DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法
技术领域
本发明涉及一种DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，属于基因测序领域。
背景技术
DNA不仅由胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤四种碱基组合而成。5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶是DNA中的重要修饰修饰碱基是DNA上的第五种与第六种碱基。他们是调控生物通路，细胞生命周期的重要标记，起到多重的生物功能，包括转录调控，转座子沉默，基因印记和X染色体失活等。在多种疾病特别是癌症等重大疾病中呈现特定的基因组分布，在受精发育初期过程中呈现明显的分布变化，被认为可能参与与标记了这些过程。所以利用测序技术全面了解这一过程显得尤为重要。
由于这类5位修饰的胞嘧啶物理化学性质接近，不能直接利用现有的一代或二代测序技术进行检测。一类常用的方法是将DNA打断成片段，再将5位修饰的胞嘧啶特异性结合，从而特异性地富集含有5位修饰的胞嘧啶的DNA片段。通过对富集后的片段的测序，可以得到5位修饰的胞嘧啶在基因组上的分布信息，并藉由此信息进行各类定性、半定量、定量生物信息学分析。此类方法的优点是测序深度要求低，成本低，覆盖性好。其中普遍使用的富集手段有两类，一类是特异性抗体捕获，另一类是特异性的化学生物学标记捕获。两类手段均可给出重复性好的结果，其中抗体较为昂贵，捕获的位点序列要求较高，对修饰碱基分布稀疏的序列结合性差，可能引入歧视误差。而特异性的化学生物学标记可能会因为化学生物反应的选择性优化不完全导致脱靶副产物，从而引入背景。由于是富集过程，大量的不含5位修饰胞嘧啶的DNA片段在过程中被弃去，导致在测序应用中，两者均需要大量的DNA作为起始。这类传统的测序方法一般只能就1微克以上的DNA作为起始样品量进行测序。在实际的生物、医疗应用中，往往只能得到1微克以下，甚至1-10纳克的DNA样品，对于此类样品的检测方法将直接获取有生物与临床价值的基因调控信息，因而在生物临床研发与检测中有着重大意义。
根据上文分析，现有富集手段未获得重大突破的原因有三：一是富集后的DNA过少，在测序文库建立过程中损失太大。传统建立文库的流程中涉及到了多步反应纯化，小量DNA的纯化效率低下；二是富集方法在低浓度的DNA上的效率下降，使用抗体富集时，结合效率直接与抗原浓度相关，现报导的的抗原-抗体的结合能力不能满足极低的DNA浓度下的反应；三是富集后的DNA不能有效地从固相洗脱，固相负载的DNA在富集过程中只占原始DNA的5％以内。洗脱的过程中涉及的纯化或化学反应会极大的损失固相负载的DNA片段，造成后续PCR反应失败或引入大量测序误差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，以提高含有5位修饰胞嘧啶的测序效率。
本发明采用了如下技术方案：
一种DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DNA的提纯与片段化预处理：
将目的DNA提取后使用机械力或消化酶将其打断至平均50个核苷酸长度到10000个核苷酸长度的片段；
(2)微量DNA的修复与接头引物连接：
将预处理的DNA片段修复并与二代测序需要的测序接头引物连接；
(3)共价标记5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶：
将连接好接头引物的DNA片段中的5位修饰的胞嘧啶进行共价标记；
(4)固相富集含有标记的5位修饰胞嘧啶的DNA片段：
将标记的5位修饰的胞嘧啶的DNA片段在结合缓冲液中结合到固相上，对固相表面进行反复洗涤，去除未结合的DNA片段，
在固相上，用对应接头引物的PCR扩增引物进行扩增。取得的PCR产物，经纯化后即得到二代测序所需的基因组5位修饰胞嘧啶的分布图谱。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤(1)中，所述DNA片段来源于体液中游离的DNA片段；或提纯于组织、细胞及细胞器的完整的基因组DNA。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：步骤(1)中，DNA片段的体液来自于血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等人体体液。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：其中，上述步骤(2)中的DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA的5’及3’补齐成平末端。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：步骤(3)中，标记的方法包括步骤：i)利用转糖酶将带有叠氮基团修饰的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，ii)将直接或间接连有生物素的点击化学底物与叠氮糖修饰的5-羟甲基胞嘧啶反应。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：所述转糖酶包括但不限于T4bacteriophageenzymeβ-glucosyltransferase(T4噬菌体β-葡糖基转移酶)、T4bacteriophageenzymeα-glucosyltransferase(T4噬菌体α-葡糖基转移酶)及其衍生物，类似物，或重组酶；叠氮基团修饰的糖包括但不限于6-N3-葡萄糖或其他叠氮修饰的糖类。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：标记甲基胞嘧啶的步骤为i)利用鼠Tet氧化酶或其衍生物、类似物、重组酶将甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶ii)同上文所述将5-羟甲基胞嘧啶进行生物素标记。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：其中，5-羟甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的标记步骤可以按顺序进行也可以在一个反应中同时进行。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤(4)中，固相材料包括直径1nm至100um的磁性小球，直径1nm至100um的琼脂糖小球，直径1nm至100um的人工高分子小球，带有表面修饰的硅片或其他生物芯片。
进一步，本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法，还可以具有这样的特征：在步骤(5)中，在固相上扩增采用直接在固相上经1-40个PCR循环扩增得到合格的测序文库，或经1-40个PCR循环扩增后分离固液相再经1-40个PCR循环扩增得到合格的测序文库。
上述步骤(1)中，DNA片段的体液来源指来自于又不限于血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等人体体液。
上述步骤(1)中，组织、细胞及细胞器指来自于又不限于活体组织、培养细胞、脱落细胞、血液循环细胞、手术中冲洗下的细胞等。
上述步骤(1)中，提DNA片段或完整的基因组DNA的方法包括常用的纯化方法或商业化的纯化试剂盒。方法中包括但不受限于：使用氯仿-苯酚萃取，ProteinaseK消解，硅胶膜离心柱法，磁珠法，乙醇、异丙醇沉淀等技术中的一项或多项组合。纯化试剂盒包括但不受限于：QIAampfastDNAtissuekit(Qiagen),ZRGenomicDNA-TissueKits(Zymo)。
上述步骤(1)中，机械力包括但不限于剧烈震荡、超声等技术。消化酶包括但不限于NEBNextdsDNAFragmentase(NEB)。
上述步骤(2)中的DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA双链的5’及3’补齐成平末端。DNA的片段与测序接头引物的连接方法包括但不限于：i)平末端连接；ii)在DNA片段的3’端末尾增加一至多个dA，利用接头引物中相对应的dT进行连接。修复与连接中涉及的酶包括但不限于T4polymerase,T4Kinase,Klenowexo-中的一种或其组合。修复与连接也可以使用商业化的试剂盒，包括但不限于TruSeqNanoDNALibraryPrepKit(Illumina),KapaHyperPrepKit(Kapa)，
上述步骤(3)中，使用的化学生物学标记方法指：标记5-羟甲基胞嘧啶的步骤为i)利用转糖酶将带有叠氮基团修饰的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，见下面反应式，连接底物为UDP-6-N3-Glucose。
5-羟甲基胞嘧啶共价标记反应
转糖酶包括但不限于T4bacteriophageenzymeβ-glucosyltransferase、T4bacteriophageenzymeα-glucosyltransferase及其衍生物，类似物，或重组酶。叠氮基团修饰的糖包括但不限于6-N3-葡萄糖或其他化学修饰包括但不限于羰基，巯基，羟基，羧基，碳-碳双键，碳-碳三键，二硫键，胺基，酰胺基，双烯)的糖类。ii)将直接或间接连有生物素(biotin)的点击化学底物或相应的化学反应底物与叠氮糖修饰的或者其它化学修饰的5-羟甲基胞嘧啶反应。
反应基团包括但不限于以下含三键的化合物：
间接连接生物素的化学基团及反应包括但不限于：羰基，巯基，羟基，羧基，碳-碳双键，碳-碳三键，二硫键，胺基，酰胺基，双烯。
标记甲基胞嘧啶的步骤为i)利用利用转糖酶将不带有下一步反应修饰基团修饰的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，用于掩蔽相对于5-甲基胞嘧啶含量较低的5-羟甲基胞嘧啶ii)利用ten-eleventranslocation(TET)氧化酶或其衍生物、类似物、重组酶将5-甲基胞嘧啶
氧化为5-羟甲基胞嘧啶(见5-甲基胞嘧啶氧化反应的反应式)同上文所述将5-羟甲基胞嘧啶进行生物素标记。
上述5-羟甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的标记步骤可以按顺序进行也可以在一个反应中同时进行。
上述步骤(4)中，所使用的固相为直接负载有亲和素或利用化学生物学方法间接负载亲和素的固相，固相材料包括但不限于直径1nm至100um的磁性小球，直径1nm至100um的琼脂糖小球，直径1nm至100um的人工高分子小球，带有表面修饰的硅片或其他生物芯片。
上述步骤(4)中，所使用的结合液及洗涤液是包含缓冲对如Tris-HCl，MOPS，HEPES(pH＝6.0-10.0，浓度在1mM到1M之间)；NaCl(0-2M)；表面活性剂如Tween20(0.01％-5％)的缓冲液。
上述步骤(5)中，在固相上扩增，包括i)直接在固相上经1-40个PCR循环扩增得到合格的测序文库，ii)经1-40个PCR循环扩增后分离固液相再经1-40个PCR循环扩增得到合格的测序文库，iii)将DNA片段从固相洗脱后经1-40个PCR循环扩增得到合格的测序文库。
上述步骤(1)-(5)中，各反应后的核酸纯化步骤，可以使用常用的纯化方法或商业化的纯化试剂盒。方法中包括但不受限于：硅胶膜离心柱法，磁珠法，乙醇、异丙醇沉淀等技术中的一项或多项组合。纯化试剂盒包括但不受限于：AmpureXPbeads,MinelutePCRpurificationKit(Qiagen)，DNAClean&Concentrator(Zymo)。
发明的有益效果
本发明的DNA5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法与现有技术相比，由于采用了微量游离DNA二代测序建库技术及高效的化学生物学正交反应，从而极大增强了固相表面与DNA修饰碱基结合的选择性和效率。在1-100ngDNA的量级，传统的抗原抗体反应的结合效率不足以提供足够的选择性，使得相关应用只能停留在来源于培养细胞或组织的大量DNA样品。
本发明在共价连接的基础上，利用生物素与亲和素的高结合能力，进一步使用高盐及表面活性剂对未含有DNA修饰碱基的DNA片段进行洗涤，从而大大提高了保护效率。
附图说明
图1是实施例1-4中最终文库构建的电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式来说明本发明的具体实施方式。
实施例1血清游离DNA的5-甲基胞嘧啶测序文库建立
(1)DNA的提纯与片段化预处理：
用EDTA抗凝管取人体血液4mL，保存在4摄氏度。在6小时内，离心10min，离心速度2000g；再次离心10min，离心速度13000g。取得血浆并提取游离DNA。
(2)微量DNA的修复与接头引物连接，接头引物序列如下：
5’-p-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAACATCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGCCTAAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，*表示硫代。
将0.5-10ng游离DNA修复并并与二代测序需要的测序接头引物连接。DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA的5’及3’补齐成平末端。步骤如下：
1.根据KapaHyperPerpKit说明书将50uLDNA在PCR管中进行EndRepair&A-Tailing反应，
2.以下PCR程序加热反应
3.在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：
4.加入以下反应物：
5.按以下PCR程序加热反应
6.使用AmpureXPbeads对反应进行纯化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)及EDTA(0.1)的缓冲液进行洗脱。
(3)共价标记5-甲基胞嘧啶：
将连接好接头引物的DNA片段中的5位修饰的胞嘧啶进行共价标记；使用不含标记反应修饰基团的糖掩蔽天然存在的5-羟甲基胞嘧啶，使用鼠TET氧化酶将甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶，然后对5-羟甲基胞嘧啶进行生物素标记。
1.接上步的纯化DNA溶液配置标记反应：
加入DNA溶液中。在水浴上37度反应1小时。取出反应，用AmpureXPbeads纯化。
2.进行Tet氧化与叠氮糖标记反应：
37度反应1小时。用AmpureXPbeads纯化。
3.加入三键化合物
37度反应2小时，用AmpureXPbeads纯化。
(4)固相富集含有标记的5-甲基胞嘧啶的DNA片段：
1.将0.5uLC1streptadvinbeads(lifetechnology)涡旋混合30秒。
2.用100uL洗涤液(5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
3.加入DNA溶液等体积结合缓冲液(10mMTris，pH＝7.5，2MNaCl，0.04％Tween20或其他表面活性剂)至磁珠用枪吹打均匀。磁珠混合液加入纯化的标记hmCDNA溶液中，在旋转混合器上混合15min。
4.用100uL洗涤液5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
(5)PCR扩增纯化
1.按以下进行PCR反应，
2.反应循环温度如下：
用AmpureXPbeads纯化，得到最终测序文库(见图1)。
实施例2血清游离DNA的羟甲基胞嘧啶测序文库建立
(1)DNA的提纯与片段化预处理：
用EDTA抗凝管取人体血液4mL，保存在4摄氏度。在6小时内，离心10min，离心速度2000g；再次离心10min，离心速度13000g。取得血浆并提取游离DNA。
(2)微量DNA的修复与接头引物连接：
将0.5-10ng游离DNA修复并并与二代测序需要的测序接头引物连接。DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA的5’及3’补齐成平末端。步骤如下：
1.根据KapaHyperPerpKit说明书将50uLDNA在PCR管中进行EndRepair&A-Tailing反应，
2.以下PCR程序加热反应
3.在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：
4.加入以下反应物：
5.按以下PCR程序加热反应
6.使用AmpureXPbeads对反应进行纯化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)及EDTA(0.1mM)的缓冲液进行洗脱。
(3)共价标记5-羟甲基胞嘧啶：
37度反应1小时。用AmpureXPbeads纯化。
3.加入三键化合物
37度反应2小时，用AmpureXPbeads纯化。
(4)固相富集含有标记的5位修饰胞嘧啶的DNA片段：
1.将0.5uLC1streptadvinbeads(lifetechnology)涡旋混合30秒。
2.用100uL洗涤液(5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
3.加入DNA溶液等体积结合缓冲液(10mMTris，pH＝7.5，2MNaCl，0.04％Tween20或其他表面活性剂)至磁珠用枪吹打均匀。磁珠混合液加入纯化的标记hmCDNA溶液中，在旋转混合器上混合15min。
4.用100uL洗涤液5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
(6)PCR扩增纯化
3.按以下进行PCR反应，
4.反应循环温度如下：
用AmpureXPbeads纯化，得到测序文库，见图1。
实例3组织DNA的5-甲基胞嘧啶测序文库建立
(1)DNA的提纯与片段化预处理：
用ZRGenomicDNA-TissueKits(Zymo)提取组织基因组DNA。按以下KapaHyperPlusLibraryPreparationKit对0.5-100ng基因组DNA进行反应打断基因组DNA。
(2)微量DNA的修复与接头引物连接：
将片段化DNA修复并并与二代测序需要的测序接头引物连接。DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA的5’及3’补齐成平末端。步骤如下：
1.根据KapaHyperPLusLibraryPreparationKit说明书将50uLDNA在PCR管中进行EndRepair&A-Tailing反应，
2.以下PCR程序加热反应
3.在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：
4.加入以下反应物：
5.按以下PCR程序加热反应
6.使用AmpureXPbeads对反应进行纯化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)及EDTA(0.1)的缓冲液进行洗脱。
(3)共价标记5-甲基胞嘧啶：
将连接好接头引物的DNA片段中的5位修饰的胞嘧啶进行共价标记；使用不含标记反应修饰基团的糖掩蔽天然存在的5-羟甲基胞嘧啶，使用鼠TET氧化酶将甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶，然后对5-羟甲基胞嘧啶进行生物素标记。
1.接上步的纯化DNA溶液配置标记反应：
加入DNA溶液中。在水浴上37度反应1小时。取出反应，用AmpureXPbeads纯化。
2.进行Tet氧化与叠氮糖标记反应：
37度反应1小时。用AmpureXPbeads纯化。
3.加入三键化合物
37度反应2小时，用AmpureXPbeads纯化。
(4)固相富集含有标记的5-甲基胞嘧啶的DNA片段：
1.将0.5uLC1streptadvinbeads(lifetechnology)涡旋混合30秒。
2.用100uL洗涤液(5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
3.加入DNA溶液等体积结合缓冲液(10mMTris，pH＝7.5，2MNaCl，0.04％Tween20或其他表面活性剂)至磁珠用枪吹打均匀。磁珠混合液加入纯化的标记hmCDNA溶液中，在旋转混合器上混合15min。
4.用100uL洗涤液5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
(7)PCR扩增纯化
1.按以下进行PCR反应，
2.反应循环温度如下：
用AmpureXPbeads纯化，得到最终测序文库，见图1。
实例4组织DNA的5-羟甲基胞嘧啶测序文库建立
(1)DNA的提纯与片段化预处理：
用ZRGenomicDNA-TissueKits(Zymo)提取组织基因组DNA。按以下KapaHyperPlusLibraryPreparationKit对0.5-100ng基因组DNA进行反应打断基因组DNA。
(2)微量DNA的修复与接头引物连接：
将片段化DNA修复并并与二代测序需要的测序接头引物连接。DNA片段修复是指修复DNA片段中的碱基损坏，并将DNA的5’及3’补齐成平末端。步骤如下：
1.根据KapaHyperPerpKit说明书将50uLDNA在PCR管中进行EndRepair&A-Tailing反应，
2.以下PCR程序加热反应
3.在1.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：
4.加入以下反应物：
5.按以下PCR程序加热反应
6.使用AmpureXPbeads对反应进行纯化，用20uL含Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)及EDTA(0.1mM)的缓冲液进行洗脱。
(3)共价标记5-羟甲基胞嘧啶：
1.对纯化产物进行以下反应
37度反应1小时。用AmpureXPbeads纯化。
2.加入三键化合物
37度反应2小时，用AmpureXPbeads纯化。
(4)固相富集含有标记的5位修饰胞嘧啶的DNA片段：
1.将0.5uLC1streptadvinbeads(lifetechnology)涡旋混合30秒。
2.用100uL洗涤液(5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
3.加入DNA溶液等体积结合缓冲液(10mMTris，pH＝7.5，2MNaCl，0.04％Tween20或其他表面活性剂)至磁珠用枪吹打均匀。磁珠混合液加入纯化的标记hmCDNA溶液中，在旋转混合器上混合15min。
4.用100uL洗涤液5mMTris，pH＝7.5，1MNaCl，0.02％Tween20)洗涤磁珠3次。
(8)PCR扩增纯化
1.按以下进行PCR反应，
2.反应循环温度如下：
用AmpureXPbeads纯化，得到测序文库，见图1。
