVtt且因此具有抗AAV抗体(即AAV中和抗体)的人。基于涉及向例如肝、tt肌肉、及视网膜(所有组织都受到针对此媒介物的中和抗体的影响)递tt送AAV基因的临床试验中的积极结果，存在许多这类治疗性应用/tt疾病靶标。tt
所述方法一般涉及：(i)施用有效量的所述rAAV病毒粒子至个体，tt和/或(ii)使靶细胞与所述病毒粒子接触。一般来说，使用体内(“直接”)tt或体外(“间接”)转导技术向受试者施用rAAV病毒粒子。如果在体外tt(“间接”)转导，那么可将所需的受体细胞(即“靶细胞”)从个体中除去，tt用rAAV病毒粒子转导并且再引入到个体中。或者，可使用同基因或tt异基因细胞，其中那些细胞不会在个体中产生不恰当的免疫应答。tt
已经描述适用于递送和引入所转导的靶细胞到个体中的方法。例tt如，可通过在合适的培养基中使重组AAV病毒粒子与细胞结合，并tt使用常规技术，如DNA印迹和/或PCR，或通过使用可选择的标记来tt筛选具有感兴趣的DNA的那些细胞来进行细胞体外转导。转导的细tt胞然后可被配制到药物组合物中，如下更充分地描述，并且组合物通tt过各种技术，如通过肌内、静脉内、皮下及腹膜内注射被引入受试者。tt
为进行体内(即“直接”)递送，rAAV病毒粒子可配制到药物组合tt物中并一般通过胃肠外(例如，通过肌内、皮下、肿瘤内、经皮、鞘tt内、静脉内等施用)途径施用。tt
药物组合物将包含足够量的遗传物质来产生治疗有效量的感兴tt趣的基因表达产物，即其量足以减轻或缓解所讨论的疾病状态的症状tt或足以带来所需的益处。药物组合物还含有药学上可接受的赋形剂。tt所述赋形剂包括任何这样的药剂，所述药剂本身不诱导产生对接受所tt述组合物的个体有害抗体，并且施用时没有不适当的毒性。药学上可tt接受的赋形剂包括但不限于液体如水、盐水、甘油及乙醇。药学上可tt接受的盐也可包括在内，例如，无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷tt酸盐、硫酸盐等等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、tt苯甲酸盐等等。此外，这类媒介物中还可能存在辅助性物质，如润湿tt剂或乳化剂、pH缓冲物质等。广泛多种药学上可接受的赋形剂在本tt领域中是已知的并且不必在本文中详述。药学上可接受的赋形剂已经tt充分地在多个出版物中描述，包括，例如A.Gennaro(2000)tt“Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,”第20版,ttLippincott,Williams,&Wilkins；PharmaceuticalDosageFormsandDrugttDeliverySystems(1999)H.C.Ansel等人编著,第7版,Lippincott,ttWilliams,&Wilkins；及HandbookofPharmaceuticalExcipients(2000)ttA.H.Kibbe等人编著,第3版Amer.PharmaceuticalAssoc。tt
适当的剂量将取决于除了其他因素之外所治疗的哺乳动物(例tt如，人或非人灵长类动物或其他哺乳动物)、有待治疗的受试者的年tt龄和一般状况、所治疗病状的严重性、所讨论的具体治疗性蛋白质、tt其施用方式。适当的有效量可容易由本领域技术人员确定。tt
因此，“治疗有效量”将落入相对较宽的范围，该范围可通过临床tt试验确定。例如，为进行体内注射(即直接注射至骨骼肌或心肌)，治tt疗有效剂量将大约为约106至约1015个rAAV病毒粒子，例如约108至1012个rAAV病毒粒子。为进行体外转导，有待递送到细胞的rAAVtttttt病毒粒子的有效量大约为约108至约1013个rAAV病毒粒子。本领域tt的普通技术人员可通过建立剂量反应曲线的常规试验来容易地确定tt其他有效剂量。tt
剂量治疗可以是单剂量方案或多次剂量方案。此外，受试者可适tt当地施用多次剂量。本领域技术人员容易确定适当的剂量数目。tt
当术语感兴趣的细胞(即“靶细胞”)是指分类为哺乳动物的任何动tt物，包括人、家畜和农畜、以及动物园动物、实验室动物、运动或宠tt物动物，如狗、马、猫、奶牛、小鼠、大鼠、兔等时，感兴趣的细胞tt通常是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。tt
感兴趣的靶细胞包括易受所述rAAV病毒粒子感染的任何细胞。tt在一些情况下，例如，当所述方法是向靶细胞递送异源核酸的方法时，tt靶细胞可以是从个体中除去的细胞(例如，“原代”细胞)，或靶细胞可tt以是组织培养细胞(例如，来自已建立的细胞系)。tt
示例性靶细胞包括但不限于肝细胞、胰腺细胞(例如，胰岛细胞：ttα细胞、β细胞、δ细胞、γ细胞和/或ε细胞)、骨骼肌细胞、心肌细tt胞、成纤维细胞、视网膜细胞、滑膜关节细胞、肺细胞、T细胞、神tt经元、神经胶质细胞、干细胞、造血祖细胞、神经祖细胞、内皮细胞、tt以及癌细胞。示例性干细胞靶细胞包括但不限于造血干细胞、神经干tt细胞、神经嵴干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、tt间充质干细胞、中胚层干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、肌肉干细tt胞、以及视网膜干细胞。tt
文中使用的术语“干细胞”是指能自我更新并产生分化后代的哺tt乳动物细胞(参见，例如Morrison等人(1997)Cell88:287-298)。干细tt胞通常也具有以下一种或多种性质：进行非同步或对称性复制的能tt力，如此分裂后产生的两个子细胞可具有不同的表型；广泛的自我更tt新能力；以有丝分裂静止形式存在的能力；以及其存在的所有组织中tt无性再生能力，例如造血干细胞重建所有造血谱系的能力。如本领域tttttt的普通技术人员所理解，“祖细胞”与干细胞的区别在于它们通常不具tt有广泛的自我更新能力并且经常可在它们所衍生的组织中产生谱系tt的更受限制的亚群，例如仅能产生造血系统中的淋巴谱系或红细胞谱tt系。如本文所用，术语“干细胞”包括如上所定义的“干细胞”和“祖细tt胞”两者。tt
干细胞的特征是存在与用抗体鉴定的特异性表位结合的标记，并tt且不存在通过缺乏与特异性抗体的结合而鉴定的某些标记。干细胞也tt可通过体外和体内的功能性测定来鉴定，特别是涉及干细胞产生多重tt分化后代能力的测定。tt
感兴趣的适合的干细胞包括但不限于：造血干细胞和由此衍生的tt祖细胞(美国专利号5,061,620)；神经嵴干细胞(参见Morrison等人tt(1999)Cell96:737-749)；神经干细胞和神经祖细胞；胚胎干细胞；间tt充质干细胞；中胚层干细胞；肝脏干细胞、肌肉干细胞、视网膜干细tt胞、诱导的多能干细胞(iPS细胞)等。感兴趣的其他造血“祖”细胞包tt括属于淋巴细胞系的细胞，例如，未成熟的T细胞和B细胞群。tt
可使用干细胞或祖细胞的纯化群。例如，人造血干细胞可使用对ttCD34、thy-1有特异性的抗体来阳性选择；或者使用可包括血型糖蛋tt白A、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD36、CD2、ttCD19、CD56、CD66a、以及CD66b的谱系特异性标记、T细胞特异tt性标记、肿瘤/癌症特异性标记等来阴性选择。适用于分离中胚层干tt细胞的标记包括：FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、ttHSA、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1等等。神经嵴干细胞可使用对tt低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)有特异性抗体来阳性选择，和使tt用标记硫苷脂、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘蛋白Po、外tt周蛋白和神经丝来阴性选择。人间充质干细胞可使用标记SH2、SH3tt及SH4来阳性地分离。tt
所采用的靶细胞可以是新鲜的、冷冻的、或已经历先前培养。它tttttt们可以是胎儿、婴儿、成人。造血干细胞可得自胎儿肝脏、骨髓、血tt液、特别是G-CSF或GM-CSF动员的外周血或任何其他常规来源。tt使干细胞与造血谱系的其他细胞或其他谱系分离的方式对本公开而tt言不重要。如上所述，基本上同源的干细胞群或祖细胞群可通过选择tt性分离这样的细胞来获得，这些细胞不存在与分化细胞相关的标记但tt显示与干细胞相关的表位特征。tt
可递送给个体的核酸包括任何以上所定义的异源核酸。可使用所tt述方法递送的蛋白还包括上述蛋白中的任一种的功能性片段；及上述tt蛋白中的任一种的功能性变体。tt
在一些实施方案中，蛋白质的治疗有效量是在哺乳动物宿主中产tt生。使用所述方法是否在哺乳动物宿主中产生具体蛋白质的治疗有效tt量使用适合于具体蛋白质的测定来容易地确定。例如，当该蛋白质是ttEPO时，那么测量血细胞比容。tt
当rAAV编码抗原蛋白时，可使用所述方法递送至个体的合适的tt抗原蛋白包括但不限于：肿瘤/癌症相关抗原、自身抗原(“自体”抗原)、tt病毒抗原、细菌抗原、原虫抗原和过敏原；及其抗原片段。在一些实tt施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应tt答将在哺乳动物宿主中诱导。在其他实施方案中，对编码rAAV的抗tt原蛋白的体液应答将在哺乳动物宿主中诱导，以使得生成对抗原蛋白tt有特异性的抗体。在许多实施方案中，对编码rAAV的抗原蛋白的ttTH1免疫应答将在哺乳动物宿主中诱导。使用建立好的方法可容易地tt确定针对抗原蛋白的免疫应答是否产生。例如，酶联免疫吸附测定可tt用于确定针对抗原蛋白的抗体是否产生。检测抗原特异性CTL的方tt法在本领域中是公知的。例如，可利用在其表面表达该抗原蛋白的含tt有可检测标记的靶细胞来测定血液样品中抗原特异性CTL的存在。tt
治疗有效量的异源核酸(例如，编码多肽的核酸、RNAi试剂等)tt是否可使用所述方法递送至哺乳动物宿主可使用任何合适的测定来tttttt容易地确定。例如，当基因产物是抑制HIV的RNAi试剂时，可测tt量病毒负荷量。tt
生成和鉴定修饰的rAAV病毒粒子的方法tt
本公开提供一种生成和鉴别修饰的感染性重组腺相关病毒tt(rAAV)病毒粒子的方法，所述病毒粒子包含变体衣壳蛋白，该蛋白含tt有具有至少一个与起始AAV衣壳蛋白相比的氨基酸取代(包括缺失、tt插入等)的氨基酸序列。起始AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10-13tt及26-33的一个中列出的氨基酸序列。tt
所述方法一般涉及生成突变的rAAV病毒粒子文库；以及选择相tt对于起始rAAV病毒粒子具有改变的性质的修饰的rAAV病毒粒子的tt文库。起始rAAV病毒粒子包含含有在SEQIDNO:10-13及26-33的tt一个中列出的氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白。本公开还提供文库tt及包含所述文库的组合物。tt
在一些实施方案中，重复给定的选择步骤两次、三次、四次或更tt多次以就改变的病毒粒子性质富集所述AAV文库。在一些实施方案tt中，在AAV文库的选择之后，对个别克隆进行分离和测序。tt
突变AAV文库的生成
生成包含一个或多个相对于起始AAVcap基因的突变的突变ttAAV文库。起始cap基因是含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序tt列的cap，所述变体AAV衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10-13及26-33tt的一个中列出的氨基酸序列。使用任何已知的方法生成在rAAVcaptt基因中的突变。合适的诱变起始AAVcap基因的方法包括但不限于tt基于聚合酶链式反应(PCR)的方法、寡核苷酸定点诱变、饱和诱变、tt环交换诱变、片段改组诱变(即DNA改组)等。用于生成突变的方法tt在本领域中充分描述。参见，例如Zhao等人NatBiotechnol.1998ttMar；16(3):234-5；Koerber等人；MolTher.2008Oct；16(10):1703-9；ttttttKoerber等人；MolTher.2009Dec；17(12):2088-95；美国专利号tt6,579,678；美国专利号6,573,098；以及美国专利号6,582,914；所有tt这些文献出于其关于诱变的教导以引用的方式在此并入。tt
在一些实施方案中，包含在cap基因中的突变的突变AAV文库tt将使用交错延伸方法生成。交错延伸方法涉及使用基于PCR的方法tt的cap基因扩增。使用特异性PCR引物引发模板cap基因，然后重tt复多轮变性和极短时间退火/聚合酶催化的延伸。在每轮中，生长的tt片段基于序列互补性与不同模板退火并且进一步延伸。重复多轮变tt性、退火和延伸直至形成全长序列。相比于野生型AAVcap基因，tt得到的全长序列在cap基因中包括至少一个突变。tt
使包含包括一个或多个突变的AAVcap序列的PCR产物插入野tt生型AAV基因组的质粒。结果是AAVcap突变的文库。因此，本公tt开提供一种突变的AAVcap基因文库，其包含约10至约1010个成员tt并且在AAVcap基因中包含突变。文库中给定的成员在AAVcap基tt因中具有约1个至约50个突变。所述文库包含10至约109个不同的tt成员，各自在AAVcap基因中具有不同的突变。tt
一旦生成cap突变文库，便产生可基于改变的衣壳性质选择的病tt毒粒子。文库质粒DNA被转染到适合的宿主细胞(例如293细胞)中，tt然后引入到辅助病毒细胞中。收集由转染的宿主细胞产生的病毒粒子tt(rAAV文库粒子)。tt
文库选择
一旦生成文库，便就具体的病毒粒子性质(即，改变的感染性质)tt进行选择。病毒粒子如以上所论述地产生(由此产生修饰的rAAV病tt毒粒子的文库)，并且经受一个或多个选择步骤以鉴定具有改变的感tt染性质的修饰的rAAV病毒粒子(相对于包含变体衣壳蛋白的感染性ttrAAV病毒粒子，所述变体衣壳蛋白包含在SEQIDNO:10-13及26-33tt的一个中列出的氨基酸序列)。选择所针对的感染性质可包括但不限tttttt于：1)与AAV中和抗体的结合改变(例如，结合减弱)；2)AAV中和tt抗体的逃避增加；3)对AAV感染有抗性的细胞的感染性提高；以及tt4)肝素结合的改变。tt
1.就与AAV中和抗体减少的结合进行选择tt
在一些实施方案中，就与这类抗体与野生型AAV病毒粒子的结tt合及野生型AAV病毒粒子的中和(或相对于包含含有在SEQIDNO:tt10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性ttrAAV病毒粒子)相比与结合至并中和野生型AAV病毒粒子的中和抗tt体的改变(例如减少)的结合对所述AAV文库进行选择。使AAV文库tt粒子(AAV文库病毒粒子)与中和抗体接触并且测试AAV文库粒子感tt染容许宿主细胞的能力。通常，AAV文库粒子与各种浓度的中和抗tt体接触。降低AAV文库粒子感染性所需的中和抗体浓度越高，AAVtt粒子对中和的抗性越大。本领域的普通技术人员已知的任何便利的测tt定都可用于直接测量AAV文库病毒粒子与中和抗AAV抗体的结合tt(例如，测量结合亲和力)。tt
2.就AAV中和抗体逃避的增加进行选择tt
在一些实施方案中，就中和抗体相对于包含含有在SEQIDNO:tt10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感染性ttrAAV中和抗体的逃避增加(即对人中和AAV抗体的抗性提高)对所述ttAAV文库进行选择。使AAV文库粒子在中和AAV抗体(通常是人中tt和抗AAV抗体)存在下与靶细胞接触。用AAV文库粒子感染细胞合tt适的时间量后，加入辅助病毒，并且收集成功感染细胞的AAV文库tt粒子。在一些实施方案中，测量展现成功感染的那些病毒粒子的感染tt性(例如如上所述)。在一些实施方案中，重复感染循环、辅助病毒的tt添加、以及AAV粒子的收获一次、两次、三次或更多次。选择可随tt着中和AAV抗体的变化量(浓度)而发生以就各种程度的逃避进行选tt择(例如，每个重复轮次都可利用相对于前一轮增加浓度的抗体)。tt
3.就非容许细胞的提高的感染性进行选择tt
在一些实施方案中，就非容许细胞(相对于包含含有在SEQIDttNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的感tt染性rAAV病毒粒子)的感染性增加对所述AAV文库进行选择。使ttAAV文库粒子与非容许细胞(例如，非容许细胞群)接触。用AAV文tt库粒子感染细胞合适的时间量后，加入辅助病毒，并且收集成功感染tt非容许细胞的AAV文库粒子。在一些实施方案中，重复感染循环、tt辅助病毒的添加、以及AAV粒子的收获一次、两次、三次或更多次。tt
4.就改变的肝素结合进行选择tt
在一些实施方案中，就改变的肝素结合对所述文库进行选择，包tt括相对于野生型AAV病毒粒子肝素结合(或相对于包含含有在SEQttIDNO:10-13及26-33的一个中列出的氨基酸序列的变体衣壳蛋白的tt感染性rAAV病毒粒子)的增加的肝素结合及减少的肝素结合。使AAVtt文库粒子与肝素亲和基质接触。例如，在容许AAV文库粒子结合至tt肝素的条件下将AAV文库粒子加到肝素亲和层析柱上。示例性条件tt包括用0.15MNaCl和50mMTris在pH7.5下平衡柱。在允许AAVtt文库粒子与肝素亲和基质结合后，用几体积的缓冲液洗涤AAV文库tt粒子/肝素亲和基质复合物，所述缓冲液含有浓度渐增的NaCl并且收tt集在每个NaCl浓度处洗脱的AAV文库粒子。例如，AAV文库粒子tt与肝素亲和基质复合物结合后，用含有200mMNaCl的1体积50mMttTris缓冲液pH7.5洗涤AAV文库粒子/肝素亲和基质复合物，并且收tt集洗脱的AAV文库粒子。洗脱步骤是用含有以下的50mMTris缓冲tt液pH7.5重复进行：约250mMNaCl、约300mMNaCl、约350mM、tt约400mMNaCl、约450mMNaCl、约500mMNaCl、约550mMNaCl、tt约600mMNaCl、约650mMNaCl、约700mMNaCl、或约750mMttNaCl。tt
在小于约450mMNaCl的NaCl浓度下洗脱的AAV文库粒子相tttttt对于野生型AAV展现减弱的肝素结合性质。在大于约550mMNaCltt的NaCl浓度下洗脱的AAV文库粒子相对于野生型AAV展现增强的tt肝素结合性质。tt
在一些实施方案中，洗脱的AAV文库粒子通过容许细胞与辅助tt病毒的协同感染来扩增，并且在肝素亲和基质上再分级。此步骤可重tt复许多次以便富集具有改变的肝素结合性质的AAV文库粒子。tt
在本方法中，一个或多个选择步骤可在AAV文库粒子生成之后。tt例如，在一些实施方案中，所述方法包括选择肝素结合增加，然后选tt择与中和抗体的结合减少的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法tt包括选择与中和抗体的结合减少，然后选择肝素结合增加的病毒粒tt子。在其他实施方案中，所述方法包括选择肝素结合减少，然后选择tt与中和抗体的结合减少的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包tt括选择与中和抗体的结合减少，然后选择肝素结合减少的病毒粒子。tt在其他实施方案中，所述方法包括选择与中和抗体的结合减少，然后tt选择干细胞感染性提高的病毒粒子。在其他实施方案中，所述方法包tt括选择与中和抗体的结合减少，然后选择中和抗体的逃避增加的病毒tt粒子。在其他实施方案中，所述方法包括选择中和抗体的逃避增加，tt然后选择与中和抗体的结合减少的病毒粒子。tt
因此，本公开提供一种包含多个核酸的腺相关病毒(AAV)文库，tt所述核酸各自包含编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。所编码的tt变体AAV衣壳蛋白包含至少一个相对于在SEQIDNO:10-13及tt26-33的一个中列出的序列的氨基酸取代。本公开提供一种突变腺相tt关病毒(AAV)粒子的文库，包括多个AAV粒子，其各自包括AAV衣tt壳蛋白，所述衣壳蛋白包含至少一个相对于在SEQIDNO:10-13及tt26-33的一个中列出的序列的氨基酸取代。编码突变AAV衣壳蛋白的tt核酸如上所述，所编码的突变AAV衣壳蛋白的性质也一样。tt
本公开还提供一种包含以下至少一个的文库：(i)两个或更多个感tttttt染性rAAV病毒粒子，各自包含变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白及异tt源核酸；(ii)两个或更多个分离的核酸，各自包含编码变体AAV衣壳tt蛋白的核苷酸序列；(iii)两个或更多个宿主细胞，各自包含含有编码tt变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸；以及(iv)两个或更多个变体ttAAV衣壳蛋白；其中文库的至少一个成员的变体AAV衣壳蛋白包含tt具有至少一个相对于在SEQIDNO:10-13及26-33的一个中列出的氨tt基酸序列的氨基酸取代的氨基酸序列。tt
组合物和试剂盒tt
还提供供本公开的方法中使用的组合物和试剂盒。所述组合物和tt试剂盒包括以下至少一个：所述感染性rAAV病毒粒子、所述rAAVtt载体、包含编码所述变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的所述核苷酸、tt包含所述核酸(即，包含含有编码所述变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序tt列的核酸的所述遗传修饰的宿主细胞)的分离的宿主细胞；所述文库tt(例如，任何上述文库)；以及所述变体AAV衣壳蛋白。组合物或试tt剂盒可包括以上的任何适宜组合。组合物或试剂盒还可包括辅助病毒tt和/或包含编码辅助病毒的核苷酸序列的核酸。试剂盒还可包括用于tt生成编码修饰的变体AAV衣壳蛋白的核酸(即“突变”核酸)的试剂。tt
除以上组分之外，所述试剂盒还可包括(在某些实施方案中)实践tt所述方法的说明。这些说明可以多种形式存在于所述试剂盒中，其中tt一个或多个可存在于试剂盒中。这些说明可呈现的一种形式是在适合tt的介质或基质上的印刷信息，例如，印刷有信息的一张或多张纸，在tt试剂盒的包装中、在包装说明书中等等。这些说明的另一种形式是其tt上记录有信息的计算机可读介质，例如，磁盘、高密度磁盘(CD)、闪tt存驱动器等等。可提供的又一种形式的这些说明是网站地址，可以利tt用该地址通过互联网从该站点远处读取所述信息。tt
现在已经对本发明作了充分的说明，本领域技术人员显而易见，tt可以在不偏离本发明的精神或范围的情况下作出许多改变和修改。tt
实施例tt
进行以下实施例以便为本领域普通技术人员提供关于如何实施tt和使用本发明的完整公开和描述，而非意图限定本发明人所认为的本tt发明的范围，也非意图将下面的实验作为所进行的所有或仅有的实tt验。已经努力确保所用数值(例如，量、温度等)的精确性，但是应说tt明某些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重量tt平均分子量，温度是摄氏温度，且压力为大气压或接近大气压。可使tt用以下标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；ml，毫升；μl，tt微升；nl，纳升；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；ttaa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；tti.p.，腹膜内；s.c.，皮下；i.v.，静脉内；等等。tt
实施例1：
腺相关病毒(AAV)基因疗法载体迄今为止在若干临床试验中已tt显示出相当不错的前景。然而，由儿童期暴露或在施用AAV载体之tt前产生的循环抗AAV抗体阻止AAV基因疗法推广用于许多潜在患tt者。已经分离了新型AAV变体，其能够在体外和体内增加抗AAV抗tt体逃避。由使用低和高效力人血清池和人IVIG的选择产生的严格压tt力进化AAV变体，其能够实现来自个体人血清、人IVIG、及小鼠血tt清的中和抗体的逃避，迄今为止最广泛的逃避性变体。tt
材料和方法tt
细胞系tt
将细胞系在37℃和5％CO2下培养，并且除非另作说明，否则是tt从美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)处获得。将HEK293T、ttHeLa、和HT1080细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco,Carlsbad,CA)tt和1％青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的达尔伯克改良伊格尔tt培养基中培养。将CHOK1和CHOpgsA细胞在补充有10％胎牛血清tttttt(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的F-12K培养基(ATCC)中培tt养。将Pro5和Lec1细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/tt链霉素(Invitrogen)的MEM-α培养基(Gibco)中培养。tt
用于选择的人血清池tt
18份个体人血清样品是从InnovativeResearch,Inc.(Southfield,ttMI)处获得并且测定每份样品的野生型AAV2的中和抗体滴度(表2)。tt由于个体样品可能在抗体的亲和力和表位特异性两方面具有变化，所tt以通过混合相等体积的个体血清样品产生三个有效的血清池(α＝A+ttF+G，β＝B+H+M，且γ＝I+J+N)。在抗体的这些变化存在下的tt选择将会对许多预先存在的人抗体产生普遍提高的抗性。在ttGamimuneN、10％人IVIG(Bayer,ElkhartIN)存在下进行后来的选择tt以选择对甚至更宽范围的抗体的抗性。tt
表2：个体人血清样品的中和抗体滴度tt
每份样品的中和抗体(NAb)滴度被报道为降低感染性至在血清不tt存在下所测量的值的37％所必需的血清体积分数的倒数。然后通过混tt合等体积数量的三份个体血清样品产生三个血清池(α＝A+F+G，βtt＝B+H+M，且γ＝I+J+N)。tt
表2tt
文库生成及病毒产生tt
为了生成饱和诱变文库，AAV2cap文库是分别使用5’-GCGGAttAGCTTCGATCAACTACGC-3’(SEQIDNO:14)和5’-GGGGCGGCttCGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTG-3’(SEQIDNO:tt15)作为正向和反向引物，通过易错PCR，接着是由Zhao等人所述tt的交错延伸方法而产生。使用汇集的个体人血清的选择显示含有四个tt点突变的变体(在结果部分中描述)，它们充当饱和诱变文库的基础。tt此变体的cap基因通过改变特异性位点处的氨基酸经受进一步诱变。tt引物5’-cattNNKgaccagtctaggaactgg-3’(SEQIDNO:16)和相应的反tt向互补引物被用于诱变R471氨基酸位点。引物5’-gccacaaggacgatgaattgaaNNKttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcaNNKaaaacaagtgtggttacattg-3’(SEQIDNO:17)和相应的反向互补引物被用于诱变K532tt和E548氨基酸位点。引物5’-ccaacctccagagaggcNNKagacaagcagctacc-tt3’(SEQIDNO:18)和相应的反向互补引物被用于诱变N587氨基酸tt位点。引物5’-ccaactacaacaagtctNNKaatgtggactttactgtggacNNKaatggcgtttgtatt-3’(SEQIDNO:19)和相应的反向互补引物被用于诱变V708和ttT716氨基酸位点。由含有随机化的cap环区域的AAV2组成的文库tt和含有来自野生型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、ttAAV9cap基因的改组DNA的文库被包装和汇集用于初始选择步骤tt(Koerber等人；MolTher.2008Oct；16(10):1703-9；及Koerber等人；ttMolTher.2009Dec；17(12):2088-95；两篇文献都以引用的方式在此tt整体并入)。tt
为了进行第二轮和第三轮进化，随机诱变文库分别使用5’-CATttGGGAAAGGTGCCAGACG-3’(SEQIDNO:20)和5’-ACCATCGGCttAGCCATACCTG-3’(SEQIDNO:21)作为正向和反向引物通过使来tt自环交换/改组文库和饱和诱变文库的cap基因经受易错PCR而产生，tt如先前所描述。使用HEK293T细胞(ATCC)，使用磷酸钙转染方法包tt装有复制能力的AAV文库和在CMV启动子控制下表达GFP的重组ttAAV载体，并且通过威视派克(iodixonal)梯度离心纯化病毒。在CMttttttV启动子控制下表达GFP或荧光素酶的重组AAV载体(供体内使用)tt通过Amicon过滤进一步纯化。DNA酶抗性基因组滴度经由定量PCttR来测定。(Excoffon等人,ProcNatlAcadSciUSA.2009Mar1tt0；106(10):3865-70；及Maheshri等人,NatBiotechnol.2006Feb；24tt(2):198-204；两篇文献都以引用的方式在此整体并入)。tt
文库选择和进化tt
一轮选择被定义为使用AAV初始文库(对于汇集的个体人血清在tt室温下培养30分钟或在感染之前在37℃下用热灭活的IVIG培养1tt小时)的HEK293T细胞感染，然后是腺病毒挽救和收获成功的变体。tt每轮进化由为生成初始文库的cap基因诱变和三轮选择组成。用每个tt文库进行三轮进化，在每轮进化之间进行克隆分析。每轮进化的初始tt文库如上所述生成。在第三轮选择之后，将AAVcap基因从成功的ttAAV变体池中分离并且经由PCR扩增。使用NotI和HindIII将Captt基因插入pXX2重组AAV包装质粒中。然后在UniversityofCalifornia,ttBerkeleyDNA测序设备对Cap基因进行测序，并且使用Geneious软tt件(Biomatters,Auckland,NewZealand)来分析。AAV2衣壳(蛋白质数tt据库登记号1LP3)的三维模型是由Pymol(DeLanoScientific,SanttCarlos,CA)提供。tt
抗体逃避变体的体外转导分析tt
在感染之前24小时，将HEK293T以3×104个细胞/孔的密度接tt种。在感染之前，将变体在37℃下用热灭活的IVIG、个体人血清或tt个体小鼠血清培养1小时，然后用rAAV-GFP在2000的基因组MOItt下感染细胞。在感染后48小时使用ImageXpress显微细胞成像和分tt析系统(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)以及MetaXpress图像分析tt软件，3.1.0版，多波长细胞评分应用模块(MolecularDevices)对GFPtt阳性细胞百分比进行评定。tt
体外转导分析tt
为了测定相对转导效率，将与亲本野生型AAV血清型相比所选tt的突变HEK293T、CHOK1、CHOpgsA(缺少所有表面糖胺聚糖)、ttCHOPro5(几个糖基化突变的亲本系，包括Lec1细胞)、CHOLec1(糖tt基化缺陷性)、HeLa、以及HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞系)在感染之tt前24小时以2.5×104个细胞/孔的密度接种。用rAAV1-GFP、ttrAAV2-GFP、rAAV6-GFP、改组100.1-GFP、改组100.3-GFP、SMtt10.2-GFP、或改组100.7-GFP在100-1000的MOI范围下感染细胞。tt使用Beckman-CoulterCytomicsFC500流式细胞仪(Beckman-Coulter,ttBrea,CA)在感染后48小时对GFP阳性细胞百分比进行评定。tt
抗体逃避变体的体内分析tt
对于在体内的基因表达分析，在施用重组的改组100-3(参见SEQttIDNO:12)、SM10-2(参见SEQIDNO:10)、或AAV2载体之前24小tt时，经由尾静脉注射，用4mgIVIG/只小鼠或磷酸盐缓冲盐水(用于tt对照小鼠)引发八周龄的雌性Balb/c小鼠。经由尾静脉注射，用在CMVtt启动子控制下编码荧光素酶的重组AAV载体的1011病毒基因组感染tt小鼠。对于生物发光成像，用2％异氟烷和氧气麻醉小鼠。以500μg/gtt体重的剂量腹膜内注射D-荧光素底物(GOLDBiotechnology,St.Louis,ttMO)。使用VivoVisionIVISLumina成像器(Xenogen,Alameda,CA)产tt生图像。针对每只小鼠，在底物注射之后7-10分钟获取腹部图像，tt每周一次，持续4周。感染后五周，经由心脏穿刺收集血清且然后tt用.9％盐溶液灌注小鼠。收集心脏、肝脏、肺、肾、脾脏、脑、脊髓tt及后肢并且冷冻。将冷冻的组织样品匀浆化并且再悬浮于报道基因裂tt解缓冲液(Promega,Mannheim,Germany)中用于体外荧光素酶分析。tt含有荧光素酶的裂解物通过在10,000g下离心10分钟来澄清。为了tt测定样品，将20μL裂解物添加至100μL荧光素酶测定缓冲液中，tt混合，培养5分钟，并且置于光度计中。以2秒延迟对信号进行积分tt30秒并以由TD20/20光度计(TurnerDesigns,Sunnyvale,CA)检测的tt相对光度单位(RLU)来报道。将荧光素酶信号对由双金鸡纳酸测定tt(Pierce)所确定的总蛋白质含量标准化。tt
结果tt
结果表明AAV可进化以通过抗AAV抗体在体外和体内显著克服tt中和。在体外分离与野生型AAV相比需要2至35倍更高的中和抗体tt滴度(使用人IVIG)的新型AAV变体。抗体中和性质还被解释为在中tt和抗体存在下在体内增强的转导。对抗AAV抗体有抗性的这类新型tt克隆的分离允许更广泛的推行基于AAV作为核酸递送载体的治疗(包tt括目前不适用AAV基因疗法的具有高抗体滴度的个体)。tt
AAV文库生成和通过定向进化的选择tt
图1a示出用于分离能够逃避人抗体中和的新型AAV变体的定向tt进化手段的示意图。使用在以下段落中描述的DNA诱变技术生成病tt毒文库(图1a，步骤1和2)。在初始选择期间，在HEK293T细胞感tt染之前，在室温下将由易错PCR突变成AAV2cap基因开发的病毒文tt库池用低效α人血清池的各种稀释液培养30分钟(步骤3)。在针对低tt效α人血清池的三轮选择(图1a，步骤4和5)之后，获得对此中和血tt清池具有提高的抗性的几个变体(图1a，步骤6，图7a)。变体1.45tt含有两个点突变(N312K、N449D)，从而得到与野生型AAV2相比>10tt倍的对α池的中和的抗性。tt
来自变体1.45的cap基因经受另外的随机诱变且就平行针对βtt和γ池的另外三轮选择对得到的文库进行选择。因为仅在抗体逃避方tt面观察到微小的改善(数据未示出)，所以将回收的cap基因汇集并经tt受经由DNA改组和EPPCR的另外的多样化。针对增加量的来自βtt和γ池两者的血清的又三轮选择产生与野生型AAV2相比在从病毒文tt库回收的病毒量上的显著富集(图7b、c)。来自两个池的成功的captt基因的测序显示几个低频突变体和单一显性突变体，变体γ4.3，其含tt有四个点突变(N312K、N449D、N551S、及I698V)，存在于两个文库tt内。在人IVIG存在下，变体1.45显示对中和的抗性适度1.2倍的提tt高，而γ4.3显示对中和的抗性3.1倍的提高(图7d)。此观察结果证实tttttt以下假设：个体人血清池可用于分离能够具有一般人群中存在的抗体tt的提高逃避的AAV变体。tt
变体γ4.3在抵抗由抗AAV抗体的中和方面的一定成功促进了基tt于γ4.3cap基因的文库的发展。先前被确定为AAV2衣壳上的免疫原tt性位点的氨基酸位点R471、K532、E548、N587、V708、T716经受tt饱和诱变，以试图发现可改善γ4.3的抗体抗性的氨基酸突变。此“饱tt和诱变”文库，连同由7个亲代AAV血清型的随机cap嵌合体组成的tt“改组”文库和由具有取代的环区域的AAV2cap组成的“环交换”文库tt一起经受另外三轮选择，其中在HEK293T细胞的感染之前，在37℃tt下用人IVIG的各种稀释液培养病毒文库池1小时。在用AAV文库感tt染和经由腺病毒超感染扩增感染性AAV变体之后，对来自每个文库tt条件的病毒基因组数量或病毒滴度进行定量并且与野生型AAV2的tt滴度相比较作为用于确定选择成功的方法(图1b)。对于使用饱和诱变tt和环交换/改组文库的每轮选择，将与野生型AAV2相比产生更高病tt毒滴度的来自1:10和1:100IVIG稀释条件的病毒池用作后一轮选择tt的起始点。在三轮选择之后，对成功的病毒cap基因进行分离并且逐tt一测试以确定具有最高效的基因递送的病毒。另外，从第三轮选择分tt离的cap基因经受另外轮次的易错PCR诱变，并且重复所述过程以tt便反复提高病毒的适合度。tt
图1描绘就增加的抗体逃避对AAV的定向进化。(a)定向进化的tt示意图。1)通过使用若干互补途径使cap基因遗传多样化来生成病毒tt文库。2)病毒是使用质粒转染在HEK293T细胞中包装，然后收集并tt纯化。3)将病毒文库用在若干浓度下的人IVIG培养并且在体外引入ttHEK293T细胞中。4)扩增成功的病毒并且经由腺病毒超感染来回收。tt5)成功的克隆通过在降低的MOI下重复选择来富集。6)分离的病毒ttDNA显示成功的cap基因。7)成功的cap基因再次突变以用作用于选tt择的新的起始点。(b)从环交换/改组和饱和诱变文库选择抗体逃避突tt变体。HEK293T细胞用病毒文库感染24小时。高效地感染细胞的病tt毒粒子通过腺病毒感染扩增，并且挽救的AAV通过qPCR来定量。ttttttIVIG的1:10稀释液对应于10mgIVIG/mL的浓度。误差线表示标准tt偏差(n＝3)。tt
图7显示基于AAV2的人抗体逃避株的生成。(a)在针对低严格αtt池的三轮选择之后选出的四个病毒克隆显示在1的MOI下对1μLαtt血清的抗性提高。另外两轮多样化(即，诱变和DNA改组)和选择(3tt轮增加的血清量)引起在大量高效(b)β和(c)γ池存在下病毒回收的显tt著增加。(d)另外，两个病毒克隆(1.45和γ4.3)显示与野生型AAV2相tt比对预先存在的抗体的高度多样池的抗性提高1.23倍和3.10倍，所tt述抗体表现出从约100,000个个体汇集的人静脉内免疫球蛋白(IVIg)。tt
新型进化的AAV变体在体外增加的抗体逃避tt
在针对人IVIG的9轮筛选之后，在为来自饱和诱变和环交换/tt改组文库的单个分析所选出和包装的12个克隆中，所有十二个都需tt要比野生型AAV1和AAV2更高的中和抗体滴度(图2a和表1)。需要tt比野生型AAV2高35倍的针对中和的体外IVIG浓度的变体改组tt100-3(参见SEQIDNO:12)仍能够在1mg/mLIVIG存在下转导大约tt10％细胞(图2b)。另外，来自AAV2饱和诱变文库的变体SM10-2需tt要比野生型AAV2高7.5倍的针对中和的体外IVIG浓度。此外，变tt体改组100-3和SM10-2(参见SEQIDNO:10)示出在来自被排除在乙tt型血友病临床试验之外的单个患者的血清样品存在下增加的转导(图tt3)(Nathwani等人,NEnglJMed.2011Dec22；365(25):2357-65)。tt
图2描绘抗体躲避变体的中和曲线。在三轮进化之后分离的抗体tt躲避突变体的cap基因被用于包装编码GFP的重组AAV并且在ttHEK293T细胞的感染之前用人IVIG培养。剩余感染性粒子的分数使tt用高含量荧光成像来测定并且在IVIG不存在下对感染性滴度标准tt化。示出对IVIG具有抗性的每个文库的两个克隆。所分析的其他克tt隆的数据展现在表1中。(a)中和曲线。误差线表示标准偏差(n＝3)。tt(b)来自若干IVIG稀释液的代表性荧光图像显示突变体能够在高浓度tttttt的中和抗体存在下进行HEK293T转导。tt
图3描绘抗体躲避变体的中和曲线。从由于存在针对AAV的高tt中和抗体滴度而被排除在B型血友病临床试验之外的个体中获取人tt血清。在HEK293T细胞的感染之前将编码GFP的重组AAV用个体tt人血清培养。剩余感染性粒子的分数使用荧光显微术来测定并且在人tt血清不存在下对感染性滴度标准化。误差线表示标准偏差(n＝3)。tt
十二个克隆的序列分析显示具有最高中和抗体抗性的两个变体，tt改组100-3(参见SEQIDNO:12)和改组100-1(参见SEQIDNO:11)是tt含有AAV1-4、AAV6、及AAV9的片段的几乎相同的改组衣壳(图4)。tt在两个变体之间的氨基酸469(AAV6残基与AAV7残基)和598(AAV6tt残基与AAV1残基)的差异转化为对于改组100-3在中和抗体滴度方tt面几乎3倍的增加(参见SEQIDNO:12)(表1)。具有第四最高中和抗tt体抗性(表1)的变体改组100-7(参见SEQIDNO:13)也是含有AAV1、ttAAV6、及AAV8的片段的改组衣壳(图4)，其与显示野生型AAV1和ttAAV8在躲避抗AAV2抗体方面是有效的报道数据一致。有趣的是，tt变体SM10-2(参见SEQIDNO:10)保留由变体γ4.3获取的点突变并tt且还保留在饱和诱变位点处的野生型残基。变体SM10-2(参见SEQttIDNO:10)确实在表面残基D472N及内部残基L735Q处获取另外的tt点突变。tt
图4描绘环交换/改组及饱和诱变克隆的氨基酸序列。(a)衣壳蛋tt白示意图示出来自每个文库的具有最高中和IVIG浓度的两个克隆。tt每个区域根据其所源自的亲代血清型来以阴影示出。黑色箭头表示tt(从左至右)VP1、VP2、及VP3衣壳蛋白的起始密码子。灰色箭头表tt示(从左至右)基于AAV2衣壳的表面环区域I、II、III、IV、及V。(b)tt基于解出的结构的完整AAV2衣壳的分子模型示出来自每个文库的tt具有最高中和IVIG浓度的两个克隆。每个区域根据其所源自的亲代tt血清型来以阴影示出。对于变体改组100-3(参见SEQIDNO:12)，黑tt色箭头表示与变体改组100-1的差异(参见SEQIDNO:11)。对于变体ttttttSM10-2(参见SEQIDNO:10)，突变N449D、D472N、N551S、及I698Vtt是表面突变(黑色)。tt
表1：文库克隆和亲代血清型的IVIG中和抗体滴度人IVIG被tt用于中和的具有来自野生型AAV1、AAV2、AAV8、及从环交换/改组tt和饱和诱变文库中回收的变体的衣壳的重组AAV-GFP载体。示出降tt低基因递送效率至在IVIG不存在下的50％所需的IVIG浓度tt(mg/mL)，并且与减少AAV2递送所需的浓度比较。分析的所有变体tt都需要比野生型AAV1和AAV2更高的IVIG浓度。通过将图2中的tt曲线拟合至指数曲线来测定中和抗体滴度。SEQIDNO列为“氨基酸，tt核苷酸”。tt
表1tt
变体改组100-3(参见SEQIDNO:12)、改组100-1(参见SEQIDttNO:11)、及改组100-7(参见SEQIDNO:13)具有模拟亲代血清型ttttttAAV1和AAV6的转导曲线的转导曲线(图5)。另外，在SM10-2中tt的突变(参见SEQIDNO:10)不会阻止肝素依赖(如亲代血清型AAV2tt中所见)，从而产生类似于AAV2的曲线(图5)。tt
图5显示新型aav变体的体外向性。表达绿色荧光蛋白的重组ttAAV载体被用于转导一组细胞系：CHO、pgsA(缺少所有表面糖胺聚tt糖)、Pro5、Lec1(缺少唾液酸)、HEK293T、HeLa、及HT1080(人纤tt维肉瘤细胞系)以便概述新型AAV变体的转导性质。误差线表示标准tt偏差(n＝3)。tt
新型进化的AAV变体在体内增加的抗体逃避tt
为了确定变体改组100-3和改组100-7的定位模式，在用AAV2、tt改组100-3、或改组100-7注射的幼稚小鼠的各种组织中检查荧光素tt酶酶活性(图6a)。变体改组100-7呈现与AAV2相似的体内向性，但tt例外的是7倍更高的心脏转导、5倍更高的肺转导、以及4.5倍较低tt的肝转导。改组100-3变体展现与AAV2相比超过4倍更高的脑转导、tt超过3倍更高的肺转导、以及27倍更高的肌肉转导。来自这些小鼠tt的血清分析显示变体改组100-3与AAV1和AAV8相比对于来自给予ttAAV1、AAV2、AAV8或改组100-3基因递送载体的小鼠的血清来说tt需要等于或更高的用于中和的体外血清浓度(图11)。改组100-7与ttAAV1相比对于给予AAV1、AAV2、AAV8、改组100-3、或SM10-2tt基因递送载体的小鼠的血清来说需要等于或更高的用于中和的体外tt血清浓度(图11)。此外，两个变体与测试的所有野生型AAV血清型tt相比被来自给予AAV2基因递送载体的小鼠的血清中和得更少。有趣tt的是，变体改组100-3与测试的任何其他血清型或变体相比被针对其tt免疫的小鼠的血清中和得也更少(图11)。此数据说明这些变体可与野tt生型AAV血清型组合使用或在需要多个载体施用的应用中与其他变tt体组合使用。tt
图11示出在免疫的小鼠血清中文库克隆和亲代血清型的中和抗tttttt体滴度。来自施用了文库克隆或野生型AAV的小鼠的血清被用于中tt和具有来自野生型AAV1、AAV2、AAV8、以及从环交换/改组和饱和tt诱变文库中回收的变体的衣壳的重组AAV-GFP载体。示出降低基因tt递送效率至在血清不存在下的50％所需的血清稀释。tt
为了确定变体改组100-7和改组100-3在体内躲避抗体中和的能tt力，在AAV注射之前用人IVIG对小鼠进行被动免疫。变体改组100-7tt与AAV2相比具有显著更强的心脏、肝脏、以及肌肉转导，如通过荧tt光素酶酶活性来测量(图6b)。变体改组100-3与AAV2相比具有显著tt更高的心脏和肌肉转导(图6b)。tt
图6显示新型AAV变体的体内定位及中和。(a)经由尾静脉注射tt向雌性BALB/c小鼠施用编码荧光素酶的重组AAV载体。5周以后，tt对于所分析的每份样品，测定荧光素酶活性水平并且对总蛋白质进行tt标准化。(b)在尾静脉注射4mg人IVIG之后24小时，经由尾静脉注tt射向雌性BALB/c小鼠施用表达荧光素酶的重组AAV载体。5周以tt后，将荧光素酶表达水平对所分析的每份样品的总蛋白质进行标准tt化。误差线表示标准偏差(n＝3)，*＝p<0.05。RLU表示相对荧光素tt酶单位。tt
从针对个体人血清池选出的基于AAV2的易错文库分离的变体ttγ4.3含有四个点突变(N312K、N449D、N551S、以及I698V)。有趣的tt是，这些位置中的两个(N449和N551)先前使用其他人血清池被鉴定tt为免疫原性残基，表明涉及这些位点的抗原表位是由许多不同的中和tt抗体所靶向的。因此，这些位点是感兴趣和有价值的突变的靶标。在tt饱和诱变文库中成对的定向进化和合理设计导致变体SM10-2的分tt离，所述变体在体外能够具有比AAV1和AAV2两者更高的抗体抗性。tt变体SM10-2将另外两个点突变(D472N和L735Q)并入在变体γ4.3tt上所见的那些中。先前显示D472N突变提高在HEK293细胞中衣壳tt的合成水平。类似地，用不带电的谷氨酰胺侧链置换氨基酸位置735tt处带正电的赖氨酸侧链可起到使衣壳稳定化的作用，其也可存在于变tttttt体改组100-7中，但位于装配衣壳的内部之中(图4)。tt
嵌合AAV衣壳的生成允许形成病毒变体的生成，所述病毒变体tt可合并来自多个AAV血清型的期望性质。虽然AAV8和AAV9也显tt示比AAV2对IVIG中和的抗性高得多，但对这些衣壳有特异性的氨tt基酸仅在选择期间分离的改组变体的表面上以小的间距存在(图4)。tt呈现更高效的体外抗体中和逃避的变体(改组100-3)呈现与其亲本血tt清型AAV1和AAV6相似的体外向性，但在比野生型血清型更高的感tt染速度下。在变体改组100-1与改组100-3之间的氨基酸469和598tt中的差异转化成对于改组100-3几乎3倍的中和抗体滴度增加。ttLochrie等人的研究报道由人血清和IVIG识别的免疫原性残基是不同tt的，表明不同的人可针对AAV衣壳上的不同的表位集合产生各种中tt和抗体并且从中和中的完全逃脱是不容易的(Lochrie等人,JVirol.tt2006Jan；80(2):821-34)。研究表明使用含有各种量和效力的抗AAV抗tt体的若干不同血清池的多轮定向进化的使用将导致新型AAV变体的tt分离，所述变体在多个抗AAV抗体池存在下在体外和在体内能够具tt有提高的细胞转导。tt
在动物和人中对AAV载体组分的适应性免疫应答经常阻止再施tt用相同血清型的AAV载体，使得需要多个载体施用的基因递送应用tt变得困难。使用来自用于生物分布研究中的小鼠的血清的体外中和测tt定显示，变体与野生型AAV相比被这些血清中和得更少(图11)，其tt可适用于其中必须再施用载体的基因疗法策略。例如，改组100-3不tt被来自用AAV2注射的小鼠的血清中和，且AAV2不被来自用改组tt100-3注射的小鼠的血清中和，提示此变体可与野生型AAV血清型组tt合使用或用于需要多个载体施用的应用中。总之，使用定向进化来分tt离新型AAV变体，所述变体在体外和体内具有减少的由源自于个体tt人患者、汇集的人血清、及小鼠血清的抗AAV抗体的中和。tt
尽管已参考其具体实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应tt理解，在不脱离本发明的实际精神和范围下，可以对本发明进行各种tttttt修改且用等价物替换。另外，可以进行很多修改，使特定的情形、材tt料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目标、精神和范围。所tt有这类修改意欲落入所附权利要求的范围内。tt
