一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法
技术领域tt
本发明属于生物制品技术领域，属于胎儿染色体非整倍体的无创产前检测范畴，涉及半tt导体测序法检测胎儿染色非整倍体21三体、18三体、13三体的文库DNA浓度的qPCR定量标准tt品及其制备方法。tt
背景技术tt
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色tt体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切关系。该类疾病的发病率随tt着孕妇年龄的增高而增高。据文献报道我国每年出生染色体异常的新生儿约10万人，在活婴tt儿中染色体异常者占0.3％，而其中21三体、18三体、13三体综合征是临床最常见和最易出tt现的染色体异常疾病。目前21三体、18三体、13三体综合征的治疗缺乏有效方法，因此普tt及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低出生缺陷的发生有着非常重要的意义，这有利tt于提高人口质量，实现优生优育。tt
利用高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法相比传统方法具有明显优势。tt该方法只需抽取母体外周血进行检测，可以避免传统的侵入性方法可能给孕妇和胎儿带来的危tt害；另外直接检测母亲和胎儿的DNA序列，相比于检测血清蛋白标志物和超声波检测，准确性tt和灵敏度以及可靠性都大大提高。因此，通过深度测序，能够对孕妇血浆微量胎儿游离DNA进tt行准确检测，可以克服传统检测方法因胎儿游离DNA含量过低而导致检测结果假阴性过高的缺tt点。胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)基于高通量测tt序原理，对这些胎儿游离DNA进行检测，利用生物信息学分析系统对检测结果进行分析，获得tt胎儿染色体数目的详细信息，实现对21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征进行快速的tt产前辅助诊断。通过半导体测序实验得到的DNA数据量(UniqueReads数)需达到3.5MReadstt(原始Reads需5M左右)才能对胎儿染色体非整倍体的症状进行明确判断。tt
目前半导体测序系统上对样品进行检测，每次实验可产出80M左右的Reads，理论每次实tt验可检测16个样品。但由于测序芯片中含有165M个微孔，需要的文库DNA分子量仅为108个ttDNA拷贝数，即10-15mol，如此低的浓度必定会造成16个样本很难等量均匀地混合，这将导致tt某些样本测序得到的数据量达不到要求而需要重新检测，这既浪费了成本，也拖延了检测时间。tt目前胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)每次建议检测tttttt12个样品，因此在保证每个样本DNA都能达到足够Reads数的前提下，增加单次实验的样品数tt量成为了必要。tt
现有胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文tt库浓度是用Qubit荧光法检测的，只有当DNA与荧光的Molecular染料结合后，才tt能发出荧光信号，因此该方法只检测靶分子(而不是污染物)的浓度，相对于传统的分光光度更准确，更精密。但Qubit检测方法在高通量基因测序过程同样有一定的缺陷，即tt检测范围为0.1ng/μL-10ng/μL，对于加入的108个DNA分子难以精确定量。因此最低可以检tt测到100个DNA分子拷贝的qPCR技术应用在高通量测序上无疑是非常必要的。利用DNAtt标准品建立标准曲线，得到文库DNA的拷贝数，再进行等量混合后上机测序。tt
目前，市场上该检测方法涉及的文库DNA浓度的qPCR定量标准品几乎没有，这严重影响tt染色体疾病的产前筛查和诊断过程的效率，增加了成本。为增加检验试剂盒在检测过程中的有tt效性，本发明以高通量测序技术用于孕妇血浆游离胎儿DNA的染色体非整倍体(T21、T18和ttT13)国家标准品为溯源，然后将人类基因组DNA打断成长度为160～200bp的DNA片段，利用tt该试剂盒进行文库制备，经Qubit2.0检测后稀释至一定浓度作为胎儿染色体非整倍体21三体、tt18三体和13三体检测试剂盒(半导体测序法)文库DNA浓度检测的qPCR定量标准品。tt
发明内容tt
本发明的目的是提供一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒(半tt导体测序法)文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法。tt
为了实现本发明目的，发明了一种胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试tt剂盒(半导体测序法)文库DNA浓度的qPCR定量标准品。tt
本发明的qPCR定量标准品为含有一段长度为260bp左右DNA片段的无核酸酶溶液。tt
本发明的qPCR定量标准品的DNA片段两端含有测序的接头序列，与文库DNA特征相同。tt
本发明的qPCR定量标准品涉及文库DNA定量标准曲线的建立。tt
本发明qPCR定量标准品制备方法：tt
(1)接头序列与引物合成：合成接头序列双链AdapterS1和AdapterS2，并在接头序列上tt设计qPCR扩增的引物对NIPT-LibraryF与NIPT-LibraryR，如下：tt
AdapterS1：tt
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3′(+)tt
3′-C*C*C*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5′(-)tt
AdapterS2：tt
5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′(+)tt
3′-C*C*C*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5′(-)tt
NIPT-LibraryF：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3’tt
NIPT-LibraryR：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’tt
(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备：提取人类基因组DNA，将其物理超声(条件：频tt率0.5min超声/0.5min冷却停止，15min/循环，3个循环)打断为160bp～200bp的DNA片段；利tt用T4DNA连接酶将AdapterS1和AdapterS2序列与160bp～200bp的DNA片段进行连接后，ttE-Gel胶回收260bp片段；tt
(3)文库扩增与纯化：利用NIPT-LibraryF、NIPT-LibraryR引物与高保真DNA聚合酶扩tt增步骤(2)中回收的DNA片段，反应程序为：98℃2min，98℃15s，62℃15s，70℃1min，tt共10个循环，70℃延长5min；继而利用磁珠纯化得到的DNA片段并溶解于无核酸酶水中；tt
(4)制作文库标准曲线：利用Qubit2.0定量构建好的文库标准品在测序仪上检测，得到ttReads数大于80M后再进行10倍梯度的稀释，进行qPCR检测，得到Ct值并建立标准曲线；tt
(5)样本检测：待检样本的文库DNA通过文库标准曲线进行浓度确定后用测序仪检测，tt增加样本之间数据量的均匀性。tt
本发明的qPCR标准品为白色透明的DNA溶液，具有稳定、易保存和不危害操作者健康的tt优点，同时qPCR标准品制备瓶间差变异系数较小，这说明本发明的使用，可以用于胎儿染色tt体疾病的产前无创筛查和诊断。tt
本发明能够有效的避免同一批次文库DNA浓度的检测结果出现偏差，为增加21三体、18tt三体和13三体无创产前检测样本之间的均一性和检测效率提供了保证。tt
附图说明tt
图1显示建立的qPCR定量标准品的Agilent2100Bioanalyzer分析长度分布图谱。tt
图2显示qPCR定量标准品利用胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检测试剂盒tt(半导体测序法)上机的图谱。tt
图3显示qPCR定量标准品的扩增曲线图谱。tt
图4显示qPCR定量标准曲线。tt
图5显示qPCR定量溶解曲线。tt
图6显示同批文库的qPCR定量浓度与Qubit定量浓度的比较。tt
图7显示同批文库通过qPCR定量与Qubit定量后上机测序得到的DNAReads数比较。tt
具体实施方式tt
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若为特殊tt指明，均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。以tt下实施例中的qPCR定量实验，均设置三次重复试验，结果取平均值。tt
实施例1：标准品的制备tt
一、接头序列及引物设计合成tt
设计与人类基因组尽量不一致的序列，按照GC含量与引物设计原则，得到以下接头序列。tt为防止接头序列反方向与目的片段连接，3’端设置粘性末端，为防止粘性末端降解对突出的Ctt进行修饰，*代表接头的负链3’端碱基C通过硫代磷酸化修饰；另5’两端经过去磷酸化修饰，tt为防止接头序列本身平末端出发生连接现象，综合以上因素合成以下接头序列双链AdapterS1tt和AdapterS2：tt
AdapterS1：tt
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3′tt
3′-C*C*C*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5′tt
AdapterS2：tt
5′-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′tt
3′-C*C*C*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5′tt
设计引物，在接头序列上设计QPCR扩增的引物序列，引物的Tm值为60℃。tt
NIPT-LibraryF：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3’tt
NIPT-LibraryR：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’tt
由引物NIPT-LibraryF与引物NIPT-LibraryR组成的引物对，可以扩增的靶序列为连接上接tt头的DNA文库，用于血浆游离DNA文库的扩增与定量，靶序列长度为260bp左右。tt
二、标准品的制备tt
1.提取人类基因组DNA，利用BioruptorCD-200TSSonicationSystem将DNA进行3个循tt环，每个循环15min物理超声打断，打断频率为0.5min超声/0.5min冷却停止，打断的主要长度tt为160bp～200bp模拟胎儿游离DNA的长度。tt
2.利用T4DNA连接酶将AdapterS1和AdapterS2序列与回收后的180bp片段进行连接，由tt于AdapterS1和AdapterS2的5’端进行了去磷酸化修饰，避免了接头自身发生连接的情况。tt
3.得到的连接产物DNA片段进行E-Gel胶回收，回收260bp左右条带。tt
4.利用NIPT-LibraryF、NIPT-LibraryR引物与PhusionDNAPolymerase(ThermoScientific)tt扩增连接后的DNA片段。tt
20μL反应体系：5×PhusionHFbuffer4μL，10mMdNTPs0.4μL，ttPhusionDNAPolymerase2U，NIPT-LibraryF与NIPT-LibraryR(10μM)各1μL，DNA模板tt40ng。tt
反应程序为：98℃2min，98℃15s，62℃15s，70℃1min，共10个循环，70℃延长5min。tt
5.利用磁珠纯化方法去除反应过程中加入的酶及引物等，对目的DNA进行纯化。tt
6.Agilent2100Bioanalyzer分析文库的片段分布见图1，主峰为260bp。用Qubit2.0分析ttDNA文库的浓度。tt
表1.qPCR定量标准品的Qubit浓度tt
三、标准品的高通量测序结果tt
1.采用步骤二建立的标准品进行模板制备、模板富集与上机测序，操作按照21三体、18tt三体、13三体检测试剂盒(半导体测序法)说明书进行，使用仪器主要是DA8600及配套仪器。tt
2.测序结果如图2所示，loading率(即芯片微孔中DNA阳性磁珠的覆盖率)为87％，DNAttReads数为87.12M，而总的reads数达到80M即可说明利用该浓度上机测序是合适的，而该标准tt品测序后总reads越高，以此标准品检测其他样本，每个样本的reads数也越高，越能满足要求。tt以此浓度为标准能满足各样本都能达到3.5MUniqueReads而可以给出报告。tt
实施例2：标准品的使用方法及标准曲线的建立tt
一、稀释方法tt
将得到的文库按照下列计算方法进行稀释，首次稀释至100pMtt
660(Da)为DNA一个碱基对的相对分子质量。tt
将100pM的文库依次稀释10倍，得到10pM、1pM、0.1pM、0.01pM与0.001pM的文库。tt
二、实验方法tt
将步骤1得到的6个文库稀释液进行实时荧光定量PCR。采用KAPASYBRFASTUniversalttqPCRkit试剂盒进行分析。tt
qPCR反应体系：20μL混合液中含有模板4μL，2×SYBRmix10μL，引物NIPT-LibraryF与tt引物NIPT-LibraryR各1μL(10μM)，NucleaseFreeWater4μL。tt
qPCR反应程序：95℃预变性5min，40个循环的95℃变性30s、60℃退火延伸共45s。tt
溶解曲线过程：95℃变性1min，60℃退火30s，升高至95℃过程中速度为0.5℃/s并连续采tt集荧光。tt
三、结果分析tt
扩增曲线见图3，扩增曲线呈平滑的S型曲线。tt
标准曲线见图4。标准曲线方程为y＝-3.4361gx+13.93，R2＝0.999，y代表临界循环数，x代tt表DNA文库浓度(pM)量。最低检测限为0.001pM，定量区间为0.001pM-100pM，扩增效率tt为98.885％。tt
溶解曲线见图5，由于标准品正反引物间序列非单一，因此未出现单一峰。tt
实施例3：qPCR定量标准品检测的重复性tt
将制备好的100pM标准品与其他6个稀释度的标准品反复冻融8次同时进行qPCR检测，得tt到的循环数CT值见表2，得知反复冻融8次各稀释度的标准品变异系数＜5.00％，相对较小，tt可以配套21三体18三体13三体检测试剂盒(半导体测序法)(8次RUN)使用。tt
表2.反复冻融8次的结果tt
实施例4：文库定量标准品在胎儿游离DNA文库定量中的应用tt
一、待测文库DNA的制备tt
提取16例血浆游离DNA样本，利用21三体18三体13三体检测(半导体测序法)进行文库tt构建，利用Qubit2.0检测文库的浓度。tt
二、稀释文库DNAtt
将得到的文库DNA按照实施例2的公式稀释至10pM(Qubit方法的浓度)进行qPCR检测，tt通过标准曲线得出文库DNA的浓度，与Qubit2.0直接检测到的浓度比较见图6。tt
三、上机检测tt
将得到的文库DNA按照qPCR定量方法与Qubit定量方法分别稀释至100pM进行均匀混合tttttt后上机测序，得到的Reads数见图7。一般情况下得到的某个样本最高reads数与最低reads数相tt差两倍以上则会有样本因数据量不足而需要重新检测。根据图7显示，qPCR定量文库上机得tt到的DNAReads数比Qubit定量得到的更均匀，16个样本均在4M-6M之间，UniqueReads都能tt达到3.5M，可以满足给出报告的要求；而利用Qubit方法定量得到每个样本的reads最高＞8Mttreads，最低的只有2Mreads，相差近4倍，样本11和样本16则需重测。tt
以上实施例1～4涉及到的血浆游离DNA提取根据金麦格血浆游离DNA提取试剂盒进行。tt具体为：tt
1.取600μL血浆加入30μLProteinaseK、12μLAcrylCarrier、900μLLysisbuffer、60μLtt磁珠，室温下颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。将反应EP管置于磁力架上4min，tt待磁珠吸附完全后，吸出液体。tt
2.WashBufferI清洗：加入500μLWashBufferI，重悬磁珠，置于磁力架上4min，待磁tt珠吸附完全后，吸出液体，取下EP管。tt
3.WashBufferII清洗：加入500μLWashBufferII，重悬磁珠，置于磁力架上4min，待tt磁珠吸附完全后，吸出液体，EP管仍置于磁力架上，使磁珠继续吸附。tt
4.WashBufferIII清洗：轻柔地加入550μLWashBufferIII，30s后吸出液体，取下EP管。tt
5.晾干磁珠：将EP管短暂离心。将EP管置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，吸出残留tt溶液，晾干2min使管内的液体挥发干净。tt
6.洗脱DNA：加33μLEBbuffer于EP管内，重悬磁珠，55℃孵育5min。tt
7.回收DNA样品：将EP管置于磁力架上4min，待磁珠吸附完全后，将上清溶液吸出tt于新的EP管中(约32μL)。tt
虽然，上述中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明tt基础上，可以做一些修改和改进，这对本领域技术而言是显而易见的。因此，在不偏离本发tt明精神的基础所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。tt
