简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒
技术领域tt
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种可适用于石蜡包埋样本等低质tt量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。tt
背景技术tt
DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表tt明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发tt育以及人类肿瘤发生等起着至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对ttDNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA甲基化检测的金标准全基因组重tt亚硫酸盐测序WGBS或BS-Seq(Wholegenomebisulfatesequencing)[1]，能tt够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏度。tt然而，正是由于BS-Seq能够对全基因组甲基化检测，也导致了测序深度高、tt测序费用高等弊端。tt
2005年AlexanderMeissner等[2]在NucleicAcidsResearch首次提出简化tt的表观重亚硫酸氢盐测序技术(RRBS，ReducedRepresentationBisulfitettSequencing)，该方法通过MspI酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行ttBisulfite测序，同时实现CpG位点的单碱基精度检测的高分辨率和测序数据tt的高利用率。RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法，可以实现多个样tt本的比对基因组分析，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。tt
目前，RRBS测序技术主要用于人和小鼠，需要2-5ug基因组DNA起tt始构建文库。传统的RRBS文库构建方法如下：tt
(1)gDNA酶切：2～5μg基因组DNA起始量，采用MspI酶切gDNA，ttQIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；tt
(2)末端修复：以dNTP为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多tt核苷酸激酶和Klenow片段对酶切后的粘性末端修复成平末端，QIA-quickttPCRPurificationKit过膜纯化；tt
(3)加“A”：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow片段(3'-5'exo-)tt为平末端3'端加A，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；tt
(4)加“甲基化接头”：采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接tt在含A的DNA片段两端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；tt
(5)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收150-325bp范围内的片段，ttQIA-quickGelExtractionKit进行胶纯化回收；tt
(6)重亚硫酸氢盐处理：加入一定比例λ-DNA至胶回收产物作为对照，tt采用EZDNAMethylation-GoldKit对胶回收产物进行Bisulfite反应；tt
(7)PCR扩增：采用KAPAHiFiHotStartUracil+ReadyMix对Bisulfitett产物进行PCR扩增，扩增产物Ampure磁珠纯化，文库构建完成；tt
(8)文库质控：对文库进行2100峰图和QPCR质控，合格后高通量测tt序；tt
(9)上机测序：根据需求选择测序策略和测序数据量。tt
RRBS测序技术的高性价比赢得了科研工作者的青睐，特别在多样本分tt析方面得到广泛的应用，取得了较好的成效。然而，在实际应用过程中，RRBStt也显示出一定的局限性，存在的主要问题是：tt
(1)对于石蜡包埋样本或其他低质量样本，数据浪费严重，数据利用tt率低；tt
(2)RRBS建库一般要求起始样本的gDNA量为2～5μg，这使得珍贵tt的(一般而言都是少量的)临床样本，很难达到建库起始量的要求。tt
参考文献tt
[1]Li,N.,etal.,WholegenomeDNAmethylationanalysisbasedonhighttthroughputsequencingtechnology.Methods.2010.52(3):p.203-12.tt
[2]AlexanderMeissner,AndreasGnirke,GeorgeW.Bell,etal.Reducedttrepresentationbisulfitesequencingforcomparativehigh-resolutionDNAttmethylationanalysis.NucleicAcidsResearch.2005,33(18):5868-5877.tt
发明内容tt
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够适用tt于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构tt建方法及建库试剂盒。tt
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在末端修复tt步骤中使用dCTP、dGTP与dATP的适当比例的混合物代替传统的dNTP提tt供单脱氧核糖核苷酸、且将末端修复步骤与加A步骤合并进行，可是实现适tt用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的tt构建方法，从而完成了本发明。tt
即，本发明包括：tt
1.一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：tt
步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；tt
步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的ttDNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提tt供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为tt1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；tt
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接tt头的DNA片段；tt
步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得tt到重亚硫酸氢盐处理产物；tt
步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产tt物；tt
步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。tt
2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA的量为tt50～500ng。tt
3.根据项1或2所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA来自tt于低质量样本。tt
4.根据项3所述的方法，其中，所述低质量样本是石蜡包埋样本。tt
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中的所述混合tt物中，dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:9～1:1:11。tt
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中采用包含所tt述酶切产物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液tt的反应体系，进行末端修复及3'端加A；tt
反应条件为30～50℃、0.5～12小时。tt
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，所述步骤C中采用包含所tt述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接tt酶的反应体系，进行加甲基化接头；tt
反应条件为10～30℃、0.5～5小时。tt
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之tt间、步骤B与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化tt步骤。tt
9.一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒，其用于tt实施项1～8中任一项所述的方法，其包括：tt
用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTPtt与dATP的混合物，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，tt且该混合物中不包含dTTP。tt
10.根据项9所述的试剂盒，其还包括选自下组中的至少一种或全部：tt
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂；tt
用于所述3'端加A的试剂；tt
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂；tt
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂；tt
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂；和tt
用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂。tt
发明效果tt
根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重tt亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。tt
附图说明tt
图1为100ng起始量的传统的RRBS建库流程文库RRCS140069-1-52检测tt结果。tt
图2为100ng起始量的本发明的RRBS建库流程文库RRCS140071-1-55检tt测结果。tt
发明的具体实施方式
首先，在一个方面中，本发明提供一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用tt文库的构建方法(本发明的方法)，该方法包括：tt
步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；tt
步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的ttDNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提tt供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为tt1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；tt
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接tt头的DNA片段；tt
步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得tt到重亚硫酸氢盐处理产物；tt
步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产tt物；tt
步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。tt
在本发明的方法中，所述步骤A中的基因组DNA(gDNA)的量可以tt为50-500ng。而且，基因组DNA可以来自于低质量样本，这里低质量样本tt是指其中的基因组DNA已经发生了相当程度的降解的样本，例如石蜡包埋tt样本(FFPE)。tt
本发明人经过深入研究发现，传统的RRBS建库方法不适用于低质量样tt本的原因主要有以下两点：tt
1.传统的RRBS建库中，末端修复采用dNTPs(dCTP、dGTP、dTTPtt与dATP的混合物)提供单核苷酸，而降解后的样本gDNA中存在许多降解tt本身产生的片段，这些片段能够像酶切片段一样被修复补平，从而作为待测tt序片段进入到最终的文库中。在非CG岛区域，降解后的片段通常不含CGtt位点，因而这降低了测序数据的利用率，造成数据浪费；tt
2.传统的RRBS建库中，纯化环节较多，而每次纯化均有损失；同时tt传统的RRBS建库中片段筛选得到的产物量极低，约在10ng左右，在胶回tt收过程中极其容易丢失，导致建库失败的风险。tt
针对上述问题点，本发明人对传统的RRBS建库方法进行了如下改进：tt
1.对于传统的RRBS建库中dNTP容易引物降解片段末端补平，采用ttdCTP和dGTP两种底物进行末端修复，因为MspI酶切后产生的粘性末端为ttCG两个碱基，dCTP和dGTP补平酶切产生的末端不平，能够降低降解片段tt的补平比例。tt
2.对于传统的RRBS建库中纯化步骤较多的问题，采用末端修复和加“A”tt反应合并进行的策略。同时，为了避免加“A”反应中末端加入过多的C和G，tt使用dCTP：dGTP：dATP为适当摩尔比的混合物(无dTTP)进行末端修复tt和加“A”合并反应，以此省去末端修复后的纯化过程；同时也可对加“A”后的tt反应产物不做纯化处理，直接进行加“甲基化接头”的连接反应。此外，采用tt先PCR扩增再片段筛选的策略，降低建库失败的风险。tt
3.此外，由于本发明的方法中省略了多个纯化步骤，可能会导致甲基化tt接头连接效率低。本发明的方法中采用适度延长连接反应时间的方法来提高tt连接效率。tt
所述步骤B中的所述混合物中，dCTP：dGTP：dATP的摩尔比优选tt1:1:9～1:1:11，更优选为1:1:10。该摩尔比对本发明的方法而言是至关重要的。tt所述步骤B中采用包含所述前一步的酶切产物、缺失外切酶活性的Klenowtt片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修复及3'端加A，tt这意味着步骤B的反应体系中不包含dTTP。除了使用所述混合物代替dNTPtt之外，该反应体系可以包含传统RRBS建库方法中用于末端修复和3'端加Att的那些试剂。tt
所述步骤B的反应条件可以为30～50℃，0.5～12小时。tt
所述步骤C中可以采用包含所述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲tt液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化接头，该反tt应体系可以与传统RRBS建库方法中用于加甲基化接头的反应体系相同。但，tt反应条件需适当优化，以使连接反应进行得更加充分，例如可以为10～30℃tt(优选20℃)、0.5～5小时。tt
步骤D、步骤E和步骤F均可以采用传统RRBS建库中用于该步骤的方tt法或试剂来进行。需要说明的是，传统的RRBS建库中依次进行片段筛选、tt重亚硫酸氢盐处理和PCR扩增。tt
优选地，本发明的方法中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步tt骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。所述纯化tt步骤可以采用传统RRBS建库中用于该产物的纯化的方法、试剂或装置来进tt行。tt
在另一个方面中，本发明还提供一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐tt测序用文库的试剂盒(本发明的试剂盒)，其可用于实施本发明的方法。tt
本发明的试剂盒必须包含用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该tt试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合物，该混合物中dCTP：dGTP：dATPtt的摩尔比为1:1:10～1:1:20、优选1:1:9～1:1:11、更优选1:1:10，且该混合物中tt不包含dTTP。tt
优选地，本发明的试剂盒还可以包括选自下组中的至少一种或全部：tt
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂，例如MspItt酶及相应的酶切反应缓冲液等；tt
用于所述3'端加A的试剂，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应tt的反应缓冲液等，可以与所述的用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂相tt同；tt
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂，例如甲基化接tt头、T4DNA连接酶及相应的连接反应缓冲液；tt
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂，tt例如EZDNAMethylation-GoldKit(Zymo公司产品)等；tt
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂，例如KAPAHiFittHotStartUracil+ReadyMix、Ann公共引物、Index引物等；tt
用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂，例如QIA-quickGelttExtractionKit(Qiagen公司产品)等。tt
除了采用所述混合物代替dNTPs以外，本发明的试剂盒中所包含的试tt剂、装置等可以与用于传统的RRBS建库方法的试剂盒中包含的那些相同。tt
实施例tt
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的tt实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。tt
以石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，分别采用传统的RRBS建tt库流程和本发明的RRBS建库流程构建文库，文库构建、文库质控和信息分tt析结果如下。tt
7.1文库构建tt
以同一份石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，构建的两个RRBStt文库的相关参数如下表：tt
7.1.1传统的RRBS建库流程tt
(1)MspI酶切：100ng起始量建库，按照下表反应体系进行酶切，37℃tt酶切6小时；tt
酶切产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，75.0μLEB洗脱。tt
(2)末端修复和加A：按照下表反应体系进行末端修复，条件20℃tt反应30分钟；tt
产物过膜纯化，32.0μLEB洗脱。tt
(3)加“甲基化接头”反应：按照下表反应体系进行加接头反应，条件tt20℃反应15分钟；tt
加接头反应产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，30.0μLEBtt洗脱。tt
(4)片段筛选：2％琼脂糖凝胶电泳回收150～325bp文库，QIA-quickGelttExtractionKit进行胶纯化回收，20μLddH2O洗脱。tt
(5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMethylation-GoldKit对上步产tt物进行重亚硫酸氢盐处理，34μLEB洗脱。tt
(6)PCR扩增：按下表体系进行反应，扩增条件为95℃5分钟；98℃tt30秒，(98℃10秒，62℃30秒，72℃30秒)12cycles；72℃5分钟，4℃tt保存；tt
反应产物用1.8倍Ampure磁珠纯化，30μLEB洗脱。tt
(7)至此，传统的RRBS建库流程文库构建完毕，共需要3天完成整tt个文库构建，文库命名为RRCS140069-1-52。tt
7.12本发明的RRBS建库流程tt
(1)MspI酶切：100ng起始建库，按照下表反应体系进行酶切，37℃tt酶切6小时；tt
酶切产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，16.0μLEB洗脱。tt
(2)末端修复和加“A”：按下表体系进行反应，条件为37℃反应1小tt时；tt
反应产物不纯化，直接进行加“甲基化接头”反应。tt
备注：dNTP(无dTTP)中不含有dTTP，只有dCTP、dGTP和dATPtt三种，并且dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:10。tt
(3)加“甲基化接头”：按下表体系进行反应，条件为20℃反应1小时；tt
反应产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，20μLddH2O洗脱。tt
(4)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMethylation-GoldKit对上步产tt物进行重亚硫酸氢盐处理，17.0μLEB洗脱。tt
(5)PCR扩增：按下表体系进行反应，扩增条件为98℃2分钟；(98℃tt20秒，60℃30秒，72℃1分钟)15cycles；72℃5分钟，4℃保存；tt
反应产物用1.8倍Ampure磁珠纯化，30μLEB洗脱。tt
(6)片段筛选：2％琼脂糖凝胶电泳回收150～325bp文库，QIA-quickttGelExtractionKit进行胶纯化回收，15μLEB洗脱。tt
(7)至此，本发明的RRBS建库流程文库构建完毕，共需要2天完成tt整个文库构建，文库命名为RRCS140071-1-55。tt
7.2文库质控tt
将7.1中构建完成的两个RRBS文库用安捷伦2100生物分析仪进行质检，tt图谱如下。图1为100ng起始量的传统的RRBS建库流程文库ttRRCS140069-1-52检测结果，图2为100ng起始量的本发明的RRBS建库流tt程文库RRCS140071-1-55检测结果。tt
由2100检测图可看出，图2中150～300bp之间存在RRBS文库2100tt峰图最常见的两个尖峰，但是图1中150～300bp之间只存在RRBS文库2100tt峰图最常见的一个尖峰。说明针对起始量低的FFPE样本来说，改进后的ttRRBS建库流程构建的文库片段分布与标准的RRBS建库流程文库一致，文tt库质控合格；但是如果采用传统的RRBS建库流程，针对FFPE样本构建出tt的文库则丢失掉了一大部分的信息。从文库质检的结果上表明我们发明的ttRRBS建库的方法更适合于微量低质量的样本。tt
7.3信息分析tt
对传统方法构建的RRBS文库RRCS140069-1-52和本发明的RRBS文库ttRRCS140071-1-55进行SE50测序，对数据进行过滤比对后，所得到的数据tt质控结果如表1。tt
表1两种RRBS建库流程文库信息质控结果tt
由表1可看出，100ng起始量的DNA采用传统方法做出的结果在ttEnzymeCuttingRate(％)、CleanQ30BasesRate(％)、UniqueMappedRatett(％)等参数都差于我们发明的方法做出的结果。另外，同样100ng起始量tt采用我们发明的方法构建文库的5mC假阳性率比传统方法构建文库降低约tt1/2，使得测序结果更符合CG位点中C的真实甲基化状态。tt
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本tt说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征tt的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发tt明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也tt可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况tt下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。tt
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发tt明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用tt于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上tt述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动tt和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范tt围内。tt
工业实用性
根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重tt亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。tt
